Name: Schaffung und Pflege einer lebenden Biobank - Wie wir es tun (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 8 s
Description: Erfahren Sie, wie eine lebende Biobank für kolorektale und pankreatische Krebserkrankungen aufgebaut und gepflegt wird. Das Protokoll umfasst Patienten-abgeleitete Xenografts (PDX), Primärzelllinien und Kryopräservierung für präklinische Präzisionsmedizin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wir würdigen Jenny Burmeister, unsere grafische Assistentin, für die Aufnahme und Bearbeitung des Videos. Darüber hinaus danken wir unseren Kollegen der chirurgischen und pathologischen Abteilung für die langjährige Zusammenarbeit. Wir danken auch Marcus Müller, Produktionsleiter des IT- und Medienzentrums der Universität Rostock, für die Lieferung der Tonaufnahmegeräte und die Verfeinerung der Klangqualität.
FINANZIERUNG: Die Deutsche Krebshilfe (DKH e.V.), Fördernummer 108446, und die Fördernummer TBI-V-1-241-VBW-084 des Landes Mecklenburg-Vorpommern haben diese Forschung teilweise finanziert.

<ol><li>Sartore-Bianchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PIK3CA+mutations+in+colorectal+cancer+are+associated+with+clinical+resistance+to+EGFR-targeted+monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">PIK3CA mutations in colorectal cancer are associated with clinical resistance to EGFR-targeted monoclonal antibodies.</a> Cancer research. 69 (5), 1851-1857 (2009).</li>
<li>Pauli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Personalized+In+Vitro+and+In+Vivo+Cancer+Models+to+Guide+Precision+Medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+discovery%22%5BJournal%5D)">Personalized In Vitro and In Vivo Cancer Models to Guide Precision Medicine.</a> Cancer discovery. 7 (5), 462-477 (2017).</li>
<li>Lipson, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+new+ALK+and+RET+gene+fusions+from+colorectal+and+lung+cancer+biopsies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">Identification of new ALK and RET gene fusions from colorectal and lung cancer biopsies.</a> Nature medicine. 18 (3), 382-384 (2012).</li>
<li>Wilding, J. L., Bodmer, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+cell+lines+for+drug+discovery+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">Cancer cell lines for drug discovery and development.</a> Cancer research. 74 (9), 2377-2384 (2014).</li>
<li>Mouradov, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colorectal+cancer+cell+lines+are+representative+models+of+the+main+molecular+subtypes+of+primary+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">Colorectal cancer cell lines are representative models of the main molecular subtypes of primary cancer.</a> Cancer research. 74 (12), 3238-3247 (2014).</li>
<li>Klier, U., Maletzki, C., Kreikemeyer, B., Klar, E., Linnebacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+bacterial-immunotherapy+with+therapeutic+antibodies%3A+a+novel+therapeutic+concept%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Combining bacterial-immunotherapy with therapeutic antibodies: a novel therapeutic concept.</a> Vaccine. 30 (17), 2786-2794 (2012).</li>
<li>DiMasi, J. A., Reichert, J. M., Feldman, L., Malins, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+approval+success+rates+for+investigational+cancer+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+pharmacology+and+therapeutics%22%5BJournal%5D)">Clinical approval success rates for investigational cancer drugs.</a> Clinical pharmacology and therapeutics. 94 (3), 329-335 (2013).</li>
<li>Gao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+using+patient-derived+tumor+xenografts+to+predict+clinical+trial+drug+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening using patient-derived tumor xenografts to predict clinical trial drug response.</a> Nature medicine. 21 (11), 1318-1325 (2015).</li>
<li>Mullins, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+Biobanking+and+Tumor+Model+Establishment+of+Human+Colorectal+Carcinoma+Provides+Excellent+Tools+for+Preclinical+Research%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Integrated Biobanking and Tumor Model Establishment of Human Colorectal Carcinoma Provides Excellent Tools for Preclinical Research.</a> Cancers. 11 (10), (2019).</li>
<li>Kuehn, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+HROC69+-+a+Crohn%27s+related+colonic+carcinoma+cell+line+and+its+matched+patient-derived+xenograft%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of HROC69 - a Crohn's related colonic carcinoma cell line and its matched patient-derived xenograft.</a> Scientific reports. 6, 24671(2016).</li>
<li>Dangles-Marie, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+human+colon+cancer+cell+lines+from+fresh+tumors+versus+xenografts%3A+comparison+of+success+rate+and+cell+line+features%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">Establishment of human colon cancer cell lines from fresh tumors versus xenografts: comparison of success rate and cell line features.</a> Cancer research. 67 (1), 398-407 (2007).</li>
<li>Gock, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+Take+Rate+Optimization+for+Colorectal+Carcinoma+Patient-Derived+Xenograft+Models%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+research+international%22%5BJournal%5D)">Tumor Take Rate Optimization for Colorectal Carcinoma Patient-Derived Xenograft Models.</a> BioMed research international. 2016, 11715053(2016).</li>
<li>Collins, A. T., Lang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+review+of+the+validity+of+patient+derived+xenograft+%28PDX%29+models%3A+the+implications+for+translational+research+and+personalised+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22PeerJ%22%5BJournal%5D)">A systematic review of the validity of patient derived xenograft (PDX) models: the implications for translational research and personalised medicine.</a> PeerJ. 6, 5981(2018).</li>
<li>Brown, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+xenograft+models+of+colorectal+cancer+in+pre-clinical+research%3A+a+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Patient-derived xenograft models of colorectal cancer in pre-clinical research: a systematic review.</a> Oncotarget. 7 (40), 66212-66225 (2016).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extent+of+inflammatory+infiltration+in+primary+cancer+tissues+is+associated+with+lymphomagenesis+in+immunodeficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">The extent of inflammatory infiltration in primary cancer tissues is associated with lymphomagenesis in immunodeficient mice.</a> Scientific reports. 5, (2015).</li>
<li>Moyer, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+murine+tumors+in+the+development+of+patient-derived+xenografts%3A+a+potential+pitfall%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Spontaneous murine tumors in the development of patient-derived xenografts: a potential pitfall.</a> Oncotarget. 10 (39), 3924-3930 (2019).</li>
<li>Prall, F., Maletzki, C., Hühns, M., Krohn, M., Linnebacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colorectal+carcinoma+tumour+budding+and+podia+formation+in+the+xenograft+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Colorectal carcinoma tumour budding and podia formation in the xenograft microenvironment.</a> PloS one. 12 (10), 0186271(2017).</li>
<li>Guenot, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+tumour+genetic+alterations+and+intra-tumoral+heterogeneity+are+maintained+in+xenografts+of+human+colon+cancers+showing+chromosome+instability%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">Primary tumour genetic alterations and intra-tumoral heterogeneity are maintained in xenografts of human colon cancers showing chromosome instability.</a> The Journal of pathology. 208 (5), 643-652 (2006).</li>
<li>Mattie, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+patient-derived+human+pancreatic+tumor+xenograft+models+for+preclinical+and+translational+development+of+cancer+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of patient-derived human pancreatic tumor xenograft models for preclinical and translational development of cancer therapeutics.</a> Neoplasia. 15 (10), New York, N.Y. 1138-1150 (2013).</li>
<li>Cho, Y. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colorectal+cancer+patient-derived+xenografted+tumors+maintain+characteristic+features+of+the+original+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+surgical+research%22%5BJournal%5D)">Colorectal cancer patient-derived xenografted tumors maintain characteristic features of the original tumors.</a> The Journal of surgical research. 187 (2), 502-509 (2014).</li>
<li>Maletzki, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Characterization+and+Drug+Response+of+Freshly+Established+Patient-Derived+Tumor+Models+with+CpG+Island+Methylator+Phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Functional Characterization and Drug Response of Freshly Established Patient-Derived Tumor Models with CpG Island Methylator Phenotype.</a> PloS one. 10 (11), 0143194(2015).</li>
<li>Katsiampoura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+of+Patient-Derived+Xenografts+in+Colorectal+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+cancer+therapeutics%22%5BJournal%5D)">Modeling of Patient-Derived Xenografts in Colorectal Cancer.</a> Molecular cancer therapeutics. 16 (7), 1435-1442 (2017).</li>
<li>Wege, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humanized+tumor+mice--a+new+model+to+study+and+manipulate+the+immune+response+in+advanced+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22International+journal+of+cancer%22%5BJournal%5D)">Humanized tumor mice--a new model to study and manipulate the immune response in advanced cancer therapy.</a> International journal of cancer. 129 (9), 2194-2206 (2011).</li>
<li>Herndler-Brandstetter, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humanized+mouse+model+supports+development%2C+function%2C+and+tissue+residency+of+human+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Humanized mouse model supports development, function, and tissue residency of human natural killer cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (45), 9626-9634 (2017).</li>
<li>Capasso, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+immune+responses+to+anti-PD-1+mono+and+combination+immunotherapy+in+hematopoietic+humanized+mice+implanted+with+tumor+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+for+immunotherapy+of+cancer%22%5BJournal%5D)">Characterization of immune responses to anti-PD-1 mono and combination immunotherapy in hematopoietic humanized mice implanted with tumor xenografts.</a> Journal for immunotherapy of cancer. 7 (1), 37(2019).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon%2C+adenoma%2C+adenocarcinoma%2C+and+Barrett%27s+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li>
<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+Development+and+Disease+with+Organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling Development and Disease with Organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li>
<li>Vlachogiannis, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+organoids+model+treatment+response+of+metastatic+gastrointestinal+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers.</a> Science. 359 (6378), New York, N.Y. 920-926 (2018).</li>
<li>Gao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+cultures+derived+from+patients+with+advanced+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer.</a> Cell. 159 (1), 176-187 (2014).</li>
<li>Drost, J., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+in+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Organoids in cancer research.</a> Nature reviews. Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).</li>
<li>Abe, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+phosphoproteomic+analysis+for+phosphosignaling+and+active-kinome+profiling+in+Matrigel-embedded+spheroids+and+patient-derived+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">Improved phosphoproteomic analysis for phosphosignaling and active-kinome profiling in Matrigel-embedded spheroids and patient-derived organoids.</a> Scientific reports. 8 (1), 11401(2018).</li>
<li>Neal, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+Modeling+of+the+Tumor+Immune+Microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Organoid Modeling of the Tumor Immune Microenvironment.</a> Cell. 175 (7), 1972-1988 (2018).</li>
</ol>

Die Schaffung einer lebenden Biobank setzt neben der Einhaltung der gesetzlichen Vorschriften des Datenschutzes, des Medizinrechts und des Tierschutzes eine gute Infrastruktur und ein gut koordiniertes Team voraus. Es hat sich als vorteilhaft erwiesen, einen Teil des chirurgischen Personals direkt in die Forschungsverfahren einzubeziehen, da sie sehr gut die Eignung des einzelnen Patienten für eine Gewebespende beurteilen können. Darüber hinaus neigen Patienten dazu, häufiger mit Biobanking zu vereinbaren, wenn ihre schriftliche Genehmigung im Rahmen der chirurgischen Informiertkeitsdiskussion eingeholt wird. Um Zeit und Ressourcen zu sparen, sollten Fälle, die vermutlich zu wenig Tumorgewebe führen, nicht für das Biobanking ausgewählt werden. Wenn es um den Erwerb von Exemplaren geht, ist die Maxime "Kommunikation ist der Schlüssel" eine einfache, aber oft übersehene Wahrheit. Es braucht nur eine einzige uninformierte Theaterschwester oder einen chirurgischen Kollegen, um die Probe gleich zu Beginn zu ruinieren, indem sie wie gewohnt voranschreitet und der Resektionsprobe Formaldehyd hinzufügt. Daher ist es absolut entscheidend, dass jeder einzelne Mitarbeiter das SOP für Biobanking kennenlernt. Chirurgen sollten am Vortag und direkt zu Beginn des Eingriffs über geplante Gewebeentnahme bemerkt werden. Darüber hinaus sollten Fälle, die für das Biobanking ausgewählt wurden, im elektronischen OR-Plan hervorgehoben werden. Die Gewebeentnahme aus der chirurgischen Probe sollte von einem Pathologen durchgeführt werden. Erstens wird dadurch sichergestellt, dass die Gewebeernte den endgültigen pathologischen Bericht nicht beeinträchtigt. Zweitens erhöht dies die Wahrscheinlichkeit, Gewebe mit ausreichenden Mengen an lebensfähigem Krebsgewebe zu erhalten. Vor allem bei Bauchspeicheldrüsenkrebs mit ausgeprägter desmoplastischer Reaktion und häufigen nekrotischen Bereichen sind lebensfähige Teile für das ungeübte Auge makroskopisch schwer zu identifizieren. Als Ausnahme von dieser Regel können Gewebeblöcke aus großen Leber- oder Lungenmetastasen vom Chirurgen manchmal "Back-Table" ausgeschnitten werden, wenn chirurgische Ränder makroskopisch definiert werden können. Rektalkrebs, der durch die totale mesorektale Exzision (TME) reseziert wird, ist möglicherweise nicht für Biobanking geeignet, da die Gewebeernte aus dem resezierten Exemplar vor der Paraffineinbettung die TME-Qualitätsbewertung beeinträchtigen könnte. Alternativ kann Gewebe für Biobanking durch transanale Biopsie von Rektalkrebs erworben werden.
Die Etablierungsraten für primäre Zellkulturen, die aus dem ursprünglichen Tumor abgeleitet sind, sind im Allgemeinen niedrig. PDX-abgeleitete, sekundäre Zellkulturen können mit größerer Wahrscheinlichkeit erfolgreich etabliert werden. Wir empfehlen, die Prüfung verschiedener Medien für jeden Fall und die Verwendung von Antibiotika-Ergänzungen für die ersten Passagen, um die Kontamination auf ein Minimum zu reduzieren, da das geerntete Gewebe selten steril ist. Nach erfolgreicher Vermehrung sollte jede einzelne Zelllinie durch FACS-Analyse als Krebszelllinie bestätigt und regelmäßig auf Mykoplasmenkontamination getestet werden. Um Kreuzkontaminationauszuschließen auszuschließen, ist eine regelmäßige STR-Analyse ratsam. Es sei darauf hingewiesen, dass das Gründungsprotokoll für primäre und sekundäre Zelllinien ständig optimiert wird. Einzelheiten zur Zusammensetzung und Erfolgsquote der einzelnen Medien gehen eindeutig über den Rahmen dieser Arbeit hinaus und werden gesondert veröffentlicht.
Für die PDX-Engraftment, Tumorgewebe kann entweder direkt nach resektion implantiert werden oder Kryopinserviert in fetalen Kalve Serum mit 10% DMSO oder ähnliche Gefriermedien für verzögerte Implantation. Die Implantation unmittelbar nach der Tumorgewebeernte belastet Logistik- und Laborpersonal, und die Xenografting-Ergebnisse nach der Kryokonservierung sind überhaupt nicht schlechter 10. Darüber hinaus erhöht die Inkubation des Gewebes in Matrigel vor der Tumorimplantation die Engraftmentraten signifikant12. Wir empfehlen eine verzögerte Engraftmentierung nach einem bestimmten pathologischen Befund und der sofortigen Entsorgung irrtümlich gesammelter Gewebeproben. Da die Erfolgsrate der primären Engraftment mit Immunschwäche der Empfängermaus zunimmt, neigen wir dazu, NSG-Mäuse für die allererste PDX-Passage zu verwenden. Nach der ersten erfolgreichen PDX-Transplantation können und solltenNMRI-Nu-/Nu-Mäuse für nachfolgende Passagen und Gewebeausdehnungen eingesetzt werden. Dieser Stamm ist robuster, billiger und leichter zu züchten im Vergleich zu NSG oder ähnlichen immundefizienten Stämmen, zeigt aber dennoch vernünftige Einpfroplegungsraten. Darüber hinaus erleichtert seine Nacktheit die Implantation und Tumorwachstumsüberwachung. Um die Eindrortierraten in nachfolgenden Passagen zu erhöhen, empfehlen wir, frisch geerntetes PDX-Gewebe nach Möglichkeit direkt an Wirtmäuse zu übertragen, insbesondere bei langsam wachsendem PDX und Fällen mit einer niedrigen Primärentransplantationserfolgsrate. Collins und Lang überprüften kürzlich 14 Studien der kolorektalen PDX-Einrichtung und berichteten, dass die Transplantationsraten zwischen 14 und 100% mit einer medianen PDX-Niederlassungsrate von 68% schwankten, wobei letztere mit unseren Ergebnissenübereinstimmt13. Im Einklang mit der Literatur beobachteten wir niedrigere Etablierungsraten von Bauchspeicheldrüsen im Vergleich zu Dickdarmkrebs PDX14. Unabhängig von der Wirtsmaus-Stamm und Tumor-Entität, das Wachstum des menschlichen, Epstein-Barr Virus (EBV)-assoziierten B-Zell-Lymphome und murine Lymphome auf der Implantationsseite stellt eine wichtige Falle15,16. Wenn sie nicht erkannt werden, können solche Tumoren nachfolgende Passagen "kontaminieren" und somit aufeinander folgende Ergebnisse verwirren. Ungewöhnlich schnelles PDX-Wachstum und Schwellung von Zervix-, Axillar- und Leistenlymphknoten sind starke Indikatoren für das murine Lymphomwachstum, aber eine regelmäßige histologische Untersuchung von PDX ist dennoch ratsam. Darüber hinaus sollte die genetische Konkordanz zwischen PDX und dem entsprechenden Spenderpatienten regelmäßig durch STR-Analyse getestet werden. Idealerweise sollte die Biobank mit einer klinischen Datenbank verknüpft werden, die Patientenmerkmale (allgemeine Informationen, Überleben, rückfallfreies Überleben, Therapie, sekundäre Neoplasie usw.) umfasst. Aufgrund gesetzlicher Bestimmungen zum Schutz der Privatsphäre und des Fehlens einer solchen anonymisierten Datenbank wird unser klinischer Datensatz regelmäßig von den kooperierenden Ärzten manuell verwaltet und aktualisiert.
Während konventionelle Biobanken auf die Beobachtungsforschung beschränkt sind, bietet eine lebende Biobank die Möglichkeit für In-vitro- und In-vivo-Interventionen. Patienten-abgeleitete Zelllinien sind ein wichtiges Instrument für die Grundlagenforschung, Hochdurchsatz-Arzneimittelscreenings und die Bewertung neuer pharmazeutischer Wirkstoffe4. Entsprechende PDX-Modelle sind jedoch von zunehmender Bedeutung, da sie die Histologie des ursprünglichen Tumors17,18 eng rekapitulieren und eine hohe genetische Stabilität über mehrere Passagen19,20zeigen. Unsere PDX Biobank hat sich als hervorragende Plattform für präklinische und Fundamentalforschung6,21bewährt. Da große PDX-Sammlungen die interindividuelle Heterogenität der Patientenpopulation angemessen widerspiegeln, hat der PDX-Ansatz der klinischen Studie (PCT) (ein Tier pro Modell pro Behandlung) an Bedeutung für die Arzneimittelentwicklung gewonnen, da er die originalgetreue Vorhersage der klinischen Reaktion auf neue Medikamente und das kombinatorische Regime8ermöglicht. Wir evaluieren derzeit auch neue experimentelle Medikamente in kleinen PCT-Studien.
Trotz dieser vielversprechenden Ergebnisse behindert die mediane Betriebsdauer von 12,2 Monaten die klinische Anwendbarkeit von PDX-Modellen als "Avatarmäuse" zur Prüfung von Behandlungsmöglichkeiten gegen Krebs, zumindest für Patienten, die eine sofortige adjuvante oder sogar neoadjuvante Behandlung benötigen22. Ein weiterer Nachteil von Standard-PDX-Modellen ist die mangelnde Nutzbarkeit für Immuntherapietests aufgrund der Immunschwäche von Wirtsmäusen. Um diese Einschränkungen zu überwinden, wurden mehrere "humanisierte" Mausstämme entwickelt. Diese Mäuse sind stark immungeschwächt, können aber mit verschiedenen Arten von menschlichen Knochenmark-abgeleiteten Zellen oder CD34+ hämatopoetischen Stammzellen nach PDX-Auswuchs23rekonstituiert werden, was die Bewertung der lymphozyten-vermittelten Zytotoxizität und der Therapiereaktion auf die Behandlung von Immun-Checkpoint-Hemmern24,25ermöglicht.
In den letzten Jahren haben sich patientenabgeleitete Organoide (g.U.) als wichtige Krebsmodelle im Wettbewerb mit PDX herausgebildet. Diese dreidimensionalen Strukturen, die aus intakten Tumorstücken abgeleitet und in einem extrazellulären Matrixgerüst kultiviert werden, spiegeln die histologischen und genetischen Eigenschaften des ursprünglichen Tumors genau wider. Die Möglichkeit der langfristigen Expansion und Kryokonservierung macht g.A. zu einer idealen Ergänzung einer lebenden Biobank26,27. Zusätzlich zu einer relativ hohen Etablierungsrate wurde eine zuverlässige Vorhersage der Arzneimittelansprechung für die g.A. mehrerer Tumorentitäten berichtet28. Darüber hinaus wurden sogar PDOs aus zirkulierenden Tumorzellen erzeugt und auch die gleichzeitige Etablierung von Organoiden aus entsprechendem gesundem Gewebe ist möglich, was eine Beurteilung der therapiebedingten Toxizität auf Patienten-individueller Basisermöglicht 29,30. Im Vergleich zu herkömmlichen 2D-Zellkulturen ist die organoide Kultur jedoch zeitaufwändig und künstliche extrazelluläre Matrixverbindungen können bestimmte analytische Verfahren stören31. Darüber hinaus sind Krebsorganoide anfällig für Überwucherung durch schneller wachsende, nicht bösartige Organoide, die aus gesundem Epithel abgeleitet sind30. Aufgrund des Mangels an Stroma, Blutgefäßen und Immunzellen sind PDOs meist nicht anwendbar für die Prüfung von antiangiogenen Immuntherapeutika. Doch neue Kultivierungsmethoden ermöglichen die Modellierung von Tumormikroumgebungen in vitro,was PDOs zu einem echten Anwärter für PDX-Modelle32macht. In naher Zukunft werden patientenindividuelle Tumormodelle, kombiniert mit leistungsstarken genetischen Werkzeugen wie der Sequenzierung der nächsten Generation, hoffentlich den Weg zu echter Präzisionsmedizin und maßgeschneiderten Behandlungsansätzen ebnen.

In den letzten Jahren führte das angesammelte Wissen über die morphologischen, klinischen und genetischen Eigenschaften von Krebs zur Empfängnis als heterogene, individuelle Krankheit. Folglich hat die mutationale Charakterisierung von Neoplasmen neben klinischen und pathologischen Merkmalen an Bedeutung für die klinische Entscheidungsfindung gewonnen und viele gezielte Therapien wurden für verschiedene molekulare Veränderungen entwickelt. Zum Beispiel kann die Wirksamkeit von Cetuximab in der Darmkrebsbehandlung durch die Analyse des KRAS- und PIK3CA-Mutationsstatus 1vorhergesagt werden. Die Präzisionsmedizin zielt auf einen maßgeschneiderten Ansatz ab, um bei jedem Patienten die höchste Behandlungsreaktion zu bieten und Toxizität von inefficacious Therapien zu vermeiden2. Biobanken enthalten Gewebe, Blut und andere biologische Materialien von Krebspatienten, die mit den klinischen Daten verknüpft sind und somit ein hervorragendes Werkzeug für die translationale Krebsforschung sind. Aufgrund der großen Anzahl klinischer Proben ermöglichen Biobanken den Nachweis seltener, aber potenziell medikamentöser Mutationen, was dem einzelnen Patienten neue Behandlungsmöglichkeiten bietet3.
Um ein möglichst breites onkologisches Forschungsspektrum abzudecken, haben wir unsere Aktivität bei der Probenentnahme nicht allein eingeschränkt, sondern uns auf die Etablierung von vom Patienten abgeleiteten Krebszelllinien und Xenografts (PDX) konzentriert. Traditionelle 2D-Zelllinien bleiben der Eckpfeiler der In-vitro-Forschung und sind die erste Wahl für groß angelegte Arzneimittelscreenings4,5. Darüber hinaus ist die Zelllinienanalyse oft einfacher, billiger und leichter verfügbar. Da patientenabgeleitete periphere Blutlymphozyten (PBL) zur Verfügung stehen, kann auch die Tumorimmunologie in vitro6untersucht werden. Die Mehrheit der neu entwickelten Medikamente mit vielversprechender präklinischer Wirksamkeit in zellbasierten In-vitro- oder In-vivo-Experimenten haben jedoch enttäuschende Ergebnisse in klinischen Studien gezeigt7. Im Gegensatz dazu haben präklinische Studien auf basis von PDX in vivo-Studien die klinische Aktivität antineoplastischer Wirkstoffe viel getreuer widergespiegelt8. Da PDX-Gewebe die histologischen und molekularen Eigenschaften des Spendertumors genau widerspiegelt, sind PDX-Modelle eine gute Möglichkeit, die oft sehr begrenzten Mengen an lebensfähigem Tumorgewebe zu vermehren, um die Integrität einer Biobank zu erhalten und den Austausch von Proben zwischen Forschungsgruppen und Institutionen zu ermöglichen. Darüber hinaus können Aus PDX-Gewebe gewonnene Krebszelllinien deutlich einfacher festgestellt werden als primäre Krebszelllinien9. In den letzten Jahren hat unsere Arbeitsgruppe eine umfassende integrierte Biobank für Dickdarm- und Bauchspeicheldrüsenkrebs eingerichtet, indem der Arbeitsablauf für alle betreffenden biologischen Proben schrittweise standardisiert und optimiert wurde (Abbildung 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62065/62065fig01.jpg"> Abbildung 1:Workflow und Organisation der Biobank <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62065/62065fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

<table><tbody><tr><td>Bacillol&reg; AF; 1L</td><td>Bode, Hartmann</td><td>REF 973380</td><td>Desinfektion</td></tr><tr><td>PP Zentrifugenröhrchen, 15ml; steril</td><td>Greiner Bio One</td><td>GBO Cat. Nr.:188271</td><td>Zentrifugenröhrchen</td></tr><tr><td>PP Zentrifugenröhrchen, 50ml, steril</td><td>Sarstedt</td><td>Artikel-Nr.: 62.547.254</td><td>Zentrifugenröhrchen</td></tr><tr><td>BD DiscarditTM II Spritze 20ml</td><td>BD</td><td>REF 300296</td><td>Blutentnahme</td></tr><tr><td>Serum 7,5ml Sarstedt Monovette</td><td>Sarstedt</td><td>Artikelnummer: 01.1601</td><td>Blutentnahme</td></tr><tr><td>serologische Pipette 10ml</td><td>Sarstedt</td><td>REF 86.1254.001</td><td>Transfer für Flüssigkeiten</td></tr><tr><td>Pipetboy ratiolab&reg; accupetta</td><td></td><td>Ratiolab Artikelnummer: RL3200300</td><td>Transfer für Flüssigkeiten</td></tr><tr><td>PIPETBOY acu 2</td><td>Integra Biosciences</td><td>VWR Cat.No: 613-4438</td><td>Transfer für Flüssigkeiten</td></tr><tr><td>DPBS; ohne Ca & Mg</td><td>Pan Biotech</td><td>Kat. Nr.: P04-36500</td><td>Waschen</td></tr><tr><td>Pancoll human</td><td>Pan Biotech</td><td>Cat. Nr.: P04-60500</td><td>Dichtegradientenzentrifugation</td></tr><tr><td>DMEM/F12 (Dulbecco' s modifizierter Eagle Medium)</td><td>PAN Biotech</td><td>Kat. Nr.: P04-41500</td><td>Zellkultivierung</td></tr><tr><td>FBS Good Forte (filtriertes Rinderserum)</td><td>PAN Biotech</td><td>Cat. Nr.: P40-47500</td><td>Zellkultivierung</td></tr><tr><td>L-Glutamin 200mM</td><td>PAN Biotech</td><td>Cat. Nr.: P04-80100</td><td>Zellkultivierung</td></tr><tr><td>Trypsin / EDTA</td><td>PAN Biotech Cat</td><td>. Nr.: P10-023100</td><td>Zellkultivierung</td></tr><tr><td>DMSO (Dimethylsulfoxid für die Zellkultur)</td><td>PanReac AppliChem</td><td>VWR Cat.No: A3672.0250</td><td>Zelleinfrieren</td></tr><tr><td>Tiefkühlmedium (FCS mit 10% DMSO)</td><td>selbstgemacht</td><td>---</td><td></td>Zellgefrier-Kryoröhrchen</tr><tr><td>- CryoPure 2ml</td><td>Sarstedt</td><td>72380</td><td>Zelleinfrieren</td></tr><tr><td>6-Well-Zellkulturplatte; steril; mit Deckel</td><td>Greiner bio-one</td><td>Kat.-Nr.: 657 160</td><td>Zellkultivierung</td></tr><tr><td>Petrischale 92 x 16 mm, PS, ohne Nocken</td><td>Sarstedt</td><td>Kat. Nr.: 82.1472.001</td><td>Gewebepräparation</td></tr><tr><td>sterile chirurgische Klingen</td><td>B.Braun (Aesculap)</td><td>REF BB510</td><td>Gewebepräparation</td></tr><tr><td>BD DiscarditTM II Spritze 10ml</td><td>BD</td><td>REF 309110</td><td>Gewebepräparation</td></tr><tr><td>Zellsieb; gelb; 100&micro; m</td><td>Falcon</td><td>REF 352360</td><td>Gewebepräparation</td></tr><tr><td>CoolCell</td><td>Biocision</td><td>Artikelnummer: 210004</td><td>Kühlbehälter mit -1&deg; C/min</td></tr><tr><td>Dewar&nbsp; Transportbehälter Typ 27 B, 2 l, 138 mm</td><td>KGW</td><td>Kat. Nr.: HT39.1</td><td>Transportsystem</td></tr><tr><td>Pipettenspitze 200&micro; l</td><td>Sarstedt</td><td>REF 70.760.002</td><td>Flüssigkeitstransfer</td></tr><tr><td>Filterspitze 1000&micro; l</td><td>Sarstedt</td><td>REF 70.762.411</td> Pipette <td>für Flüssigkeitstransfer</td></tr><tr><td>200&micro; l, gelb</td><td>Eppendorf</td><td>Kat. Nr.: 3121 000.082</td><td></td></tr><tr><td>Pipette für Flüssigkeitstransfer 1000&micro; l, blau</td><td>Eppendorf</td><td>Kat. Nr.: 3121 000.120</td> Inkubator <td>für Flüssigkeitstransfer</td></tr><tr><td>&nbsp; BB 6220 CU</td><td>Heraeus</td><td>Kat.-Nr.: 51012839</td><td>Zellkultivierungs-Heizplatte</td></tr><tr><td>PR&Auml; ZITHERM</td><td>Harry Gestigkeit GmbH</td><td>---</td><td></td></tr><tr><td>Heizmikroskop Zeiss Primo Vert</td><td>Carl Zeiss MicroImaging GmbH</td><td>Seriennummer 3842000839</td><td>bildgebende Zellkulturen</td></tr><tr><td>Steriler Tisch Sicherer Durchfluss 1.8 nunc</td><td>nunc GmbH & Co. KG</td><td></td>---<td>steriler Arbeitstisch</td></tr><tr><td>Gefrierschrank -80&Grad; C</td><td>Kryotec-Kryosafe GmbH</td><td>---</td><td>Probenlagerung</td></tr><tr><td>Elektronische Waage MP-300</td><td>Chyo</td><td>---</td><td>Scale</td></tr><tr><td>BD Micro-fine, U100 Insulinspritze</td><td>BD</td><td>REF 324826</td><td>Injektionsanästhetikum</td></tr><tr><td>Rompun 2%; 25ml</td><td>Bayer</td><td>Zulassungsnummer: 6293841.00.00</td><td>Anästhesie</td></tr><tr><td>Ketamin 100 mg/ml, 25ml</td><td>CP-Pharma GmbH</td><td>Zulassungsnummer: 401650.00.00</td><td>Anästhesie</td></tr><tr><td>GES3S Reader</td><td>Datamars</td><td>nicht verfügbar</td><td>RFID</td></tr><tr><td>Reader ISO-Transponder FDX-B (1,4x8mm)</td><td>Peddymark</td><td>---</td><td>RFID Chip</td></tr><tr><td>Cotrim-ratiopharm&reg; &nbsp; Ampullen SF 480&nbsp; mg/5&nbsp; ml</td><td>Ratiopharm</td><td>PZN-03928197</td><td>Antibiotikum Trinkwasser</td></tr><tr><td>Heizplatte #FM-20 42x28cm</td><td>Drachen</td><td></td><td>---Heizung</td></tr><tr><td>Heizlampe</td><td>Elektrisch Petra, Burgau</td><td>---</td><td>Heizung</td></tr><tr><td>Salbe für Augen und Nase (5% Dexpanthenol) Bepanthen</td><td>Bayer</td><td>PZN-01578675</td><td>Augenschutz</td></tr><tr><td>Anatomische Pinzette</td><td>B.Braun Aesculap</td><td>BD21 ODER</td><td>Chirurgische Instrumente</td></tr><tr><td>chirurgische Pinzette</td><td>B.Braun Aesculap</td><td>BD50 1 R</td><td>Schere für chirurgische Instrumente</td></tr><tr><td></td><td>B.Braun Aesculap</td><td>BC05 6R</td><td>Nadel für chirurgische Instrumente</td></tr><tr><td>&nbsp; Halter</td><td>B.Braun Aesculap</td><td>BH1 1 ODER</td><td>chirurgische Instrumente</td></tr><tr><td>Prolene 5-0</td><td>Ethicon</td><td>XN8870. P32</td><td>chirurgisches Nahtmaterial</td></tr><tr><td>Gegenüberliegender Feuchtigkeitsdampf permable Sprühverband</td><td>Smith& Neffe</td><td>REF 66004978, PZN- 02063507</td><td>chirurgisches Nahtmaterial</td></tr><tr><td>Adhäsives Öffnungstuch</td><td>Barriere</td><td>REF 904622</td><td>steril OP Gewebe</td></tr><tr><td>Mullwechsel Gazin&reg;; steril; 10x10</td><td>cm Lohmann& Rauscher</td><td>REF 18506</td><td>steriles OP-Gewebe</td></tr><tr><td>Raucotupf Applikatoren mit Wattespitze</td><td>Lohmann& Rauscher</td><td>REF 11969</td><td>Applikator</td></tr><tr><td>Corning&reg; Matrigel Basalmembran</td><td>Matrix Corning</td><td>Kat.-Nr.: 354234</td><td>Basalmembran Matrix</td></tr><tr><td>Jodlösung Braunol (7,5g Povidonjod)</td><td>B.Braun Melsungen AG</td><td>Artikelnummer: 18839</td><td>Desinfektion</td></tr><tr><td>MACS&reg; Aufbewahrungslösung für Gewebe</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>Bestell-Nr.:130-100-008</td><td>Aufbewahrungslösung</td></tr><tr><td>Formafix 4%</td><td>Grimm med. Logistik GmbH</td><td>Artikelnummer: F10010G</td><td>Fixierlösung</td></tr><tr><td>Software FreezerworksBasic</td><td>Dataworks Development, Inc</td><td>---</td><td>Musterorganisation</td></tr><tr><td>Zebra TLP 2844 Drucker</td><td>Zebra</td><td>---</td><td>Etikettendrucker</td></tr></tbody></table>

schaffung und pflege einer lebenden biobank - wie wir es tun

Creation and Maintenance of a Living Biobank - How We Do It

Angesichts des wachsenden Wissens über die interindividuellen Eigenschaften und heterogenität von Krebserkrankungen erfordert das aufkommende Feld der personalisierten Medizin eine Plattform für präklinische Forschung. In den letzten Jahren haben wir eine Biobank von Dickdarm- und Bauchspeicheldrüsenkrebs gegründet, die aus primärem Tumorgewebe, normalem Gewebe, Seren, isolierten peripheren Blutlymphozyten (PBL), patientenabgeleiteten Xenografts (PDX) sowie primären und sekundären Krebszelllinien besteht. Da das ursprüngliche Tumorgewebe begrenzt ist und die Etablierungsrate der primären Krebszelllinien immer noch relativ niedrig ist, ermöglicht PDX nicht nur die Erhaltung und Erweiterung der Biobank, sondern auch die Erzeugung von sekundären Krebszelllinien. Darüber hinaus haben sich PDX-Modelle als das ideale In-vivo-Modell für präklinische Arzneimitteltests erwiesen. Biobanking erfordert jedoch eine sorgfältige Vorbereitung, strenge Richtlinien und eine gut abgestimmte Infrastruktur. Colektomie, Duodenopanatomie oder resezierte Metastasenproben werden unmittelbar nach der Resektion gesammelt und in die Pathologieabteilung übertragen. Unter Berücksichtigung der Priorität eines unvoreingenommenen histopathologischen Berichts werden nach Ermessen des behandelnden Pathologen, der die Sezierungen durchführt, kleine Tumorstücke und Nicht-Tumorgewebe geerntet. 
Nekrotische Teile werden verworfen und das verbleibende Tumorgewebe in kleine, identische Würfel geschnitten und für den späteren Gebrauch kryokonserviert. Zusätzlich wird ein kleiner Teil des Tumors gehackt und für die primäre Krebszellkultur belastet. Zusätzlich werden Blutproben, die vom Patienten vor- und postoperativ entnommen werden, verarbeitet, um Serum und PBLs zu erhalten. Für die PDX-Engraftment werden die kryokonservierten Proben aufgetaut und subkutan in die Flanken immundefiziierter Mäuse implantiert. Das resultierende PDX rekapituliert die Histologie der "Spender"-Tumoren eng und kann entweder für die nachfolgende Xenogtransplantation oder kryopreserviert für die spätere Anwendung verwendet werden. In der folgenden Arbeit beschreiben wir die einzelnen Schritte der Schaffung, Wartung und Verabreichung einer großen Biobank von Dickdarm- und Bauchspeicheldrüsenkrebs. Darüber hinaus weisen wir auf die entscheidenden Details und Vorbehalte im Zusammenhang mit dem Biobanking hin.

In unseren Händen betrug die Etablierungsrate der primären Zellkulturen (Abbildung 2A &amp; B) 12,9 % in einer großen Serie9. Die meisten Versuche, erweiterbare Tumorzellen von frischen chirurgischen resektierten Proben zu isolieren, scheiterten an einem Mangel an Wachstum oder frühzeitiger Kontamination. Die Zelllinieneinrichtung wurde nach 3 Passagen mit stetigem Wachstum unter Standardkulturbedingungen (DMEM, 10% FCS, Standardkulturgefäß) und Validierung der epitheliaalen Differenzierung mittels FACS-Analyse10als erfolgreich angesehen. Zelllinien, die von PDX-Tumoren abgeleitet wurden (Abbildung 2C &amp; D) zeigten eine höhere Etablierungsrate von 23,6 %, was auch auf die Möglichkeit sich wiederholender Versuche im Gegensatz zu primären resektierten Tumoren9zurückzuführen ist. Einige Mischkulturen (Abbildung 2E) können jedoch nicht von fibroblastischem Wachstum befreit werden oder gehen sogar durch fibroblastisches Überwuchern verloren (Abbildung 2F).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62065/62065fig02.jpg"> Abbildung 2:Zellkultur. Primäre Krebszelllinien, abgeleitet aus einer Metastasierung des Dickdarmkrebsfalls HROC313, Durchgang 21 (A) und Bauchspeicheldrüsenkrebs Fall HROP88, Durchgang 5 (B). PDX-abgeleitete Krebszelllinien des Dickdarms PDX HROC285 T0 M2 (D) und der Bauchspeicheldrüse PDX HROP10 T5 M2, Durchgang 4 (E). Gemischte Kultur von Fibroblasten und Krebszellen aus Bauchspeicheldrüsenkrebs HROP75, Durchgang 8 (C) und fibroblastischem Überwucherung (F). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62065/62065fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Angesichts von Änderungen im PDX-Generierungsprotokoll, verwendeten Mausstämmen und auch Experimentatoren über mehrere Jahre sowie großer Unterschiede in der Menge an Tumorgewebe, die für die Engraftierung zur Verfügung stehen, ist es nicht trivial, die Gesamterfolgsrate der PDX-Generation zu erhalten. In einer sehr aktuellen Reihe von PDX-Generierungsexperimenten, die von zwei Forschern (S.M. und F.B. durchgeführt wurden), wurden primäre Auswuchsraten von 63% für kolorektales PDX (eine beispielhafte Histologie kann aus Abbildung 3Adargestellt) und 48% für Bauchspeicheldrüsen-PDX (Abbildung 3B) beobachtet. Das Wachstum von murinen oder menschlichen Lymphomen an der Implantationsstelle ist relativ selten, kann aber erfolgreiches PDX-Auswuchs imitieren (Abbildung 3C). Neben der histopathologischen Untersuchung wurde die Übereinstimmung zwischen PDX-Modellen und ihren Spenderpatienten regelmäßig durch eine kurze Tandem-Wiederholungsanalyse (STR) bestätigt (Abbildung 3D). Bis heute umfasst die Biobank &gt;50 primäre und &gt;50 sekundäre kolorektale, 3 primäre und 6 sekundäre Bauchspeicheldrüsenkrebszelllinien sowie &gt;150 kolorektalen und 19 Pankreas-PDX-Modellen.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62065/62065fig03.jpg"> Abbildung 3: Repräsentativer histologischer Vergleich von kolorektaler (A) und Pankreas-PDX (B). Humanes Lymphom an der Implantationsstelle, das PDX-Auswuchs (C) imitiert. Genetische Identitätsprüfung eines PDX-Modells (HROC430 T1 M2) am ursprünglichen Patiententumorgewebe (HROC430Tu) durch kurze Tandem-Wiederholungsanalyse (STR). Vergleich der neun STR loci, vWA, THO1, TPOX, CSF1 PO (FAM Farbstoff) und D5S818, D13S317, D7S820, D16S539 (HEX Farbstoff) mit Multiplex-PCR mit fluoreszierenden Primern nach kapillarer Elektrophorese bestätigte genetische Konkordanz des PDX und des Tumors (D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62065/62065fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

In der folgenden Arbeit beschreiben wir die aufeinanderfolgenden Schritte, die für die Errichtung einer großen Biobank von Dickdarm- und Bauchspeicheldrüsenkrebs notwendig sind.

Schaffung und Pflege einer lebenden Biobank - Wie wir es tun

In light of the growing knowledge about the inter-individual properties and heterogeneity of cancers, the emerging field of personalized medicine requires ...

Schaffung und Pflege einer lebenden Biobank, wie wir es tun. Einleitung. Herkömmliche Biobanken enthalten in der Regel nicht lebensfähige Gewebe- und Blutproben. Obwohl sie die Vielfalt der Krebspatientenpopulationen angemessen widerspiegeln und genetische und histologische Analysen ermöglichen, sind sie für präklinische Tests zur Bewertung therapeutischer Strategien ungeeignet.Eine Biobank, die auch patientenabgeleitete Modelle integriert, überwindet diese Einschränkungen. Damit können Funktionstests für die Präzisionsmedizin durchgeführt werden. Stichprobenerfassung.Für Biobanking von Dickdarm- und Bauchspeicheldrüsenkrebs, Wahlfälle mit nachgewiesener Diagnose sowie ausreichende Tumorgröße, ist eine informierte Konzentrat des Patienten obligatorisch. Vor Beginn der Operation 20ml Blut mit einer heparinisierten Spritze und weitere 7,5 ml mit einer Serummonovette ziehen. Serumverarbeitung und PBL-Isolierung.Nach zentrifugieren bei 1, 128 RCF für 15 Minuten bei vier Grad wird das Serum in einem vorbeschrifteten Kryotube aliquoted und direkt in flüssigen Stickstoff getaucht. Das heparinisierte Blut wird in ein Polypropylen-Rohr übertragen und mit 15ml PBS verdünnt. Verwenden Sie eine serologische Pipette, um die Mischung langsam mit 15ml Pancoll zu unterziehen.Nach der Dichtegradientenzentrifugation wird die opake Schicht, die die mononukleären Zellen enthält, mit einer serologischen Pipette aufgenommen und in ein neues PP-Rohr übertragen. Nach dem Waschen mit PBS und dem Pelletieren der mononukleären Zellen durch Zentrifugation den Überstand entsorgen und das Pellet im Gefriermedium wieder aufhängen und in vorbeschriftete Kryoröhren abgeben. Übertragen Sie die Rohre in einen Kühlbehälter, der für langsames Einfrieren mit einem Grad pro Minute geeignet ist, und lagern Sie vorübergehend bei 80 Grad.Gewebeverarbeitung. Sobald die Gewebeprobe vom Chirurgen resektiert wird, legen Sie sie in einen geeigneten Behälter. Vermeiden Sie unter allen Umständen, dass das Gewebe mit Formalin bedeckt ist.Transport so schnell wie möglich zur Pathologie zur Exzision von Tumormaterial, das für die pathologische Bewertung der Resektionsränder nicht relevant ist. Das Tumorstück sollte so aseptisch wie möglich behandelt werden. Darüber hinaus erhalten Sie eine Probe von gesundem Gewebe und legen Sie beide in separaten Röhren mit Gewebeaufbewahrungslösung auf Eis vorgefüllt.Kehren Sie sofort ins Labor zurück, um mit der Gewebeverarbeitung unter sterilen Bedingungen zu beginnen. Das Gewebestück wird auf eine sterile Kunststoffschale gelegt, die mit einer Gewebeaufbewahrungslösung gefüllt ist, um eine Austrocknung zu vermeiden. Erstens, Verbrauch eines oder mehrerer Pinhead-große Stücke für Snap Freezing in Abhängigkeit von der Größe der Gewebeprobe erhalten.Das native Gewebe in vorbeschriftete Kryoröhren geben und sofort in flüssigen Stickstoff eintauchen. Schneiden Sie das restliche Gewebe in Würfel von drei mal drei mal drei Kubikmillimetern. Berücksichtigen Sie, dass nekrotisches Gewebe vollständig seziert werden muss, aber nicht verworfen werden sollte.Ordnen Sie die Würfel in Vierern an, um die Anzahl der Aliquots für die lebenswichtige Lagerung zu bestimmen. Beschriften Sie eine ausreichende Anzahl von Kryoröhren und füllen Sie sie mit jeweils 1,5 ml Gefriermedium vor. Da das DMSO im Gefriermedium zytotoxisch ist, die nächsten Schritte schnell und ohne Unterbrechung durchgeführt.Verwenden Sie ein Skalpell klingen, um vier Gewebestücke pro Rohr zu schöpfen. Stellen Sie sicher, dass alle Teile vollständig in Gefriermedium eingetaucht sind, idealerweise an der Unterseite des Rohres und frieren Sie Rohre mit einem Gefrierbehälter schnell ein. Gehen Sie genauso mit dem gesunden Exemplar vor.Für die Langfristige Lagerung lagern Sie alle Aliquotes in einem flüssigen Stickstofftank. Zellkultur. Schleifen Sie die Reste der Tumorgewebeverarbeitung, einschließlich der nekrotischen Portionen mit den Skalpellklingen so klein wie möglich.Legen Sie ein Zellsieb an die Oberseite eines sterilen PP-Rohrs und aspirieren Sie die Suspension mit einer serologischen Pipette, um das Zellsieb zu passieren. Verwenden Sie den Kolben einer Einwegspritze, um die Gewebereste durch das Zellsieb zu drücken, um eine Einzelzellsuspension zu erzeugen. Spülen Sie mit PBS und wiederholen Sie diese Schritte, bis kein Material mehr vorhanden ist.Entfernen Sie das Zellsieb und zentrieren Sie die Suspension bei 180 RCF für sieben Minuten. In der Zwischenzeit bereiten Sie eine kollagenvorbeschichtete Sechs-Well-Platte mit unterschiedlichen Medienzusammensetzungen vor, um die Wahrscheinlichkeit eines Tumorauswachsens zu erhöhen. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in PBS wieder auf und geben Sie 500 Mikroliter pro Brunnen aus.Legen Sie die Platte anschließend in einen Standard-Inkubator. Generierung von patientenabgeleiteten Xenograft. Für die Erzeugung von vom Patienten abgeleiteten Xenografts bei immungeschwächten Mäusen sollten Tiere in einer spezifischen pathogenfreien Umgebung gehalten werden.Tragen Sie persönliche Schutzausrüstung, bestehend aus Peelings, Schürze, Gesichtsmaske, Haarschutz und Handschuhen. Nach der Organisation Ihres Arbeitsbereichs nehmen Sie die Wunschtumorprobe aus dem flüssigen Stickstoffbehälter. Füllen Sie ein frisches PP-Rohr mit 35ml PBS, waschen Sie dann den Auftauvorgang sorgfältig und kippen Sie das Kryorohr nach oben und unten.Sobald der Inhalt schlammig wird, in die PBS gegossen und die Tumorstücke abspülen. Entsorgen Sie den Großteil der PBS und leeren Sie die Würfel in den Deckel. Legen Sie eine sterile Kunststoffschale auf eine Eispackung und fügen Sie ein Tröpfchen von 100 Mikroliter Matrigel hinzu.Verwenden Sie Zangen, um die Tumorstücke in das Matrigel zu legen und den Tumor für 10 Minuten zu inkubieren. In der Zwischenzeit zwei Mäuse anästhesieren. Überprüfen Sie die Tiefe der Anästhesie, indem Sie den Fuß des Tieres kneifen.Jede Bewegung deutet auf eine unzureichende Anästhesie hin und erfordert entweder einige Wartezeiten oder zusätzliche Dosierungen. Tragen Sie die Augensalbe auf, kneifen Sie die Maus am Hals und injizieren Sie einen Mikrochip subkutan. Führen Sie die folgenden Schritte parallel aus.Desinfizieren Sie die Flanken der Mäuse und machen Sie einen kleinen Hautschnitt mit Streifen Metzenbaum Schere und bilden eine subkutane Tasche durch stumpfe Vorbereitung. Verwenden Sie anatomische Zangen, um die Tumorstücke einzufügen. Stellen Sie sicher, dass das Stück am hinteren Ende der Hauttasche platziert ist.Den restlichen Matrigel ansaugen und gleichmäßig auf alle vier Taschen verteilen. Warten Sie auf die Aushärtung des Gels und schließen Sie die Haut mit Single-Button-Nähten, ohne die Tumorstücke mit der Nadel zu beschädigen. Schneiden Sie den Faden so kurz wie möglich über dem Knoten und wenden Sie Spray-Dressing an, um zu verhindern, dass die Nähte nicken.Scannen Sie den Mikrochip und fügen Sie die Tumorinformationen zur späteren Identifizierung des Tieres in die Datenbank ein. Bereiten Sie einen Käfig mit frischer Bettwäsche und Nistmaterial vor, stellten Sie die Mäuse vor eine Infrarotlampe und überwachen Sie das Tier, bis die Anästhesie nachgelassen hat. Explantation von PDX.Nachdem der PDX-Tumor die erforderliche Größe erreicht hat, wird die Maus durch CO2-Erstickung und anschließende Zervixdislokation eingeschläfert. Sezieren Sie die Haut vorsichtig vom Tumor und entfernen Sie den PDX vollständig. Repräsentative Ergebnisse.Legen Sie einen Tumor auf eine sterile Kunststoffschale und verwenden Sie sterile Skalpellklingen für die Weiterverarbeitung. Loch mit den Scheiben schneiden, in eine Histologiekassette legen und in Formalin eintauchen, um paraffinierte Proben für eine histologische Beurteilung zu einem späteren Zeitpunkt zu erzeugen. Übertragen Sie den Rest des Tumors auf Gewebespeicherlösung und erstellen Sie neue vital erhaltene und schnappende gefrorene Proben für die Biobank.Verwenden Sie außerdem die Reste des PDX-Tumors analog zur Kapitelzellkultur, um sekundäre Tumorzelllinien zu bestimmen. Um weitere PDX zu generieren, übertragen Sie zwei oder mehr Tumorstücke mit Matrigel auf eine neue Empfängermaus, wie zuvor gezeigt. Schlussfolgerung. Mit dem vorgestellten Protokoll konnten wir bisher neun Pankreas- und mehr als 100 kolorektal patientenabgeleitete Krebszelllinien sowie 19 Pankreas- und über 150 kolorektale PDX-Modelle etablieren.

creation-and-maintenance-of-a-living-biobank-how-we-do-it

Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

Krebsforschung

Kutane Tumoren werden oft nach Mohs mikrographischen Chirurgie verworfen. Hier wird ein Protokoll beschrieben, das es dem klinischen Hilfspersonal ermöglicht, kutane Tumor- ( zB Plattenepithelkarzinom-, Basalzellkarzinom- und Melanom-) Proben für nachgeschaltete Laboranwendungen effektiv zu verarbeiten und zu speichern, ohne die klinischen Operationen zu beeinträchtigen.

Errichtung eines klinischen Biorepositorys

Die praktische Anwendung und Leistung der Methoden für die Generation von repräsentativen Gewebeproben von porcinen Tiermodellen für ein breites Spektrum an nachgeschalteten Analysen in Biobank Projekte gezeigt, darunter Volumetrie, systematische Stichproben und differenzierte Aufbereitung von Gewebeproben für qualitative und quantitative morphologische und molekulare Analysen Arten.

Probenahmestrategien und Verarbeitung der Biobank Gewebeproben von porcinen biomedizinische Modelle

Diese Methode beinhaltet die Nutzung klinischer diagnostischer Daten für Prostatakrebspatienten, um Probenahmeverfahren zu leiten, wenn Biobanking-Gewebe nach radikaler Prostatektomie. Dadurch werden Probleme mit zuvor veröffentlichten Methoden rund um effizienz und Verfügbarkeit von frischem Gewebe für ein breiteres Spektrum nachgelagerter Anwendungen gelöst.

Verwendung von Magnetresonanztomographie- und Biopsiedaten zur Anleitung von Probenahmeverfahren für Prostatakrebs Biobanking

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, um einzelne Gehirn-Aging-Trajektorien durch ein Gehirn-Spenden-Programm und die richtige Charakterisierung des Gehirns zu verfolgen. Hirnspender sind an einer langfristigen Längs-Langzeitstudie beteiligt, einschließlich serieller multidimensionaler Bewertungen. Das Protokoll enthält eine detaillierte Beschreibung der Gehirnverarbeitung und eine genaue Diagnosemethodik.

Abbiategrasso Brain Bank Protocol zum Sammeln, Verarbeiten und Charakterisieren alternder Gehirne

Biobanken sind wichtige Ressourcen für die biomedizinische Forschung und die Biobank for Translational and Digital Medicine Unit am European Institute of Oncology ist ein Modell auf diesem Gebiet. Hier bieten wir eine detaillierte Beschreibung der Standardarbeitsanweisungen von Biobanken für das Management verschiedener Arten von humanbiologischen Proben.

Biobank für translationale Medizin: Standardarbeitsanweisungen für optimales Probenmanagement

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Erleichterung der Entnahme von Proben aus radikalen Prostatektomieproben. Ziel ist es, Gewebeproben aus den Proben nach anatomisch-pathologischen Kriterien zu kartieren, zu charakterisieren und zu mikro-präparieren, bevor sie in einer Biobank gelagert werden.

Verbesserung der Zuverlässigkeit von Prostatatumor-Biobanken durch verbesserte Probenahmetechnik und histologische Charakterisierung

Dieses Protokoll stellt eine integrierte Biorepository-Plattform für die standardisierte Sammlung, Annotation und Biobank von hochwertigen humanen Kammerwasser- und Glaskörper-Flüssigbiopsien für molekulare Downstream-Analysen, einschließlich Proteomik, Metabolomik und Glykomik, dar.

Biobanking von humanen wässrigen und glasartigen Flüssigbiopsien für molekulare Analysen

Dieses Protokoll bietet einen systematischen Rahmen für die Etablierung von Eierstockkrebs-Organoiden aus verschiedenen Krankheitsstadien und adressiert die Herausforderungen der patientenspezifischen Variabilität, um die Ausbeute zu erhöhen und eine robuste langfristige Expansion für nachfolgende Anwendungen zu ermöglichen. Es umfasst detaillierte Schritte für die Gewebeverarbeitung, die Aussaat, die Anpassung der Medienanforderungen und die Immunfluoreszenzfärbung.

Strategie für das Biobanking von Ovarialkarzinom-Organoiden: Berücksichtigung der Heterogenität zwischen Patienten über histologische Subtypen und Krankheitsstadien hinweg

In diesem Artikel wird ein detailliertes Protokoll für die Entnahme von Brustkrebsproben vorgestellt, das entwickelt wurde, um ihren Nutzen für Biobanking, personalisierte Medizin und andere Forschungsanwendungen zu optimieren. Der Arbeitsablauf für die Probenentnahme, einschließlich Brustbiopsie und Mastektomie, wird detailliert beschrieben, wobei der Schwerpunkt auf der Minimierung von Gewebeschäden und der Maximierung der Probenqualität liegt.

Optimierung von Verfahren zur Entnahme von Brustbiopsien und Mastektomieproben für Biobanking, personalisierte Medizin und Forschungsanwendungen

Hier erklären wir ein Protokoll für die Modellierung der biophysikalischen Mikroumgebung, wo die Vernetzung und eine erhöhte Steifigkeit der Basalmembran (BM), induziert durch Advanced Glycation Endprodukten (AGEs) pathologische Relevanz hat.

Wie man Basalmembran Stiffness als biophysikalische Auslöser in Prostatakrebs und andere altersbedingte Pathologien oder Stoffwechselkrankheiten Studie

Erfahren Sie, wie eine lebende Biobank für kolorektale und pankreatische Krebserkrankungen aufgebaut und gepflegt wird. Das Protokoll umfasst Patienten-abgeleitete Xenografts (PDX), Primärzelllinien und Kryopräservierung für präklinische Präzisionsmedizin.

Schaffung und Pflege einer lebenden Biobank - Wie wir es tun

Weitere Videos entdecken