Induktion und Analyse von oxidativem Stress in Dornröschen-Transposon-transfizierten menschlichen retinalen Pigmentepithelzellen

Das Wasserstoffperoxid-Modell ist ein einfacher und effektiver Ansatz zur Bewertung der antioxidativen Wirkung von Faktoren, die bei der Behandlung von altersbedingter Makuladegeneration oder ähnlichen neurodegenerativen Erkrankungen nützlich sein können. Das Oxidationsmittel Wasserstoffperoxid wird in einem einzigen Impuls verabreicht und ist daher schneller und einfacher durchzuführen als bei Modellen, bei denen die Wasserstoffperoxidbehandlung mehrere Tage lang wiederholt werden muss. Da die Anzahl der ausgesäten Zellen die oxidative Wirkung der Behandlung beeinflusst, ist es wichtig, die Zellen vor ihrer Kultur sorgfältig zu zählen.

Demonstriert wird das Verfahren von Thais Bascuas, einem Postdoktoranden aus dem Labor von Gabriele Thumann. Für die Herstellung des konditionierten Mediums wird 28 Tage nach der Transfektion mit PEDF, GM-CSF oder beidem die humanen ARPE-19-Zelllinien-T-75-Kolben aus 500.000 Zellen pro Milliliter vollständiger Mediumkonzentration ausgesät. Wenn die Zellen eine Konfluenz von etwa 80 % erreichen, ersetzen Sie den Überstand durch frisches vollständiges Medium und sammeln Sie den neuen Überstand nach 24 Stunden.

Um die Histidin-markierten GM-CSF- und PEDF-Proteine zu reinigen, zentrifugieren Sie den Überstand, um mögliche verbleibende Zellen zu eliminieren, und legen Sie die Probe beiseite. Geben Sie anschließend 30 Mikroliter Nickel-NTA-Lösung in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen. Entsorgen Sie nach dem Zentrifugieren den Nickel-NTA-Durchfluss und waschen Sie das Pellet zweimal mit 200 Mikrolitern 1X Inkubationspuffer pro Waschgang.

Nach dem zweiten Waschen wird das Pellet in 40 Mikrolitern 4X Inkubationspuffer und 900 Mikrolitern des zentrifugierten, konditionierten Mediums wieder suspendiert. Inkubieren Sie die konditionierte mittlere Lösung eine Stunde lang bei Raumtemperatur und 70 Umdrehungen pro Minute. Am Ende der Inkubation zentrifugieren Sie die Probe und waschen das Pellet zweimal mit 175 Mikrolitern 1x Inkubation pro Waschgang.

Nach dem zweiten Waschen fügen Sie 20 Mikroliter Elutionspuffer für eine 20-minütige Inkubation bei 70 Umdrehungen pro Minute bei Raumtemperatur hinzu. Am Ende der Inkubation zentrifugieren Sie die Probe. Legen Sie den Überstand beiseite und quantifizieren Sie das Gesamtprotein, das durch den BCA-Protein-Assay gemäß den Standardprotokollen eluiert wird.

Für die Behandlung von nicht transfizierten retinalen Pigmentepithelzellen mit konditioniertem Medium und Wasserstoffperoxid säen Sie 3000 Zellen in 200 Mikrolitern vollständigem Medium in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte für eine 24-stündige Inkubation im Zellkultur-Inkubator. Ersetzen Sie am nächsten Morgen die Überstände durch 200 Mikroliter konditioniertes Medium pro Vertiefung und stellen Sie die Zellen für 10 Tage in die Zellkultur-Inkubatoren zurück. Behandeln Sie die Zellen am 11. Tag der Kultur 24 Stunden lang mit 350-mikromolarem Wasserstoffperoxid in vollständigem Medium.

Für die Behandlung von nicht transfizierten RPE-Zellen mit gereinigtem oder kommerziellem PEDF und/oder GM-CSF werden 3000 Zellen in 200 Mikrolitern vollständigem Medium, ergänzt mit 500 Nanogramm pro Milliliter rekombinantem PEDF, und/oder 50 Nanogramm pro Milliliter rekombinantem GM-CSF pro Vertiefung für eine 48-stündige Inkubation im Zellkultur-Inkubator ausgesät. Am Ende der Inkubation werden die Überstände 24 Stunden lang durch vollständiges Medium ersetzt, das 350 mikromolare Wasserstoffperoxide und 500 Nanogramm pro Milliliter PEDF und/oder 50 Nanogramm pro Milliliter GM-CSF pro Vertiefung enthält. Für die Wasserstoffperoxid-Behandlung von transfizierten RPE-Zellen werden 5.000 transfizierte Zellen in 200 Mikrolitern vollständigem Medium pro Well für 24 Stunden im Zellkultur-Inkubator kultiviert, bevor die Zellen mit 350 mikromolaren Wasserstoffperoxid behandelt werden, wie gezeigt.

Zur Messung der Glutathionspiegel, die in transfizierten Zellen produziert werden, die PEDF und/oder GM-CSF überexprimieren, oder in nicht transfizierten Zellen, die nach einer Wasserstoffperoxidbehandlung mit Wachstumsfaktor vorbehandelt wurden, ersetzen Sie den Überstand in jeder Vertiefung durch 100 Mikroliter frisch zubereitete 1X-Reagenzienmischung pro Vertiefung und mischen Sie die Zellen mit einer Reagenzmischung für 14 Sekunden bei 500 Umdrehungen pro Minute auf einem Orbitalschüttler. Inkubieren Sie die Platte nach dem Schütteln 30 Minuten lang bei Raumtemperatur, bevor Sie 100 Mikroliter rekonstituiertes Luciferin-Nachweisreagenz in jede Vertiefung geben. Mischen Sie die Lösung 15 Sekunden lang auf dem Shaker, gefolgt von einer 15-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur.

Laden Sie die Platte am Ende der Inkubation in einen Plattenleser, und wählen Sie Layout ändern aus. Auf der Registerkarte "Grundlegende Parameter" sollten die 96-Well-Platte und die Top-Optik ausgewählt und die Positionierungsverzögerung auf 0,1, die Startzeit der Messung auf Null, die Zeit des Messintervalls auf eins und die Zeit bis zur Normalisierung der Ergebnisse auf Null eingestellt werden. Definieren Sie die Rohlinge, Standards und Proben, und klicken Sie auf Messung starten.

Exportieren Sie dann die Daten als Tabellenkalkulation und berechnen Sie die Glutathionkonzentration in jeder Probe durch Interpolation der Standardkurve. Um die Lebensfähigkeit der Zellen zu messen, ersetzen Sie den Überstand in jeder Vertiefung durch 100 Mikroliter vollständiges Medium, das mit 1 % FBS pro Vertiefung ergänzt wurde, und legen Sie die Zellen bis zur Analyse in den Zellkultur-Inkubator. Nachdem Sie unbehandelte ARPE-19-Zellen aus der Kultur entnommen haben, resuspendieren Sie die Zellen bei einer Menge von 100.000 Zellen pro Milliliter in DMEM Hams F-12 Medium, das mit einer Konzentration von 1 % FBS ergänzt wird.

Bereiten Sie als Nächstes sieben serielle 1:1-Verdünnungen in 200 Mikrolitern Medium vor, die mit 1 % FBS ergänzt sind, und übertragen Sie 100 Mikroliter jedes Standards in doppelter Ausführung in die entsprechenden Vertiefungen einer 96-Well-Platte. Geben Sie 50 Mikroliter frisch zubereitete Reagenzmischung in die gesamte Vertiefung und mischen Sie die Zellen mit der Mischung 15 Sekunden lang auf dem Shaker, bevor Sie die Platte 15 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren. Messen Sie am Ende der Inkubation die Lumineszenz wie gezeigt.

Nachdem Sie die Messung erhalten haben, geben Sie 50 Mikroliter Lysereagenz für eine 15-minütige Inkubation bei Raumtemperatur in jede Vertiefung, messen Sie dann erneut die Lumineszenz und verwenden Sie die Formel, um den Prozentsatz lebensfähiger Zellen zu berechnen. Eine 24-stündige Behandlung mit 50- und 100-Mikromolar-Wasserstoffperoxid hat keinen Einfluss auf die intrazelluläre Glutathionproduktion, während eine signifikante Abnahme des Glutathions beobachtet wird, wenn die Zellen mit einem 350-500- oder 700-Mikromolaren Wasserstoffperoxid behandelt werden Konzentration. Morphologisch erscheinen mit Wasserstoffperoxid behandelte Zellen mit zunehmender Konzentration der Verbindung weniger ausgebreitet und runder zu sein.

Dieser Effekt war bei PEDF- und GM-CSF-transfizierten Zellen, die mit Wasserstoffperoxid behandelt wurden, weniger ausgeprägt. Es ist wichtig zu beachten, dass die Zellzahl den Wasserstoffperoxid-vermittelten oxidativen Stress beeinflusst, da der Glutathionspiegel nach der Wasserstoffperoxidbehandlung in Vertiefungen, die nur mit 5.000 Zellen besiedelt waren, statistisch signifikant gesenkt wurde. Zellen, die mit PEDF und/oder GM-CSF behandelt oder transfiziert wurden, um PEDF und/oder GM-CSF zu exprimieren, produzieren signifikant mehr Glutathion im Vergleich zu unbehandelten Kontrollzellen unter oxidativen Bedingungen.

Darüber hinaus ist die UCP2-Genexpression in PEDF- und GM-CSF-transfizierten Zellen nach Wasserstoffperoxid erhöht, obwohl der Anstieg statistisch nicht signifikant ist. Die Western-Blot-Analyse von phosphorylierten AKT aus einem Lysat von GM-CSF-transfizierten Zellen, die Wasserstoffperoxid ausgesetzt waren, zeigt nur eine geringe Abnahme der Phosphorylisierung im Vergleich zu den unbehandelten Kontrollzellen, was darauf hindeutet, dass GM-CSF die Zellen vor oxidativen Stressschäden schützen kann. Es ist wichtig, die Zellen in der richtigen Dichte zu säen, frische Wasserstoffperoxidlösung zu verwenden und dem Medium frische Proteine hinzuzufügen.

Nachdem die antioxidative Wirkung der Wachstumsfaktoren mit Hilfe des Wasserstoffperoxid-Modells bestätigt wurde, können die Faktoren in einem Modell für oxidative stressbedingte Augenerkrankungen getestet werden. Das derzeitige Modell des oxidativen Stresses von Wasserstoffperoxid ermöglicht die Bewertung der antioxidativen Wirkungen, die verschiedene Faktoren haben können, und unterstützt daher die Entwicklung neuer Gentherapien.