Name: Modellierung von Brustkrebs im menschlichen Brustgewebe mit einem mikrophysiologischen System (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: Erfahren Sie die Modellierung von Brustkrebs mit einem mikrophysiologischen System unter Verwendung von primärem menschlichem Brustgewebe. Diese Methode ermöglicht die ex vivo Kultivierung von Gewebe zur Untersuchung von Tumor-Gewebe-Interaktionen.

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Wir danken dem Tulane Flow Cytometry and Cell Sorting Core sowie dem Tulane Histology Core für die technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde vom Southeastern Society of Plastic & Reconstructive Surgeons 2019 Research Grant und der National Science Foundation (EPSCoR Track 2 RII, OIA 1632854) unterstützt.

Alle menschlichen Gewebe wurden in Übereinstimmung mit Protokoll #9189 gesammelt, das vom Institutional Review Board Office der LSUHSC genehmigt wurde.
1. Aussaat von adipösen Stammzellen (ASCs) für Zellblätter
<ol><li>Kaufen Sie ASCs aus kommerziellen Quellen oder isolieren Sie aus primärem menschlichem Brustgewebe, indem Sie die festgelegten Protokolle8,9 befolgen. Samen Sie menschliche Brust-ASCs mit einer Dichte von 70% (~ 80.000 Zellen / cm2 Oberfläche) auf 6-Well-Standard-Gewebekulturplatten in Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM), ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum und 1% Penicillin / Streptomycin (BC-MPS Media). Stellen Sie sicher, dass die ASCs, die für die Bildung der Zellblätter verwendet werden sollen, kleiner als Durchgang 10 sein sollten.<ol>
<li>Für jede Bohrung des mikrophysiologischen Systems von Brustkrebs (BC-MPS), die erzeugt wird, säen Sie Zellen in 1 Standardgewebekultur und 1 Vertiefung ähnlicher Größe auf poly(N-isopropylacrylamid) (pNIPAAm)-beschichteter Gewebekultur-Kunststoffplatte. Eine 6-Well-Platte von BC-MPS erfordert eine Standard-Gewebekultur-6-Well-Platte (unten) und eine pNIPAAm-beschichtete Platte (oben). Die pNIPAAm-Platten können aus kommerziellen Quellen bezogen oder im Labor beschichtet werden10,11,12.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kultur-ASCs in einem Gewebekultur-Inkubator bei 37°C und 5% CO2. Wechseln Sie die Medien alle 2-3 Tage in einer Biosicherheitswerkbank.</li>
	<li>Kulturieren Sie die ASCs, bis sie zu 100% konfluent werden und ein streifengestreiftes Muster bilden. Abhängig von der Konfluenz, an der sie gesät wurden, dauert dies 7-10 Tage. Konfluente Zellblätter werden benötigt, um das schwimmfähige Fettbrustgewebe zu verankern.</li>
</ol>2. Vorbereitung der für BC-MPS benötigten Vorräte
<ol><li>Zur Herstellung von Gelatine für 6-Well-Platten wird eine 12% ige Gelatinelösung in destilliertemH2O. Mischen Sie 19 g Gelatine Typ B (Gelstärke von ~225 Bloom) und 125 mlH2O in einer 250 mL Glasmedienflasche. Fügen Sie der Lösung 1,6 ml 1 M NaOH hinzu, um den pH-Wert zu neutralisieren.</li>
	<li>Autoklavieren Sie die Lösung unter einem Flüssigkeitszyklus für 25 Minuten, um die Lösung zu sterilisieren.</li>
	<li>Lassen Sie die Lösung auf 37 °C abkühlen. In einer sterilen Biosicherheitswerkbank werden 16 ml sterile 10x Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) in die Lösung geben, um ein Endvolumen von 160 ml zu erhalten. HINWEIS: Die Gelatinelösung kann sofort verwendet oder bei Raumtemperatur für die spätere Verwendung gelagert werden. Die vorbereitete Gelatine ist bei Raumtemperatur für 1 Monat stabil. Wenn nur wenige Kolben benötigt werden, kann am selben Tag wie die Herstellung von BC-MPS wie zuvorbeschriebeneine 10-ml-Lösung hergestellt und steril gefiltert werden.<ol>
<li>Um Gelatinelösung durch Filtersterilisation herzustellen, verdünnen Sie 1 ml 10x HBSS mit 9 mlH2O,um eine 1x HBSS-Lösung in einem 15 mL konischen Röhrchen herzustellen. 100 μL 1 M NaOH in jedes 10-ml-Röhrchen geben und dann 0,7 g Gelatine in die Lösung geben. Mischen Sie die Lösung kräftig, um die Gelatine aufzulösen.</li>
		<li>Inkubieren Sie das Röhrchen in einem 75 °C Wasserbad für 20 min Schütteln alle 5 min. Verwenden Sie eine 10-ml-Spritze und einen 0,22-μm-Spritzenfilter, um die Gelatinelösung zu filtern. Filtern Sie die Gelatinelösung direkt auf die Kolben in einer Biosicherheitswerkbank.</li>
	</ol>
</li>
	<li>3D-Druck oder verwenden Sie einfaches Acryl, um die Kolben herzustellen, die zum Übertragen der Zellblätter verwendet werden. Stellen Sie sicher, dass die Kolben locker in die gewünschte Größe passen. Ein standardmäßiger 3D-gedruckter Kolben ist in Abbildung 1 dargestellt. Die Kolben können mit Standard-Computer-Aided-Design-Software wie TinkerCad entworfen und mit Filament-3D-Druckern gedruckt werden, die mit Polymilchsäure (PLA)13,14kompatibel sind.</li>
	<li>Um ein Rack für die Aufbewahrung der Kolben vorzubereiten, legen Sie ein 15-ml-Rohrgestell in eine Biosicherheitswerkbank. Platzieren Sie die Kolben kopfüber im Rack, so dass die Unterseite der Kolben nach oben zeigt. Legen Sie eine Kunststoffbox mit Deckel für den Transport von BC-MPS in die Biosicherheitswerkbank. Es wird empfohlen, dass die Box mindestens 35,5 cm Länge x 28 cm Breite x 8,25 cm Höhe hat, um 4 Platten BC-MPS unterzulegen. Entfernen Sie den Deckel aus der Box und sprühen Sie das Rack, die Kolben und die Box mit 70% EtOH herunter.</li>
	<li>Bereiten Sie sterile Rasierklingen und -zinnen durch Autoklavieren oder durch Legen in eine Biosicherheitswerkbank vor und waschen Sie sie mit 70% EtOH.</li>
	<li>Besprühen Sie die Kolben und die Box mit 70% EtOH und schalten Sie das UV-Licht in der Biosicherheitswerkbank für mindestens 30 minuten ein, um die Vorräte zu sterilisieren.</li>
</ol>3. Gelatinekolben vorbereiten und auf die oberen Zellblätter auftragen
<ol><li>Wenn die Gelatinelösung zuvor hergestellt wurde, erhitzen Sie sie in einem 37 ° C Wasserbad, um sie zu schmelzen.</li>
	<li>Pipetten Sie die Gelatinelösung mit einer serologischen Pipette von 5 oder 10 ml auf die Kolben in der Biosicherheitswerkbank. Ein Kolben für 1 Vertiefung einer 6-Well-Platte benötigt ~ 2,5 ml Gelatine.</li>
	<li>Sobald sich die Gelatine auf den Kolben verfestigt hat (~30-45 min), bewegen Sie die pNIPAAm-beschichteten ASC-Platten in die Biosicherheitswerkbank. Legen Sie die Kolben vorsichtig in die Vertiefungen der pNIPAAm-beschichteten ASC-Platten, damit die Gelatine mit den ASCs in Kontakt tritt. Legen Sie eine Metallscheibe (~ 7,5 g) auf den Kolben, um den Kolben zu beschweren, so dass Gelatine in direktem Kontakt mit dem ASC-Zellblatt steht. Lassen Sie die Kolben 30 minuten lang bei Raumtemperatur auf den ASC-Zellplatten.</li>
	<li>Bewegen Sie die Platte mit den Kolben vorsichtig in die sterile Box in der Biosicherheitswerkbank und legen Sie den Deckel darauf. Stellen Sie die Box für 30 min in einen 4 °C Kühlschrank. Wenn kein 4 °C Kühlschrank verfügbar ist, legen Sie den Teller für 30 min in einem Eiskübel in der Biosicherheitswerkbank auf Eis.</li>
</ol>4. Herstellung von Krebszelllinien
<ol><li>Säen Sie die Krebszelllinien in einer Standard-T75-Gewebekulturschale aus und halten Sie sie in Kultur, so dass sie an dem Tag, an dem BC-MPS verarbeitet wird, zu ~ 80% konfluent sind. (~200.000 Krebszellen werden pro BC-MPS benötigt). Wachsen Sie die Krebszellen in normalen Medien. HINWEIS: Um die Krebszellen zu identifizieren und zu isolieren, wird empfohlen, dass die Zellen mit einem fluoreszierenden Protein transfiziert werden, um sie von den ASCs und dem Brustgewebe zu unterscheiden. Die Anzahl der pro BC-MPS benötigten Krebszellen wurde für MCF7- und MDA-MB-231-Zellen optimiert. Andere Zelllinien erfordern möglicherweise eine weitere Optimierung.</li>
	<li>An dem Tag, an dem das BC-MPS vorbereitet wird, bringen Sie den Kolben mit den Krebszellen in die Biosicherheitswerkbank. Saugen Sie das Medium aus dem Kolben ab. Waschen Sie den Kolben mit 5 ml PBS.</li>
	<li>Fügen Sie 1 ml Zellablösungslösung in den Kolben mit den Krebszellen hinzu und inkubieren Sie den Kolben dann in einem 37 ° C-Inkubator, bis sich die Zellen gelöst haben (~ 2-5 min).</li>
	<li>In der Biosicherheitswerkbank 9 mL PBS in den Kolben geben, die Zellen in PBS in ein 15 mL konisches Röhrchen überführen und die Zellzahl mit einem Hämozytometer zählen.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Krebszellen bei 500 x g für 5 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Setzen Sie die Zellen in BC-MPS-Medien wieder ein, so dass 2 x 106 Zellen/ml vorhanden sind.</li>
	<li>Legen Sie die Krebszellen in ein 37 °C großes Wasserbad, bis sie bereit sind, dem menschlichen Gewebe hinzugefügt zu werden.</li>
</ol>5. Verarbeitung von menschlichem Brustgewebe
<ol><li>In einer Biosicherheitswerkbank das menschliche Brustgewebe (HBT) 3x mit 10 ml sterilem PBS waschen.</li>
	<li>Verwenden Sie eine sterile Zette und eine Rasierklinge, um das BC-MPS grob zu zerhacken und versuchen Sie, so viel Faszien und Bindegewebe wie möglich zu entfernen. Das Versäumnis, das Bindegewebe zu entfernen, kann dazu führen, dass die obere ASC-Schicht das HBT nicht richtig verankert. HINWEIS: Die Faszie und das Bindegewebe können durch ihr weißes oder klares Aussehen im Vergleich zur gelben Farbe des Fettgewebes identifiziert werden.</li>
	<li>Sobald das Bindegewebe entfernt wurde, verwenden Sie eine sterile Rasierklinge, um das Gewebe fein zu hacken, bis es eine homogene flüssige Konsistenz hat. Das Gewebe wird fein gehackt, wenn es leicht mit einer 25 ml serologischen Spitze pipetiert werden kann.</li>
	<li>Verwenden Sie eine sterile Rasierklinge, um die Spitze von einer p1000-Pipettenspitze abzuschneiden, um das Pipettieren des gehackten HBT zu unterstützen.</li>
	<li>In einem 1,5-ml-Röhrchen mischen Sie das gehackte HBT, Krebszelllinien und BC-MPS-Medien (für 1 Vertiefung einer 6-Well-Platte benötigt dies 200 μL gehacktes HBT, 100 μL BC-MPS-Medien und 100 μL Krebszellen).</li>
	<li>Bewegen Sie die ASC-Platte, die für die untere Zellplatte verwendet wird, vom Inkubator in die Biosicherheitswerkbank. Saugen Sie das Medium von der unteren ASC-Platte ab. Pipetten Sie die Mischung auf die Mitte des Brunnens der unteren ASC-Platte mit einer p1000-Pipettenspitze, bei der das distale Ende ab Schritt 5.4 abgeschnitten war</li>
	<li>Bewegen Sie die Box mit der oberen ASC-Platte mit den Kolben darauf in die Biosicherheitswerkbank. Entfernen Sie vorsichtig die Gelatinekolben von der pNIPAAm-beschichteten Platte und legen Sie sie auf die HBT-Mischung. Fügen Sie BC-MPS-Medien zum Bohrbrunnen hinzu (für 1 Vertiefung einer 6-Well-Platte fügen Sie 2 ml Medien hinzu). Bewegen Sie die unteren ASC-Platten mit der BC-MPS-Mischung und den Kolben vorsichtig in die sterile Kunststoffbox und legen Sie den Deckel der Box für den Transport auf. HINWEIS: Der 6-Well-Plattendeckel passt nicht wieder auf die ASC-Platte, während die Kolben eingeschaltet sind. Es muss darauf geachtet werden, dass die Kultur nicht kontaminiert wird.</li>
	<li>Inkubieren Sie die bodenplatte in der Box in einem Inkubator bei 37 ° C, bis die Gelatine geschmolzen ist und die obere ASC-Schicht begonnen hat, an der unteren Schicht zu haften (~ 30 min).</li>
	<li>Bringen Sie die Box mit den Platten in die Biosicherheitswerkbank. Entfernen Sie vorsichtig die Kolben von den Bodenplatten. Das Gewebe mit den Krebszellen wird am Boden des Brunnens verankert.</li>
	<li>Legen Sie den Deckel der 6-Well-Platte wieder auf die untere Platte und inkubieren Sie bei 37 °C, um die Gelatine vollständig zu schmelzen und die obere Schicht vollständig in der unteren Schicht verankern zu lassen (~ 30-60 min).</li>
	<li>Bewegen Sie die Platten vorsichtig in eine Biosicherheitswerkbank und saugen Sie das Medium mit einer 10 mL serologischen Pipette an. Fügen Sie 2 ml frische Medien zu jedem Brunnen hinzu. Saugen Sie vom Rand des Brunnens ab und pipetieren Sie ihn auf den Rand des Brunnens, um zu vermeiden, dass sich das Gewebe löst.</li>
	<li>Halten Sie das BC-MPS für die gewünschte Zeit bei 37 °C und 5% CO2 und wechseln Sie alle 2-3 Tage die Medien.</li>
</ol>6. Aufschluss von BC-MPS zur Analyse
<ol><li>Wenn das BC-MPS zur Analyse bereit ist, bewegen Sie die Platte in die Biosicherheitswerkbank. Entfernen Sie die Medien mit einer serologischen Pipette, um ein versehentliches Entfernen von Gewebe zu vermeiden.</li>
	<li>Fügen Sie jedem Bohrbrunnen 1 PbS-Volumen hinzu.</li>
	<li>Entfernen Sie das PBS mit einer serologischen Pipette.</li>
	<li>Fügen Sie 1 ml Zelldissoziationslösung zu jeder Vertiefung hinzu. Bewegen Sie die Platte zurück zum Inkubator und inkubieren Sie sie bei 37 °C für 5 min, damit sich die Zellen lösen können. Verwenden Sie in einer Biosicherheitswerkbank einen Zellschaber, um die Zellen und das Gewebe vollständig von der Kulturplatte zu lösen.</li>
	<li>Die Lösung wird mit dem Gewebe in ein konisches 15-ml-Röhrchen mit einer serologischen Pipette übertragen. Fügen Sie 2 ml PBS zu jeder Vertiefung hinzu, um alle verbleibenden Zellen zu sammeln und diese Lösung in das konische Rohr zu übertragen. Wenn die Zellen fluoreszierend sind, wickeln Sie die Tube in Aluminiumfolie, um sie vor Licht zu schützen.</li>
	<li>Inkubieren Sie das Röhrchen bei 37 °C unter ständigem Rühren in einem Orbitalschüttler bei 1 x g für 10-20 min, um die Zellen vollständig vom Gewebe zu dissoziieren.</li>
	<li>In einer Biosicherheitswerkbank verwenden Sie eine serologische Pipette, um verbleibende Zellklumpen im Röhrchen zu stören und die Probe durch ein 250 μm Gewebesieb in ein neues 15 ml Röhrchen zu filtern. Pipetieren Sie die Lösung langsam durch das Sieb, damit sie nicht überläuft.</li>
	<li>Spülen Sie das Sieb mit 1 ml PBS ab, um alle noch im Sieb noch im Sieb zu sammeln.</li>
	<li>Zentrifugiert die Proben bei 500 x g bei Raumtemperatur für 5 min. Nach der Zentrifugation schwimmen die Adipozyten auf der obersten Schicht der Lösung, während die Krebszellen und ASCs in einem Pellet am Boden der Röhre vermischt werden.</li>
	<li>Um die Adipozyten zu isolieren, gießen Sie die oberste Schicht vorsichtig in ein neues Röhrchen oder schneiden Sie alternativ die Spitze von einer p1000-Pipettenspitze ab und übertragen Sie die oberste Schicht in ein neues Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Probe bei 500 x g für 5 min erneut und entfernen Sie die Lösung mit einer Spritze und Nadel unterhalb der Adipozyten, so dass nur noch die Adipozyten übrig bleiben. Die Adipozyten sind nun bereit für die Analyse</li>
	<li>Nachdem Sie die Adipozyten aus der Lösung entfernt haben, trennen Sie die ASCs und Krebszellen zur Analyse voneinander, wenn die Krebszellen zuvor mit einem fluoreszierenden Protein transfiziert wurden. Saugen Sie die verbleibende Lösung aus dem Röhrchen, das die ASCs und Krebszellen enthält, ohne das Zellpellet zu stören. Resuspendieren Sie das Pellet in PBS- oder BC-MPS-Medien und verwenden Sie die Durchflusszytometrie, um die Zellen basierend auf der Fluoreszenz zu sortieren.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine interessenkonflikte haben.

Neue Systeme zur Modellierung von menschlichem Brustkrebs sind erforderlich, um ein besseres Verständnis der Krankheit zu entwickeln. Die Entwicklung menschlicher mikrophysiologischer Systeme zur Modellierung von Krankheitseinstellungen, die native ECM- und Stromazellen umfassen, wird die Vorhersagekraft präklinischer Studien erhöhen. Das hier vorgestellte BC-MPS-Modell ist ein neu entwickeltes System, das die Einschränkungen früherer Modelle überwindet und die Auswertung von BC in seiner nativen HBT-Umgebung ermöglicht....

Jedes Jahr sterben mehr als 40.000 US-Frauen an Brustkrebs (BC)1. Trotz jährlich mehr als 700 Millionen US$Dollar, die in die BC-Forschung investiert werden, bestehen 97% der BC-Kandidatenmedikamente klinische Studien2,3. Neue Modelle sind erforderlich, um die Medikamentenentwicklungspipeline und unser Verständnis von BC zu verbessern. Das NIH Microphysiological (MPS) Program berennt die Merkmale, die für bahnbrechende Modelle zur Verbesserung der Umsetzung von Grundlagenforschung in klinischen Erfolg erforderlich sind4. Dazu gehörten die Verwendung von primären menschlichen Zellen oder Geweben, die 4 Wochen lang in Kultur stabil sind, und die Einbeziehung der nativen Gewebearchitektur und der physiologischen Reaktion.
Aktuelle In-vitro-BC-Modelle, wie die zweidimensionale Kultur von BC-Zelllinien, die Membraneinfüge-Co-Kultur und dreidimensionale Sphäroide und Organoide, erfüllen die MPS-Kriterien des NIH nicht, da keines dieser Modelle die native Brustgewebearchitektur rekapituliert. Wenn extrazelluläre Matrix (ECM) zu diesen Systemen hinzugefügt wird, wird Brust-ECM nicht verwendet; Stattdessen werden Kollagengele und Basalmembranmatrizen verwendet.
Aktuelle In-vivo-Systeme, wie patientenabgeleitete Xenografts (PDX), erfüllen ebenfalls nicht die MPS-Kriterien des NIH, da sich das murine Brustgewebe stark von den menschlichen Brüsten unterscheidet. Darüber hinaus werden Interaktionen zwischen Immunsystem und BC zunehmend als Schlüssel zur Tumorentwicklung anerkannt, aber den immungeschwächten murinen Modellen, die zur Erzeugung von PDX-Tumoren verwendet werden, fehlen reife T-Zellen, B-Zellen und natürliche Killerzellen. Während PDX es ermöglicht, primäre Brusttumoren zu erhalten und zu erweitern, werden die resultierenden PDX-Tumoren mit primären murinen Stromazellen und ECM5infiltriert.
Um diese Herausforderungen zu meistern, haben wir ein neuartiges, ex vivo, dreidimensionales menschliches Brust-MPS entwickelt, das die NIH-MPS-Kriterien erfüllt. Die Grundlage unseres Brust-MPS besteht darin, primäres menschliches Brustgewebe (HBT) zwischen zwei Blättern von fettabgeleiteten Stammzellen (ASCs) zu schalten, die ebenfalls aus HBT isoliert wurden (Abbildung 1). Kolben zum Übertragen der Zellplatten auf Sandwich der HBT können 3D-gedruckt oder aus einfachen Acrylkunststoffen hergestellt werden (Abbildung 1H, I). Diese Technik adaptiert unseren zuvor beschriebenen Ansatz zur Kultivierung von primärem menschlichem weißem Adipozytengewebe6,7. Das Brust-MPS kann dann mit einem BC-Modell der Wahl gesät werden, das von Standard-BC-Zelllinien bis hin zu primären menschlichen Brusttumoren reicht. Hier zeigen wir, dass diese BC-MPS in Kultur über mehrere Wochen stabil sind (Abbildung 2); enthalten native Elemente von HBT wie Brustadipozyten, ECM, Endothel, Immunzellen (Abbildung 3); und rekapitulieren die physiologischen Wechselwirkungen zwischen BC und HBT wie metabolisches Übersprechen (Abbildung 4). Schließlich zeigen wir, dass BC-MPS die Untersuchung der Amöbenbewegung von BC-Zellen während hbT ermöglicht (Abbildung 5).

<table><tbody><tr><td>Accumax</td><td>Innovative Cell Technologies</td><td>1333</td><td>Zelldissoziierungslösung für die Trennung von BC-MPS</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Corning</td><td>25-058-CI</td><td>Zellablösungslösung für die Passage von Zellen</td></tr><tr><td>BioStor Container 16oz</td><td>National Scientific Supply Co</td><td>MPCE-T016</td><td>Für den Transport von sterilem Gewebe</td></tr><tr><td>Zellkultur-75-cm-Flaschen</td><td>Corning</td><td>430641U</td><td>Für die Kultivierung von ASCs</td></tr><tr><td>Konische Röhrchen 15mL&nbsp;</td><td>ThermoScientific</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>Gebogene Pinzette</td><td>ThermoScientific</td><td>1631T5</td><td>Zum Manövrieren von Gewebe beim Zerkleinern</td></tr><tr><td>DMEM niedriger Glukosegehalt, mit Glutamax</td><td>Gibco</td><td>10567-014</td><td>Für die Kultivierung von ASCs und BC-MPS</td></tr><tr><td>FBS qualifiziert</td><td>Gibco</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>Gelatine</td><td>Sigma</td><td>G9391</td><td></td></tr><tr><td>HBSS 10x</td><td>Gibco</td><td>14185-052</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma</td><td>221465</td><td></td></tr><tr><td>Nunc UpCell 6-Well-Platten</td><td>ThermoScientific</td><td>174901</td><td>Top ASC Zellblatt</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep 5.000U</td><td>Gibco</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Petrischale 150 cm</td><td>FisherBrand</td><td>FB0875714</td><td>Zum Halten von Gewebe beim Zerkleinern&nbsp;</td></tr><tr><td>Rasierklingen</td><td>VWR</td><td>55411-055</td><td>Einschneidig zum Zerkleinern von Gewebe</td></tr><tr><td>Sieb 250um&nbsp;</td><td>ThermoScientific</td><td>87791</td><td>Für die Trennung von BC-MPS</td></tr><tr><td>Gewebekultur-6-Well-Platten</td><td>Corning</td><td>3506</td><td>Bottom ASC cell Sheet Weights</td></tr><tr><td>/washers</td><td>BCP Befestigungselemente</td><td>BCP672</td><td>Zum Wiegen von Kolben mit einem Innendurchmesser von 1/2"</td></tr></tbody></table>

modellierung von brustkrebs im menschlichen brustgewebe mit einem mikrophysiologischen system

Modeling Breast Cancer in Human Breast Tissue using a Microphysiological System

Brustkrebs (BC) bleibt eine der häufigsten Todesursachen für Frauen. Trotz jährlich mehr als 700 Millionen US$Dollar, die in die BC-Forschung investiert werden, bestehen 97% der BC-Kandidatenmedikamente klinische Studien. Daher sind neue Modelle erforderlich, um unser Verständnis der Krankheit zu verbessern. Das NIH Microphysiological Systems (MPS) Programm wurde entwickelt, um die klinische Translation von Grundlagenforschungsentdeckungen und vielversprechenden neuen therapeutischen Strategien zu verbessern. Hier stellen wir eine Methode zur Erzeugung von MPS bei Brustkrebs (BC-MPS) vor. Dieses Modell adaptiert einen zuvor beschriebenen Ansatz zur Kultivierung von primärem menschlichem weißem Fettgewebe (WAT), indem WAT zwischen fettbasierten Stammzellblättern (ASC) eingebettet wird. Zu den neuen Aspekten unseres BC-MPS gehören die Aussaat von BC-Zellen in nicht erkranktes menschliches Brustgewebe (HBT), das native extrazelluläre Matrix, reife Adipozyten, ansässige Fibroblasten und Immunzellen enthält; und Sandwiching der BC-HBT-Beimischung zwischen HBT-abgeleiteten ASC-Platten. Das resultierende BC-MPS ist in Kultur ex vivo für mindestens 14 Tage stabil. Dieses Modellsystem enthält mehrere Elemente der Mikroumgebung, die BC beeinflussen, einschließlich Adipozyten, Stromazellen, Immunzellen und der extrazellulären Matrix. So kann BC-MPS verwendet werden, um die Wechselwirkungen zwischen BC und seiner Mikroumgebung zu untersuchen. 
Wir demonstrieren die Vorteile unseres BC-MPS, indem wir zwei BC-Verhaltensweisen untersuchen, von denen bekannt ist, dass sie das Fortschreiten und die Metastasierung von Krebs beeinflussen: 1) BC-Motilität und 2) BC-HBT-metabolisches Crosstalk. Während die BC-Motilität bisher mit intravitalen Bildgebung nachgewiesen wurde, ermöglicht BC-MPS eine hochauflösende Zeitraffer-Bildgebung mittels Fluoreszenzmikroskopie über mehrere Tage. Während das metabolische Übersprechen zuvor mit BC-Zellen und murinen Präadipozyten demonstriert wurde, die in unreife Adipozyten differenziert wurden, ist unser BC-MPS-Modell das erste System, das dieses Crosstalk zwischen primären menschlichen Brustadipozyten und BC-Zellen in vitro demonstriert.

Stabilität in der Kultur BC-MPS ist ein stabiles mikrophysiologisches System, das bis zu 14 Tage in vitro kultiviert werden kann. Ein Hellfeldbild der ASC-Zellblätter wurde mit 100-facher Vergrößerung aufgenommen, um das streifengestreifte Muster des konfluenten Blattes darzustellen (Abbildung 2A). Die ASC-Zellblätter sind in Kultur mindestens 4 Wochen stabil. BC-MPS nach 14 Tagen in Kultur in einer Vertiefung einer 6-Well-Platte wurde mit...

Dieses Protokoll beschreibt den Aufbau eines mikrophysiologischen In-vitro-Systems zur Untersuchung von Brustkrebs unter Verwendung von primärem menschlichem Brustgewebe mit Handelsmaterialien.

Modellierung von Brustkrebs im menschlichen Brustgewebe mit einem mikrophysiologischen System

Breast cancer (BC) remains a leading cause of death for women. Despite more than $700 million invested in BC research annually, 97% of candidate BC drugs ...

Dies ist das erste Protokoll, das es ermöglicht, menschliches Brustgewebe ex vivo für längere Zeit am Leben zu erhalten, was die Untersuchung von Wechselwirkungen zwischen menschlichem Brustgewebe und menschlichem Brustkrebs ermöglicht. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass makroskopische Stücke des menschlichen Brustgewebes einschließlich Brustadipozyten, Immunzellen, Gefäßstrukturen, duktalen Strukturen und extrazellulärer Matrix ex vivo am Leben erhalten werden können. Diese Technik hat große Auswirkungen auf mehrere Bereiche der Brustkrebsforschung, einschließlich personalisierter Medizin, pharmazeutischer Entwicklung und der Pathophysiologie der Tumorinitiierung und langsamerer Brustkrebsprozesse wie Fibrose und extrazellulärem Matrixumbau.Katherine Hebert, eine Tulane-Doktorandin, und Rakesh Gurrala, eine Tulane-Medizinstudentin aus meinem Labor, demonstrieren dieses Verfahren. Zu beginnt die vorbereitete Gelatinelösung in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad schmelzen. Verwenden Sie eine serologische Pipette mit fünf oder 10 Millilitern, um 2,5 Milliliter dieser Lösung auf jeden Kolben für Vertiefungen einer Sechs-Brunnen-Platte zu dosieren.Sobald die Gelatine verfestigt ist, bewegen Sie die pNIPAAm-codierten ASC-Platten in die Biosicherheitswerkbank. Legen Sie die Kolben vorsichtig in die Vertiefungen dieser Platten, damit die Gelatine mit den ASCs in Kontakt tritt. Legen Sie eine Metallscheibe auf den Kolben, um ihn zu beschweren, so dass die Gelatine 30 Minuten lang bei Raumtemperatur in direktem Kontakt mit dem ASC-Blech steht.Bewegen Sie die Platte mit den Kolben vorsichtig in die sterile Box in der Bio-Sicherheitsbox und legen Sie den Deckel darauf. Bewegen Sie die Box in einen Vier-Grad-Kühlschrank oder stellen Sie den Teller für 30 Minuten auf Eis und einen Eiskübel in die Bio-Sicherheitswerkbank. Waschen Sie das menschliche Brustgewebe in einer Biosicherheitswerkbank dreimal mit 10 Millilitern sterilem PBS.Verwenden Sie eine sterile Zette und eine Rasierklinge, um das BC-MPS grob zu zerhacken und versuchen Sie, so viel Faszien und Bindegewebe wie möglich zu entfernen. Sobald das Bindegewebe entfernt wurde, verwenden Sie eine sterile Rasierklinge, um das Gewebe schließlich zu zerhacken, bis es eine homogene flüssige Konsistenz hat. Schneiden Sie die Spitze einer P1000-Pipettenspitze ab, um das Pipettieren des gehackten Gewebes zu unterstützen.Kombinieren Sie in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen das Hackfleischgewebe, die Krebszelllinien und die BC-MPS-Medien, wie im Textmanuskript beschrieben. Bewegen Sie die ACS-Platte, die für die untere Zellplatte verwendet wird, vom Inkubator in die Biosicherheitsschrank und saugen Sie das Medium von der Platte ab. Pipetieren Sie die vorbereitete Brustgewebemischung mit der geschnittenen Pipettenspitze auf die Mitte des Brunnens der unteren ACS-Platte, bewegen Sie die Box mit der oberen ACS-Platte mit Kolben in die Biosicherheitswerkbank.Entfernen Sie vorsichtig die Gelatinekolben von der pNIPAAm-beschichteten Platte und legen Sie sie auf die Gewebemischung. Fügen Sie BC-MPS-Medien in den Brunnen hinzu und bewegen Sie die unteren ACS-Platten vorsichtig mit der BC-MPS-Mischung und den Kolben in die sterile Kunststoffbox. Legen Sie den Deckel der Box für den Transport auf und achten Sie darauf, eine Kontamination der Kultur zu vermeiden.Inkubieren Sie die bodenplatte in der Box und den 37 Grad Celsius inkubieren, bis die Gelatine geschmolzen ist und die obere ACS-Schicht begonnen hat, an der unteren Schicht zu haften. Dann bewegen Sie die Box mit den Platten in die Bio-Sicherheitswerkbank, entfernen Sie vorsichtig die Kolben von den Bodenplatten, um das Gewebe mit den Krebszellen zu beobachten, die am Boden des Brunnens verankert sind. Legen Sie den Deckel der Sechs-Well-Platte wieder auf die untere Platte und inkubieren Sie bei 37 Grad, um die Gelatine vollständig zu schmelzen und die obere Schicht an der unteren Schicht verankern zu lassen.Bewegen Sie die Platten vorsichtig in eine Biosicherheitswerkbank und saugen Sie das Medium mit einer 10 Milliliter serologischen Pipette vom Rand des Brunnens ab. Fügen Sie zwei Milliliter frisches Medium auf den Rand jedes Brunnens hinzu, um zu vermeiden, dass sich das Gewebe löst. Halten Sie den BC-MPS bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für die gewünschte Zeit.Medienwechsel alle zwei bis drei Tage. Bewegen Sie die Platte in die Biosicherheitswerkbank, wenn das BC-MPS zur Analyse bereit ist. Entfernen Sie die Medien mit einer serologischen Pipette, um ein versehentliches Entfernen von Gewebe zu vermeiden.Fügen Sie jedem Bohrbrunnen ein PBS-Volume hinzu. Anschließend das PBS mit einer serologischen Pipette entfernen. Fügen Sie einen Milliliter Zelldissoziationslösung zu jeder Vertiefung hinzu und bewegen Sie die Platte für fünf Minuten zurück zum Inkubator, damit sich diese Zellen lösen können.Verwenden Sie nach der Inkubation einen Zellschaber, um die Zellen und das Gewebe in einer Biosicherheitswerkbank vollständig von der Kulturplatte zu lösen. Übertragen Sie die Lösung mit dem Gewebe in ein 15 Milliliter konisches Röhrchen und sammeln Sie alle verbleibenden Zellen durch Zugabe von zwei Millilitern PBS. Wickeln Sie die Tube mit Aluminiumfolie ein, wenn die Zellen fluoreszierend sind.Inkubieren Sie den Schlauch bei 37 Grad unter ständigem Rühren in einem Orbitalschüttler zu einem Zeitpunkt G für 10 bis 20 Minuten, um die Zellen vollständig vom Gewebe zu dissoziieren. Verwenden Sie in einer Biosicherheitswerkbank eine serologische Pipette, um verbleibende Zellklumpen in der Röhre zu stören. Und filtern Sie die Probe durch ein 250 Mikrometer großes Gewebesieb in ein neues 15-Milliliter-Röhrchen.Spülen Sie das Sieb mit einem Milliliter PBS ab, um die verbleibenden Zellen zu sammeln. Zentrifugieren Sie die Proben fünf Minuten lang bei 500 g bei Raumtemperatur, um die Adipozyten, die in der obersten Schicht schwimmen, von den Krebszellen und ASCs zu trennen, die in einem Pellet miteinander vermischt sind. Übertragen Sie die Adipozytenschicht mit einer stumpf geschnittenen Pipettenspitze in ein neues Röhrchen.Zentrifugieren Sie die Probe erneut und entfernen Sie mit einer Spritze und einer Nadel die verbleibende Lösung unterhalb der Adipozyten. Saugen Sie die verbleibende Lösung aus dem Röhrchen, das die ASCs und Krebszellen enthält, ohne das Zellpellet zu stören. Suspendieren Sie das Pellet in PBS- oder BC-MPS-Medien und verwenden Sie die Durchflusszytometrie, um die Zellen basierend auf Fluoreszenz zu sortieren.Hier ist das stri-gestützte Muster des konfluenten ASC-Blattes dargestellt. Das schwimmende menschliche Brustgewebe war nach 14 Tagen Kultur noch stabil durch die ASC-Zellblätter am Boden des Brunnens verankert. Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen zeigen die Stabilität des BC-MPS mit MDA-MB-231 exprimierenden RFP-Zelllinien nach 14 Tagen und mit dreifach negativem Tumor explantieren PDX für mindestens sechs Tage.BC-MPS, das Brustgewebe enthält, wurde 14 Tage lang in vitro kultiviert, gefärbt und abgebildet, um die nativen Elemente des Gewebes bei 100-facher und 20-facher Vergrößerung zu demonstrieren. Die Färbung der Makrophagenmarker wurde verwendet, um die Erhaltung der primären Makrophagen nach drei und sieben Tagen in Kultur zu zeigen. Die Durchflusszytometrie-Analyse von Bodipy-gefärbten MDA-MB-231-Zellen nach 14 Tagen zeigt eine minimale Lipidakkumulation in 2D-Kultur und eine umfangreiche Lipidakkumulation und BC-MPS.Der Anteil lipidpositiver MDA-MB-231-Zellen war in BC-MPS 26,2-fach höher als in 2D-Kultur. Zellen, die in BC-MPS kultiviert wurden, zeigten einen Anstieg der Lipidtröpfchen im Vergleich zu Zellen, die in Standard-2D-Kultur kultiviert wurden. Zeitrafferbilder von RFP-markierten BC-MPS mit MDA-MB-231-Zellen zeigten eine amöboide Bewegung von 231 Zellen mit Pseudokapseln und hoher Motilität.Das Brustgewebe muss klein genug gehackt und so weit getrennt werden, dass es über den Boden des Brunnens verteilt werden kann. Brustgewebe ist sehr schwimmfähig und wenn die Stücke zu groß oder zu eng beieinander gruppiert sind, können die ASC-Zellblätter das Brustgewebe nicht am Boden des Brunnens verankern. Die resultierenden Brustkrebskonstrukte können enzymatisch verdauen, um bestimmte Zelltypen von Interesse zu isolieren.Auf diese Weise können Schlüsselfragen beantwortet werden, z. B. wie Krebszellen im Brustgewebe anders auf Chemotherapie reagieren als herkömmliche 2D-Kultur oder Organoide.

modeling-breast-cancer-human-breast-tissue-using-microphysiological

Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

Krebsforschung

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In Standardkulturverfahren, Zellen aus ihrer physiologischen Umgebung genommen und auf die Kunststoffoberfläche einer Schale gezüchtet. Um das Verhalten von primären humanen Knochenmarkzellen untersuchen wir eine 3-D-Kultur-System, wo Zellen unter Bedingungen rekapituliert die native Mikroumgebung des Gewebes gewachsen erstellt.

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Krebs ist eine komplexe Erkrankung, die durch den den Tumor umgebenden Gewebes sowie lokale pro- und anti-inflammatorischen Mediatoren beeinflusst wird. Daher kann orthotrope Pritzer, anstatt subkutanen Modellen nützlich sein, um Krebsprogression in einer Weise, dass eine bessere ahmt menschlichen Pathologie studieren.

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Wir haben eine neue Ex-vivo-Modell, um die Hormonwirkung in der menschlichen Brust zu studieren entwickelt. Es wird auf das Gewebe Mikrostrukturen von chirurgischen Brustgewebeproben, die Gewebearchitektur, interzellulären Wechselwirkungen und parakrine Signal bewahren isoliert basiert.

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