Semi-quantitative Bestimmung der dopaminergen Neuronendichte in der Substantia Nigra von Nagetiermodellen mittels automatisierter Bildanalyse
2. Februar 2021
Hier stellen wir eine automatisierte Methode zur semi-quantitativen Bestimmung der dopaminergen Neuronenzahl in der Rattensubantia nigra pars compacta vor.
Die Abschätzung der dopaminergen Neuronenzahl in der Substantia nigra ist ein wichtiges Ergebnismaß in der Parkinson-Forschung. Dieses Protokoll verkürzt die Arbeitsbelastung, die zur Schätzung der Neuronenzahl erforderlich ist, erheblich. Diese Methode bietet einen zeiteffizienten und genauen Prozess zur Erkennung von Veränderungen der dopaminergen Neuronenzahl und eignet sich zur Bestimmung der Wirkung von Interventionen auf das Überleben der Zellen.
Diese Methode könnte leicht angepasst werden, um genaue Zählungen von Neuronen in verschiedenen Gehirnregionen zu liefern und gleichzeitig Kosten- und Zeitvorteile gegenüber herkömmlichen stereologischen Methoden zu erhalten. Um IHC-Bilder aufzunehmen, verwenden Sie die Software, die mit einem konfokalen Mikroskop bei 10-facher Vergrößerung gekoppelt ist. Öffnen Sie das Stiftloch auf 1,5 Flächeneinheiten, um eine breite Ebene von insgesamt 1,5 Mikrometern zu erfassen, und legen Sie den Fokus auf die injizierte Seite des Gehirns.
Aktivieren Sie auf der Registerkarte Erfassung die Option Kachelscan-Imaging und legen Sie die Abmessungen auf 10 x vier fest. Stellen Sie im Aufnahmemodusfenster den Zoom auf 1,1 ein, um Stichmarken zwischen den Kachelscanbildern zu vermeiden. Stellen Sie die Bildgröße auf 1024 x 1024 Pixel und die Mittelung auf zwei ein, um eine qualitativ hochwertige Bildaufnahme zu gewährleisten.
Stellen Sie im Kanalfenster track one auf Alexa 488 und track two auf Alexa 555 ein. Laden Sie den Dia auf die Bühne und wählen Sie einen Abschnitt mit einer starken TH-Färbung. Klicken Sie im Erfassungsbereich auf live.
Stellen Sie im Kanalbereich die Laserstärke und -verstärkung auf Pegel ein, die das Signal maximieren und das Hintergrundrauschen begrenzen. Verwenden Sie die Bereichsanzeige, um sicherzustellen, dass die Signale nicht überbelichtet werden. Wiederholen Sie dies mit mehreren Folien.
Aktivieren Sie auf der Registerkarte Erfassung das Kontrollkästchen Positionen. Um mit der Bildgebung zu beginnen, verwenden Sie das Okular und wählen Sie den ersten Abschnitt mit positiver TH-Färbung. Setzen Sie dann den Fokus auf den Point of Interest und verschieben Sie die Bühne in die Mittellinie des Abschnitts.
Dadurch wird die Position in den X-, Y- und Z-Achsen gespeichert und ein Kachelscan abgebildet, der den gesamten Abschnitt erfasst. Wiederholen Sie dies für alle anderen Folien, einschließlich einer nicht injizierten Site. Trennen Sie Bilddateien mit geeigneter Software und importieren Sie sie in eine automatisierte Bildanalysesoftware.
Definieren Sie einen bereich von Interesse, indem Sie das Stiftanmerkungswerkzeug auswählen, um eine Anmerkung um die substantia nigra pars compacta zu zeichnen. Wechseln Sie zur Registerkarte Analyse und wählen Sie im Dropdown-Menü Analyse die Option Echtzeitoptimierung aus. Dadurch wird ein separates Fenster auf dem Schnittbild geöffnet, das eine Echtzeitänderung der Analyseparameter ermöglicht.
Wählen Sie unter dem Abschnitt Analysevergrößerung den entsprechenden Bildzoom aus. Wählen Sie unter dem Abschnitt Zelldetektion kernen Farbstoff als Farbstoff aus, der für die TH-Färbung verwendet wird. Passen Sie die nukleare Kontrastschwelle, die minimale Nukleare Intensität, die Aggressivität der Kernsegmentierung und die Einstellungen für die Kerngröße an, während Sie das Zeitabstimmungsfenster sorgfältig beobachten.
Wiederholen Sie diesen Vorgang mit mehreren Beispielen. Sobald eine angemessene Anzahl von Bildern abgetastet und die Echtzeitabstimmung entsprechend angepasst wurde, speichern Sie die Analyseeinstellungen im Dropdown-Menü Einstellungsaktionen. Wählen Sie alle zu analysierenden Bilder aus und klicken Sie auf Analysieren.
Wählen Sie die Analyseeinstellung aus, die gerade gespeichert wurde, und aktivieren Sie im Analysebereich das Kontrollkästchen Anmerkungs-Layer, aktivieren Sie dann Layer eins und klicken Sie auf Analysieren. Sobald Sie fertig sind, exportieren Sie die zusammenfassenden Analysedaten für alle Abschnitte, indem Sie die Option zum Exportieren von Objektanalysedaten auswählen. Dieser Datensatz könnte verwendet werden, um Veränderungen der Zellgröße als Reaktion auf ein Toxin oder Therapeutikum zu untersuchen.
Sechs Wochen nach Adeno-assoziierten Virus- oder AAV-Injektionen führte die stereotaktische Injektion von AAV, das das mutierte A53T alpha-Synuclein exprimierte, in die Substantia nigra im Rattengehirn zu einer signifikanten Verringerung der Dichte dopaminerger Neuronen. Die mittlere Anzahl von TH-positiven Neuronen pro Millimeter im Quadrat in der Substantia nigra von Ratten, denen AAV-A35T injiziert wurde, war im Vergleich zu Ratten, denen der AAV-Leervektor injiziert wurde, signifikant verringert. Ähnliche Beobachtungen wurden mit unvoreingenommener Stereologie gemacht.
Wenn Sie dieses Protokoll versuchen, denken Sie daran, dass die Software nur so nützlich ist, wie sie trainiert wird. Daher muss Zeit und Sorgfalt darauf geachtet werden, dass eine einzelne Zelle als eine einzelne Zelle identifiziert wird. Die Software kann angepasst werden, um eine Fluoreszenzintensität anderer Proteine von Interesse wie Alpha-Synuclein zu messen, um festzustellen, ob Behandlungen den Proteinspiegel modulieren können.
Diese Technik hat eine höhere Effizienz ermöglicht, wenn die Wirkung mehrerer potenzieller Therapeutika auf die dopaminerge Neuronendichte getestet wurde.
Sehen Sie sich das vollständige Transkript an und erhalten Sie Zugang zu Tausenden wissenschaftlicher Videos
Überblick
Diese Studie präsentiert eine automatisierte Methode zur semi-quantitativen Bestimmung der Anzahl dopaminerger Neuronen in der Substantia nigra pars compacta der Ratte. Das Protokoll reduziert den Arbeitsaufwand erheblich und verbessert die Genauigkeit bei der Schätzung der Neuronenzahlen, was in der Parkinson-Forschung entscheidend ist.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Neurowissenschaften
- Psychiatrie
- Zellbiologie
Hintergrund
- Die Schätzung der Anzahl dopaminerger Neuronen ist für die Parkinson-Forschung von entscheidender Bedeutung.
- Traditionelle Methoden können zeitaufwendig und weniger genau sein.
- Automatisierte Methoden können Zeiteffizienz und Kostenvorteile bieten.
- Quantitative Veränderungen der Neuronenzahlen können therapeutische Wirkungen bewerten.
Zweck der Studie
- Eine Methode zur effizienten und genauen Erkennung der Anzahl dopaminerger Neuronen zu präsentieren.
- Forschern die Möglichkeit zu geben, Veränderungen der Neuronenzahlen aufgrund verschiedener Interventionen zu analysieren.
- Den Bildgebungs- und Datenanalyseprozess für dopaminerge Neuronen zu vereinfachen.
Verwendete Methoden
- Automatisierte Bildgebungsmethode unter Verwendung der Konfokalmikroskopie.
- Fokus auf die Substantia nigra pars compacta in einem Rattenmodell.
- Das Protokoll beinhaltet die Aufnahme von IHC-Bildern mit 10-facher Vergrößerung bei spezifischen Bildgebungseinstellungen.
- Echtzeit-Anpassung und Analyse neuronaler Bilder durch automatisierte Software.
- Eingeschlossene Datenanalyse für Veränderungen der Neuronendichte nach Intervention.
Hauptergebnisse
- Diese Methode zeigte signifikante Reduktionen der TH-positiven Neuronendichte nach AAV-Injektionen, die mutantes A53T alpha-Synuclein exprimieren.
- Die Ergebnisse zeigten eine Abnahme der Anzahl dopaminerger Neuronen im Vergleich zu Kontrollgruppen.
- Unvoreingenommene Stereologie wurde zur Validierung der Ergebnisse verwendet.
- Ermöglicht die Erkennung morphologischer Veränderungen als Reaktion auf therapeutische Interventionen.
Schlussfolgerungen
- Die Studie validiert eine effiziente Methode zur Quantifizierung dopaminerger Neuronen.
- Diese Technik verbessert das Verständnis des neuronalen Verlusts in Parkinson-Modellen.
- Die vorgestellten Methoden können die Erforschung therapeutischer Auswirkungen auf die Neuronendichte erleichtern.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Accurate quantification of dopaminergic neuron density in the substantia nigra is critical for preclinical Parkinson's disease research and therapeutic evaluation. Automated image analysis offers a scalable, time-efficient alternative to traditional stereology, enabling rapid assessment of neuroprotective interventions. This approach supports robust target validation and accelerates decision-making at key discovery inflection points.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative assessment of neuronal loss or protection in disease-relevant models.
- Supports functional validation of therapeutic targets by measuring intervention effects on cell survival.
- Facilitates mechanistic de-risking by providing objective, reproducible neuron counts.
Screening & Assay Development
- Prepares validated brain region assays for compound screening workflows.
- Standardizes neuron quantification, improving reproducibility and assay comparability.
- Delivers quantitative outputs suitable for high-throughput evaluation of multiple interventions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns preclinical readouts with disease-relevant endpoints for translational continuity.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on robust neuronal survival data.
- Supports biomarker development by quantifying protein expression changes alongside neuron counts.
Pipeline & Workflow Integration
This automated quantification method integrates from early discovery through preclinical validation, bridging target validation, screening, and translational research phases.
- Discovery Biology: Provides objective neuron density measurements for hypothesis testing and pathway analysis.
- Screening: Offers reproducible, scalable quantification for compound evaluation and assay development.
- Analytics: Generates exportable datasets for statistical comparison of experimental conditions.
- Translational Research: Maintains continuity of disease-relevant endpoints across the pipeline.
- Enterprise Reuse: Adaptable to other brain regions and protein markers, supporting broad R&D applications.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neurodegeneration studies.
- Operational Value: Streamlines workflows with automation, improving throughput and reproducibility.
- Strategic Value: Enables faster go/no-go decisions and more efficient resource allocation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of therapeutic candidates based on robust quantitative data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in confocal imaging and image analysis parameter optimization.
- Needs access to compatible microscopy and automated analysis software infrastructure.
- Demands careful cross-team standardization of imaging and analysis protocols.
- Adaptable across different brain regions and protein targets with appropriate validation.
- Accuracy depends on rigorous training and tuning of analysis software for single-cell identification.
