Herstellung magnetischer Plattformen für die Organisation vernetzter Neuronen im Mikrometerbereich

Unser Ansatz ermöglicht es, die Bildung neuronaler Netze mit magnetischen Manipulationen zu steuern. Dies ist ein effektives Werkzeug für In-vitro-Studien von Netzwerken und bietet eine neuartige therapeutische Richtung für Biointerfacing-Geräte. Mit dieser Technik können wir sowohl den Standort als auch das Wachstum der Zelle im Mikrometerbereich steuern, was ein flexibles Design des magnetischen Musters und damit der Netzwerkorganisation ermöglicht.

Ein effizientes und ungiftiges magnetisches Nanopartikel-Steriloptic ist entscheidend. Um erfolgreich zu sein, werden geeignete magnetische Nanopartikel benötigt. Die wichtigen Merkmale sind die Größe, Beschichtung und der Situationsmagnetisierungswert.

Die Verfahren werden von Reut Plen und Dafna Levenberg, Masterstudenten für mein Labor, demonstriert. Zu Beginn schneiden Sie Glasdias mit einem Schreibstift in zwei mal zwei Zentimeter große Stücke. Reinigen Sie die Glasobjektträger in Aceton und dann Isopropanol für jeweils fünf Minuten in einem Ultraschallbad.

Anschließend trocknen Sie sie mit ultrahochreinem Stickstoff. Beschichten Sie das Glas mit Fotolack mit Spin-Beschichtung bei 6.000 U / min für 60 Sekunden, um eine Dicke von 1,5 Mikrometern zu erreichen, und backen Sie 100 Grad Celsius für 60 Sekunden. Setzen Sie die Probe einer Lichtquelle mit einer Fotomaske oder maskenlosen Lithographie aus, um das gewünschte Muster zu erzielen.

Entwickeln Sie die Probe für 40 Sekunden in einem Entwickler, der gemäß den Anweisungen des Herstellers in destilliertem Wasser verdünnt wird. Dann waschen Sie es 45 Sekunden in Wasser und trocknen Sie es mit UHP-Stickstoffgas. Untersuchen Sie das Muster unter einem optischen Mikroskop.

Setzen Sie die Probe in die Lastverriegelungskammer des Abscheidesystems ein und warten Sie auf den Grunddruck. Übertragen Sie die Probe in die Hauptkammer und stellen Sie die Probe auf die geeignete Höhe für die Abscheidung. Erhöhen Sie die Leistung auf jedem Ziel, bis die gewünschte Rate erreicht ist.

Schalten Sie die Rotation ein und lagern Sie dann die ferromagnetische Multischicht ab, abwechselnd zwischen den Kobalt-, Eisen- und Palladiumzielen, indem Sie die Zielverschlüsse öffnen bzw. schließen. Lagern Sie 14 Doppelschichten Kobalt-Eisen-Palladium ab und beenden Sie mit einer zusätzlichen Palladium-Deckschicht. Nachdem die Abscheidung abgeschlossen ist, entladen Sie die Probe aus dem Abscheidesystem.

Die Probe 30 Minuten in Aceton einweichen und mit Isopropanol abspülen. Anschließend mit UHP-Stickstoff trocknen und unter dem Mikroskop untersuchen. Bewahren Sie es bis zum Gebrauch in einer sauberen und trockenen Umgebung auf.

Verwenden Sie einen Glasträger mit einem kreuzförmigen Magnetbalken von 100 Mikrometer Breite, der mit ferromagnetischen Multischichten abgeschieden ist. Befestigen Sie die Probe mit doppelseitigem Klebeband am Halter. Verwenden Sie einen Drahtbonder, um vier Drähte an die Probe zu binden, einen an jedem Bein der Kreuzelektrode.

Stellen Sie den Probenhalter und die Probe innerhalb des Transportmesssystems mit einem Magnetfeld so ein, dass das Magnetfeld senkrecht zur Probe steht. Führen Sie Querspannungsmessungen wie im Textmanuskript beschrieben durch. Sweep das Magnetfeld und messen Sie die Querspannung als Funktion des Feldes.

Zeichnen Sie den Querwiderstand als Funktion des Magnetfeldes auf, um das anomale Hall-Signal zu bestimmen, das proportional zur senkrechten Magnetisierung im Film ist. Bereiten Sie das grundlegende Wachstumsmedium und das Differenzierungsmedium für die PC12-Zellkultur vor, wie im Textmanuskript beschrieben. Züchten Sie Zellen in einem nicht behandelten Kulturkolben mit 10 Millilitern basism Wachstumsmedium und fügen Sie dem Kolben alle zwei bis drei Tage 10 Milliliter Medium hinzu.

Subkulturieren Sie die Zellen nach acht Tagen. Für die Zellaufnahme zentrifugieren Sie die Zellsuspension acht Minuten lang bei 200 G und Raumtemperatur und entsorgen Sie dann den Überstand. Resuspendieren Sie die Zellen in drei Milliliter frischem Basiswachstumsmedium.

Zentrifugieren Sie die Zellen erneut für fünf Minuten, verwerfen Sie dann den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in drei Millilitern frischem Differenzierungsmedium. Saugen Sie die Zellen 10 Mal mit einer Spritze und einer Nadel an, um die Zellcluster aufzubrechen, zählen Sie dann die Zellen mit einem Hämozytometer und säen Sie eine Million Zellen in einer normalen, unbeschichteten 35-Millimeter-Schale. Fügen Sie das berechnete Volumen der MNP-Suspension und des Differenzierungsmediums in die Schüssel hinzu, um die gewünschte MNP-Konzentration zu erreichen.

Mischen Sie die Zellen, MNPs und das Differenzierungsmedium und inkubieren Sie die Schale dann in einem 5% Kohlendioxid befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius für 24 Stunden. Reinigen Sie das gemusterte Substrat mit 70% Ethanol und legen Sie es in eine 35-Millimeter-Kulturschale in der Haube. Legen Sie einen großen Magneten für eine Minute unter das gemusterte Substrat, entfernen Sie ihn dann, indem Sie die Schüssel nach oben und weg bewegen und den Magneten aus der Haube nehmen.

Schalten Sie das ultraviolette Licht für 15 Minuten ein. Um ein kollagenbeschichtetes Glassubstrat herzustellen, verdünnen Sie Kollagen Typ eins in einem Verhältnis von eins zu 50 in 30% Ethanol. Decken Sie das Glas mit der Lösung ab.

Lassen Sie die Schüssel vier Stunden lang unbedeckt in der Haube, bis die gesamte Lösung verdunstet ist, und waschen Sie sie dann dreimal in sterilem PBS. Entfernen Sie die Zellen aus dem Inkubator, zentrifugieren Sie die Zellsuspension fünf Minuten lang bei 200 G und entsorgen Sie den Überstand. Resuspendieren Sie die Zellen in einem Milliliter frischem Differenzierungsmedium und zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer.

10 in eine 35-Millimeter-Kulturschale auf die fünf Zellen auf dem Substrat aufsäen und zwei Milliliter Differenzierungsmedium hinzufügen. Inkubieren Sie die Kultur in einem 5% Kohlendioxid befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius. Nach 24 Stunden einen bis 100 frischen murinen Beta-NGF zu den Zellen geben.

Erneuern Sie das Differenzierungsmedium und fügen Sie alle zwei Tage frischen Beta-NGF hinzu. Bilden Sie die Zellen alle zwei Tage mit Lichtmikroskopie ab und führen Sie nach der Netzwerkbildung eine Immunfärbung der Zellen durch. Magnetische Plattformen mit unterschiedlichen geometrischen Formen wurden hergestellt und fluoreszierende Eisenoxid-MNPs wurden durch Keimbildung synthetisiert.

Magnetometrische Messungen der MNPs zeigen, dass die Magnetisierungskurve keine Hysterese, ein niedriges Sättigungsfeld und eine relativ hohe Magnetisierungssättigung aufweisen würde. PC12-Zellen wurden in einem Medium inkubiert, das mit den Eisenoxid-fluoreszierenden MNPs gemischt war, und sie in magnetische Einheiten umgewandelt. Die MNPs wurden in das Soma der Zellen verinnerlicht, aber nicht in die Kerne.

Die Eisenkonzentration in den Zellen stieg mit der Erhöhung der MNP-Konzentration im Medium. Die Lebensfähigkeit von MNP-geladenen PC12-Zellen für verschiedene Konzentrationen von MNPs wurde durch den Vergleich morphologischer Parameter von MNP-geladenen Zellen mit Shoal-Analyse bewertet, die keinen Unterschied zu Kontrollzellen zeigte. XTT- und Resazurin-basierte Assays bestätigten, dass die bewerteten Konzentrationen von MNPs keine signifikante Zytotoxizität gegenüber den Zellen zeigten.

PC12-Zellen mit und ohne MNP-Behandlung wurden auf einem magnetischen Substrat gezüchtet und differenziert. Es wurde festgestellt, dass sich die magnetisierten Zellen an die magnetischen Muster anheften und Äste entsprechend den Mustern wachsen, während Zellen ohne MNP-Behandlung ohne Affinität zu den magnetischen Geräten wuchsen. Die Positionierung von Zellen auf einem Substrat mit hexagonaler Geometrie wird hier gezeigt.

75% der mit MNP beladenen Zellkörper waren in Kontakt mit den Magnetstreifen, während sich nur 35% der unmagnetisierten Zellen auf den Streifen befanden. Zusätzlich zum Zellpositionierungseffekt wurde festgestellt, dass diese magnetischen Plattformen die Richtungsalität der wachsenden Neuriten steuern. Um die magnetische Wirkung auf die neuronale Wachstumsrichtung zu bewerten, wurde der Winkel zwischen den Neuriten und den Magnetstreifen gemessen, was eine signifikante Korrelation mit der Ausrichtung der Magnetstreifen zeigte.

Dieses Verfahren lässt sich leicht anpassen, um Wirkstoffe wie Medikamente nach der Konjugation zu magnetischen Nanopartikeln zu lenken. Sie können in Hochdurchsatz-Arzneimittel-Screening-Assays oder lokale Behandlungen in Geweben übersetzt werden. Dieser neuartige Ansatz eröffnet neue Möglichkeiten, andere Substrate oder Geräte durch Hinzufügen magnetischer attraktiver Strukturen zu funktionalisieren.

Derzeit entwickeln wir verbesserte biokompatible Neuronenchip-Schnittstellen.