Zuverlässige Entwicklung und Kontrolle stabiler optogenetischer Genschaltkreise in Säugetierzellen

Das standardisierte optogenetische Protokoll wurde für Labore entwickelt, die daran interessiert sind, Licht als Stimulus zur Kontrolle der zellulären Eigenschaften in künstlich hergestellten Säugetierzellsystemen zu verwenden. Dieses Protokoll ist in Laboren, die sonst nicht mit Optogenetik vertraut sind, einfach zu implementieren und bietet Methoden zur präzisen räumlich-zeitlichen Kontrolle von technisch hergestellten biologischen Systemen. Diese Methode hat ein breites Anwendungsspektrum in bestimmten Forschungsbereichen, in denen raumzeitliche Informationen wichtig sein können, einschließlich Krebsbiologie, Systembiologie und Gewebedifferenzierung.

Wählen Sie zunächst die genetischen Komponenten aus, die zu einem einzigen Genkreislauf oder Plasmid gebunden werden sollen. Zum Beispiel DNA-Integrationsstellen von Säugetieren, lichtempfindliche Elemente oder funktionelle Gene. Nachdem Sie alle notwendigen Merkmale wie Startcodons, regulatorische oder übersetzte Sequenzen zusammengestellt und untersucht haben, verwenden Sie eine gentechnische und molekulare Klonierungssoftware, kommentieren und speichern Sie die DNA-Sequenzen für die spätere Verwendung und als Referenz.

Validieren Sie die Primer rechnerisch für den Plasmidaufbau durch die integrierten Funktionen der Molekularklonierungssoftware, z. B. die Sequenzausrichtung. Um eine stabile Zelllinie zu erzeugen, transfizieren Sie die Design-Genschaltkreise und die gewünschten Zellen unter Verwendung einer Liposomenmischung der Genkreis-DNA mit geeigneter Rekombinase. Nachdem die Zellen zu 80 bis 100% konfluent sind, frieren Sie die Zellen in einer Mischung aus 45% alten Medien, 45% frischen Medien und 10% DMSO ein.

Übertragen Sie die verbleibenden Zellen in ein steriles Röhrchen und führen Sie eine Einzelzellsortierung durch, um monoklonale Zellen in eine 96-Well-Platte zu isolieren. Etwa zwei bis drei Wochen nach der monoklonalen Sortierung sollten die Vertiefungen innerhalb der 96-Well-Platte Herde haben. Wenn eine Konfluenz von 50 bis 60% erreicht ist, teilen Sie die Zellen in eine 12-Well-Platte auf.

Fügen Sie die Firmware mithilfe eines Mikrocontroller-Programmiergeräts zur konfektionierten LPA-Schaltung hinzu. Als nächstes kombinieren Sie 3D-gedruckte Teile in der bestückten Leiterplatte mit der Montageplatte, der Leiterplatte, dem LED-Abstandshalter, dem Plattenadapter, einer 24-Well-Platte, einem Plattendeckel, Befestigungsschrauben, Flügelmuttern und Stapelkomponenten. Um ein optogenetisches Experiment zu beginnen, verwenden Sie die Iris-Software, die auf der Tabor Lab-Website verfügbar ist, um eine SD-Karte für die LPA zu programmieren und geeignete Lichtbedingungen zu untersuchen.

Als nächstes geben Sie Intensitätswerte mit den technischen Replikaten für die gewünschte experimentelle Gliederung ein. Fügen Sie etwa 75.000 Zellen pro Vertiefung in eine 24-Well-Black-Platte in einem Gesamtvolumen von 500 Mikrolitern hinzu und legen Sie die Zellen dann in einen befeuchteten Inkubator mit 5% Kohlendioxid, damit sie sich zwei bis sechs Stunden absetzen können. Nachdem Sie die Zellen in der Gewebekulturhaube am Ende der Inkubation übertragen haben, entfernen Sie den Kunststoffdeckel und fügen Sie einen Klebefolienstreifen an der Oberseite der Platte hinzu, um den Lichttransfer zwischen den Vertiefungen zu minimieren, so dass das Licht nur durch die LED am Boden des Brunnens eindringen kann.

Legen Sie die Platte in die montierten 3D-Teile des LPA und bedecken Sie die Platte dann mit dem 3D-gedruckten LPA-Deckel, der über die Geräteschrauben an jeder Ecke passt. Schließen Sie das Gerät an die Stromquelle an und drücken Sie die Reset-Taste am LPA-Gerät, um sicherzustellen, dass die aktualisierten LPA-Experimenteinstellungen angewendet werden und die Zellen inkubiert werden. Entfernen Sie nach der Inkubation in der Gewebekulturhaube den Folienstreifen von der Platte und lassen Sie die Platte ein bis zwei Minuten ruhen, um zu verhindern, dass sich Kondenswasser auf dem Kunststoffdeckel bildet.

Als nächstes legen Sie den ursprünglichen Kunststoffdeckel wieder auf die Platte und stellen Sie die Zellen mit dem entsprechenden Phasenkontrast- oder Fluoreszenzmikroskop ab. Nach 24 bis 72 Stunden nach der Induktion, gefolgt von der Trypsinisierung, wird der gesamte Inhalt jedes Vertiefungs von etwa 500 Mikrolitern auf die markierten Röhrchen übertragen, die mit dem Zellsieb ausgestattet sind. Erstellen Sie dann mit der entsprechenden Durchflusszytometrie-Gerätesoftware ein Vorwärts- und Seitenstreutor, um die einzelnen Zellen der entsprechenden Größe und Granularität zu erfassen, um Trümmer und Zellklumpen auszuschließen.

Sobald das Tor gesetzt ist, erfassen Sie ungefähr 10.000 Zellen mit dem entsprechenden Tor und passen Sie die Zellzahl in Abhängigkeit von der Menge der erforderlichen Zelldaten an und wiederholen Sie die Erfassung experimenteller Zellen in jeder Röhre. Nach Induktion und Trypsinisierung wird der gesamte Inhalt jeder Vertiefung von etwa 500 Mikrolitern auf die markierten Röhrchen übertragen. Zentrifen Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 400 mal G. Nachdem Sie den Überstand verworfen haben, bewegen Sie die Proben in einen chemischen Abzug.

Resuspendieren Sie die Zellen in 750 bis 1.000 Mikrolitern 4% PFA, die in PBS verdünnt sind, und pipettieren Sie mehrmals auf und ab, um die Zellklumpen zu brechen. Nach 15 Minuten Inkubation 750 bis 1.000 Mikroliter PBS hinzufügen und mehrmals auf und ab pipettieren, dann die Zellen für fünf Minuten bei 400 mal G bei Raumtemperatur pelletieren. Nachdem Sie den Überstand verworfen haben, bewegen Sie die Proben in einen chemischen Abzug und suspendieren Sie die Zellen in 750 bis 1.000 Mikrolitern eiskaltem Methanol, wie gezeigt, und lassen Sie die Zellen 30 Minuten in einem Gefrierschrank von minus 20 Grad Celsius sitzen.

Nach der Inkubation fügen Sie 750 bis 1.000 Mikroliter PBS hinzu, während Sie mehrmals auf und ab pipettieren. Nachdem Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 400 mal G zentrifugiert haben, entsorgen Sie den Überstand und bewegen Sie die Proben in einen chemischen Abzug. Resuspendieren Sie die Zellen in 100 Mikrolitern oder einer anderen geeigneten Verdünnung des markierten primären Antikörpers und pipettieren Sie sechs bis acht Mal auf und ab und inkubieren Sie dann eine Stunde lang bei Raumtemperatur.

Als nächstes fügen Sie 750 bis 1.000 Mikroliter des Inkubationspuffers hinzu und pipettieren Sie die Lösung mehrmals auf und ab, dann zentrifugieren Sie die Zellen für fünf Minuten bei 400 mal G.Als nächstes suspendieren Sie die Zellen in 500 Mikrolitern PBS und brechen Sie die Klumpen, indem Sie mehrmals auf und ab pipettieren. Übertragen Sie den gesamten Inhalt jedes Röhrchens auf markierte Röhrchen mit Zellsieben. Bringen Sie die Zellen zu geeigneten Durchflusszytometrie-Instrumenten mit Lasern der richtigen Wellenlängen.

Die optische Kalibrierung wurde für die Geräte durchgeführt. Anhand des aufgenommenen Bildes wurden Kompensationswerte für LED berechnet, Hintergrundsignale subtrahiert und Pixelintensität abgeleitet. Der Variationskoeffizient war zwischen 96 Bohrungen minimal.

Die Kalibrierungssoftware demonstrierte die LED-Variation nach Standort und erstellte eine Graustufenanpassung, so dass jede LED auf die gleiche Intensität normalisiert wird. Die Genexpression wurde in technisch hergestellten leichteren Zellen mittels Fluoreszenzmikroskopie bei unterschiedlichen Lichtpulsdauern auf dem LPA induziert und die Zellen wurden für die Hellfeld- und GFP-Expression abgebildet. Mittels Durchflusszytometrie wurden die Zellen bei unterschiedlichen Pulslängenwerten induziert und zeigten eine auf Populationsebene quantifizierte Dosis-Wirkungs-Beziehung der Genexpression von über vierfacher Veränderung aus uninduzierten Zuständen.

Das negative Feedback erreichte eine über fünffache Genexpressionsrauschunterdrückung, wie durch den Vergleich verschiedener Lichtintensitätswerte für das leichtere System im Vergleich zu vivid oder light on gezeigt wurde. Die qPCR-Analyse zeigte, dass die technisch hergestellten leichteren Zellen RNA-Spiegel in einer dosisabhängigen Weise mit mehr als zehnfacher Induktion aus uninduzierten Zuständen exprimierten, was der Quantifizierung der Durchflusszytometrie entsprach. Der technisch hergestellte leichtere Genkreislauf zeigte zunehmende Mengen an blauem Licht, was zu erhöhten KRAS-Proteinspiegeln und phosphorylierten ERK-Spiegeln führte.

Es können mehrere funktionelle Assays durchgeführt werden, einschließlich Wachstums-, Zellmotilitäts-, Wundheilungs-, Proliferations- oder Invasionsassays. Diese Methoden könnten spezifische Einblicke in die Mechanismen der Krebsbiologie, der Gewebedifferenzierung oder der Arzneimittelresistenz liefern.