Name: Einzelmolekül-Verweilzeitanalyse der Restriktionsendonuklilease-vermittelten DNA-Spaltung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: Lernen Sie die Einzelmolekül-Verweilzeitanalyse der Restriktionsendonuklease-vermittelten DNA-Spaltung. Diese multiplexe Methode mit Quantenpunkt-markierter DNA ermöglicht die Untersuchung katalytischer Zyklen einzelner Enzyme.

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Diese Arbeit wurde durch die Auszeichnung Nummer K12GM074869 an CME des National Institute of General Medical Sciences unterstützt. Der Inhalt liegt in der alleinigen Verantwortung der Autoren und gibt nicht unbedingt die offizielle Meinung des National Institute of General Medical Sciences oder der National Institutes of Health wieder.

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Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen oder andere Interessenkonflikte

Das DNA-Substrat für diesen Assay wird unter Verwendung eines zweistufigen Reaktionsschemas unter Verwendung von Sulfo-SMCC mit einem Quantenpunkt markiert. Dieser bifunktionelle Vernetzer besteht aus einer NHS-Estergruppe, die mit einem primären Amin reagieren kann, und einer Maleimidgruppe, die mit einer Sulfhydrylgruppe20 reagieren kann. Die thiolierten Oligonukleotide, die zur Herstellung des Substrats verwendet werden, werden in ihrer oxidierten Form versandt. Es ist wichtig, sie wie beschrie...

Restriktionsendonukleasen (REasen) sind Enzyme, die sequenzspezifische Doppelstrangbrüche in der DNA bewirken. Die Entdeckung von REasen in den 1970er Jahren führte zur Entwicklung der rekombinanten DNA-Technologie, und diese Enzyme sind heute unverzichtbare Laborwerkzeuge für die genetische Veränderung und Manipulation1. Typ-II-REasen sind die am weitesten verbreiteten Enzyme dieser Klasse, da sie die DNA an einer festen Stelle entweder innerhalb oder in der Nähe ihrer Erkennungssequenz spalten. Es gibt jedoch eine große Variation zwischen den Typ-II-REasen, und sie werden in mehrere Subtypen unterteilt, die auf bestimmten enzymatischen Eigenschaften basieren, anstatt nach ihren evolutionären Beziehungen klassifiziert zu werden. Bei jedem Subtyp gibt es häufige Ausnahmen vom Klassifikationsschema, und viele Enzyme gehören zu mehreren Subtypen2. Tausende von Typ-II-REasen wurden identifiziert, und Hunderte von ihnen sind kommerziell erhältlich.
Trotz der Vielfalt unter den Typ-II-REasen wurden jedoch nur sehr wenige REasen im Detail untersucht. Laut REBASE, der von Sir Richard Roberts 1975 gegründeten Datenbank für Restriktionsenzyme3, liegen für weniger als 20 dieser Enzyme veröffentlichte Kinetikdaten vor. Während einige REasen direkt auf Einzelmolekülebene beobachtet wurden, während sie entlang der DNA diffundierten, bevor sie auf ihre Erkennungssequenztrafen 4,5,6,7, gibt es nur sehr wenige Einzelmolekülstudien über ihre Spaltreaktionskinetik. Die vorhandenen Studien liefern entweder keine ausreichenden Statistiken, um eine detaillierte Analyse der Variation der Zeitpunkte durchzuführen, zu denen einzelne Spaltungsereignisse stattfinden 8,9,10, oder sie sind nicht in der Lage, die vollständige Verteilung der Spaltungszeitenzu erfassen 11. Diese Art der Analyse kann das Vorhandensein von relativ langlebigen kinetischen Zwischenprodukten aufdecken und könnte zu einem besseren Verständnis der Mechanismen der REase-vermittelten DNA-Spaltung führen.
Auf der Ebene der Einzelmoleküle sind biochemische Prozesse stochastisch - die Wartezeit auf das Auftreten einer einzelnen Instanz des Prozesses, τ, ist variabel. Bei vielen Messungen von τ kann jedoch erwartet werden, dass sie einer Wahrscheinlichkeitsverteilung (p(τ) folgen, die auf die Art des stattfindenden Prozesses hinweist. Zum Beispiel gehorcht ein einstufiger Prozess, wie z. B. die Freisetzung eines Produktmoleküls aus einem Enzym, der Poisson-Statistik, und p(τ) nimmt die Form einer negativen Exponentialverteilung an:
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62112/62112eq1v3.png">
wobei β die mittlere Wartezeit ist. Beachten Sie, dass die Geschwindigkeit des Prozesses k gleich 1/β ist, dem Kehrwert der mittleren Wartezeit. Bei Prozessen, die mehr als einen Schritt erfordern, ist p(τ) die Faltung der einfachen Exponentialverteilungen für jeden der einzelnen Schritte. Eine allgemeine Lösung für die Faltung von N einfach-exponentiellen Zerfallsfunktionen mit identischen mittleren Wartezeiten, β, ist die Gamma-Wahrscheinlichkeitsverteilung:
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62112/62112eq2v3.png">
Dabei ist Γ(N) die Gamma-Funktion, die die Interpolation der Fakultät von N-1 zu nicht-ganzzahligen Werten von N beschreibt. Obwohl diese allgemeine Lösung als Annäherung verwendet werden kann, wenn die mittleren Wartezeiten einzelner Schritte ähnlich sind, muss verstanden werden, dass das Vorhandensein relativ schneller Schritte durch Schritte mit deutlich längeren Wartezeiten maskiert wird. Mit anderen Worten, der Wert von N stellt eine untere Grenze für die Anzahl der Schritte12 dar. Bei einer ausreichenden Anzahl von Wartezeitmessungen können die Parameter β und N geschätzt werden, indem die Ereignisse klassifiziert und die Gammaverteilung an das resultierende Histogramm angepasst wird, oder indem ein Maximum-Likelihood-Schätzansatz verwendet wird. Diese Art der Analyse kann daher das Vorhandensein von kinetischen Schritten aufdecken, die in Ensemble-Assays nicht leicht aufgelöst werden können und eine große Anzahl von Beobachtungen erfordern, um die Parameter genau zu schätzen12,13.
In diesem Artikel wird eine Methode beschrieben, mit der mit Quantenpunkten markierte DNA und Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie (TIRF) Hunderte von einzelnen REase-vermittelten DNA-Spaltungsereignissen parallel beobachtet werden können. Das Design des Assays ermöglicht es, die Ergebnisse mehrerer Experimente zu bündeln und Verweilzeitverteilungen mit Tausenden von Ereignissen zu erstellen. Die hohe Photostabilität und Helligkeit der Quantenpunkte ermöglichen eine Zeitauflösung von 10 Hz, ohne die Fähigkeit zu beeinträchtigen, Spaltungsereignisse zu beobachten, die auch viele Minuten nach dem Start des Experiments auftreten. Die gute zeitliche Auflösung und ein breiter dynamischer Bereich, kombiniert mit der Möglichkeit, einen großen Datensatz zu sammeln, ermöglichen eine genaue Charakterisierung der Verweilzeitverteilungen, um das Vorhandensein mehrerer kinetischer Schritte in den Spaltungswegen von REasen aufzudecken, die Umsatzraten im Bereich von 1 min-1 aufweisen. Im Fall von EcoRV können drei kinetische Schritte aufgelöst werden, die alle auf andere Weise identifiziert wurden, was bestätigt, dass der Assay empfindlich auf das Vorhandensein solcher Schritte reagiert.
Duplex-DNA-Substrate, die die interessierende Erkennungssequenz enthalten, werden hergestellt, indem ein biotinyliertes Oligonukleotid an einen komplementären Strang geglüht wird, der mit einem einzelnen, kovalent gebundenen Halbleiter-Nanokristall-Quantenpunkt markiert ist. Diese Substrate werden in einen Strömungskanal eingebracht, der auf einem Glasdeckglas aufgebaut ist, an dessen Oberfläche ein Rasen aus hochmolekularen Polyethylenglykol (PEG)-Molekülen befestigt ist. Die DNA-Substrate werden über eine Biotin-Streptavidin-Biotin-Bindung von einem Teil der PEG-Moleküle eingefangen, die an ihrem freien Ende ein Biotin haben. In der TIRF-Mikroskopie sorgt eine evaneszente Welle, die exponentiell mit zunehmender Entfernung von der Glas-Flüssig-Grenzfläche abklingt, für Beleuchtung; Die Eindringtiefe liegt in der Größenordnung der Wellenlänge des verwendeten Lichts. Unter diesen Bedingungen werden nur Quantenpunkte angeregt, die durch ein DNA-Molekül an die Oberfläche gebunden sind, das auf der funktionalisierten Glasoberfläche eingefangen wurde. Quantenpunkte, die in Lösung frei sind, werden innerhalb des beleuchteten Bereichs nicht eingeschränkt und leuchten daher nicht. Wenn die DNA, die einen Quantenpunkt an die Oberfläche bindet, gespalten wird, kann dieser Quantenpunkt frei von der Oberfläche weg diffundieren und verschwindet aus dem Fluoreszenzbild.
Obwohl bekannt ist, dass viele Typ-II-REasen in Abwesenheit vonMagnesium 14 DNA binden, benötigen alle Magnesium, um die DNA-Spaltungzu vermitteln 15. Diese REasen können die oberflächenimmobilisierte DNA in Abwesenheit von Magnesium binden. Wenn magnesiumhaltiger Puffer durch einen Kanal fließt, in dem REase an die DNA vorgebunden ist, beginnt die Spaltung sofort, was durch das Verschwinden der Quantenpunkte angezeigt wird. Die Synchronisation, die durch die Vorbindung der REase-Moleküle und die anschließende Initiierung der DNA-Spaltung durch die Einführung von Magnesium erreicht wird, erleichtert die Messung der Verzögerungszeit bis zum Abschluss der DNA-Spaltung unabhängig für jedes Molekül in der Population der Enzyme, die in einem Experiment beobachtet wurden. Fluorescein ist als Tracerfarbstoff in dem magnesiumhaltigen Puffer enthalten, um die Ankunft von Magnesium im Sichtfeld anzuzeigen. Da kein Enzym in dem magnesiumhaltigen Puffer enthalten ist, gibt die Verzögerungszeit von der Ankunft des magnesiumhaltigen Puffers bis zum Verschwinden jedes Quantenpunkts die Zeit an, die eine bereits an die DNA gebundene REase benötigt, um die DNA zu spalten und den Quantenpunkt von der Glasoberfläche freizusetzen. Das Verschwinden von Quantenpunkten geschieht schnell und führt zu einer starken Abnahme der Intensitätskurve, was einen klaren Hinweis auf den Zeitpunkt gibt, zu dem ein bestimmtes DNA-Molekül gespalten wird. Die Bestimmung der Ereigniszeiten erfolgt durch die mathematische Analyse von Intensitätsverläufen, und ein typisches Experiment führt zu Hunderten von identifizierbaren Spaltungsereignissen. Die Ergebnisse mehrerer Experimente können zusammengefasst werden, um angemessene Statistiken zu liefern, die eine Schätzung der Parameter N und β entweder durch nichtlineare Analysen der kleinsten Quadrate oder durch Maximum-Likelihood-Analysen ermöglichen.

<table><tbody><tr><td>3-Aminopropyltriethoxysilan (APTS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>440140-100ML</td><td>In Exsikkatorbox aufbewahren</td></tr><tr><td>5 Minuten Epoxidharz</td><td>Devcon</td><td>20845</td><td>zur Versiegelung des mikrofluidischen Geräts</td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Pharmco</td><td>329000ACS</td><td>zur Reinigung von Deckgläsern</td></tr><tr><td>Badsonicator</td><td>Fisher Scientific</td><td>CPXH Modell 2800</td><td>Katalognummer 15-337-410</td></tr><tr><td>Becherglas, Glas, 100 mL</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tischzentrifuge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biotin-PEG-Succinimidylvalerat (MW 5.000)</td><td>Laysan Bio</td><td>BIO-SVA-5K</td><td>Succinimidylvalerat hat eine längere Halbwertszeit als Succinimidylcarbonat</td></tr><tr><td>biotinyliertes Oligonukleotid</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>kundenspezifisch - siehe Protokoll für Designüberlegungen</td><td>Anfrage 5' Biotin-Modifikation und HPLC-Aufreinigung</td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin (BSA)</td><td>VWR</td><td>0903-5G</td><td>Bereiten Sie eine Lösung von 10 mg/ml (aq) vor und erhitzen Sie es auf 95 μg; C vor der Verwendung von</td></tr><tr><td>Centri-Spin-10 Größenausschluss Spin-Säulen</td><td>Princeton Trennungen</td><td>CS-100 oder CS-101</td><td>zur Aufreinigung von thiolierten Oligonukleotiden nach Reduzierung der Disulfidbindung</td></tr><tr><td>Zentrifugenröhrchen 1,5 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Deckgläser, 1-Zoll-Deckglashalter</td> aus quadratischem Glas <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td> Diamantspitzenscheibe Dremel <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>7134</td><td>Verwendung zum Bohren von Löchern in Quarz-Durchflusszellen-Topper</td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Thermo Scientific</td><td>A39255</td><td>No-Weigh Format, 7,7 mg/Fläschchen</td></tr><tr><td>Bohrmaschine Rotationswerkzeug-Workstation-Ständer</td><td>Dremel</td><td>220-01</td><td>erleichtert Quarzbohren</td></tr><tr><td>EcoRV (REase zur Generierung von Beispieldaten)</td><td>New England Biolabs</td><td>R0195T oder R0195M</td><td>Verwenden Sie einen Vorrat von 100.000 Einheiten/ml, um die Zugabe von überschüssigem Glycerin zu vermeiden Überprüfen Sie REBASE für Lieferanten anderer REasen</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>verschiedene</td><td>CAS 64-17-5</td><td>vergällt oder 95% sind akzeptabel, zur Reinigung von Deckgläsern</td></tr> verwenden <tr><td>Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>EDS</td><td>BioUltra, wasserfrei, in Exsikkatorbox aufbewahren</td></tr><tr><td>Floh Micro Spinbar</td><td>Fisherbrand</td><td>14-513-65</td><td>Größe 3 mm x 10 mm, um unter das Deckglasgestell</td></tr><tr><td>zu passen Fluoreszein</td><td>Acros Organics</td><td>17324</td><td>zur Herstellung von experimentellen Puffern</td></tr><tr><td>Schwerkraftkonvektionsofen</td><td>Binder</td><td>9010-0131</td><td></td></tr><tr><td>Handheld-Rotationsmultitool</td><td>Dremel</td><td>8220</td><td>zum Bohren von Löchern in Quarz-Durchflusszellen-Topper</td></tr><tr><td>ImagEM X2 EM-CCD-Kamera</td><td>Hamamatsu</td><td>C9100-23B</td><td>Luftkühlung ist für dieses Experiment ausreichend, verwenden Sie die HCImage-Software oder ähnliches zur Steuerung</td></tr><tr><td>Imaging Spacer, doppelseitig, selbstklebendes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glas, Glas mit Schraubverschluss, (ca. 50 mm Durchmesser und 50 mm hoch)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid-Hexahydrat</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP214-500</td><td>zur Herstellung von experimentellen Puffern mit Magnesium</td></tr><tr><td>MATLAB-Software</td><td></td> <td>verwenden</td><td>Datenanalyse</td></tr><tr><td>Metallpinzette</td><td>Fisher Brand</td><td>16-100-110</td><td></td></tr><tr><td>Methoxy-PEG-Succinimidylvalerat (MW 5.000)</td><td>Laysan Bio</td><td>M-SVA-5K</td><td>Beide PEGs sollten den gleichen NHS-Ester haben, damit die Reaktionsgeschwindigkeit konstant ist</td></tr><tr><td>Mikrozentrifuge Eppendorf</td><td></td><td>5424</td><td></td></tr><tr><td>Mehrpositions-Magnetrührer</td><td>VWR</td><td>12621-022</td><td></td></tr><tr><td>N-Cyclohexyl-2-aminoethansulfonsäure (CHES)</td><td>Acros Organics</td><td>AC20818</td><td>CAS 103-47-9, zur Herstellung von CHES</td></tr><tr><td>Puffer-Orbitalschüttler und Heizung für Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>Q Instruments</td><td>1808-0506</td><td>mit Adapter 1808-1061 für 24 x 2,0 mL oder 15 x 0,5 mL Röhrchen</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PE60 Polyethylenschlauch (Innendurchmesser 0,76 mm, Außendurchmesser 1,22 mm)</td><td>Intramedizinisches</td><td>6258917</td><td>22 G stumpfe Nadeln passen gut zu dieser Schlauchgröße</td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) 10x</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P7059</td><td>Verwenden Sie</td></tr><tr><td>Kaliumhydroxid</td> mit 1x Stärke <td>VWR Chemicals BDH</td><td>BDH9262</td><td>verwenden Sie eine 1 M Lösung zum Reinigen von Deckgläsern</td></tr><tr><td>Qdot 655 ITK Amino (PEG) Quantum Dots</td><td>Invitrogen</td><td>Q21521MP</td><td></td></tr><tr><td>Quarz-Objektträger, 1 Zoll quadratisch, 1 mm dick</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>72250-10</td><td>Löcher müssen in die Ecken gebohrt werden für das Einführen von Einlass- und Auslassschläuchen</td></tr><tr><td>Verstärkte Kunststoffpinzette</td><td>Rubis</td><td>K35a</td><td>Verwendung für die Handhabung von Deckgläsern und den Bau von Mikrofluidikgeräten</td></tr><tr><td>SecureSeal Klebefolien</td><td>Grace Biolabs</td><td>SA-S-1L</td><td>geschnitten, um Abstandshalter für mikrofluidische Geräte</td></tr><tr><td>zu bilden Einkanal-Spritzenpumpe für Mikrofluidik</td><td>New Era Pumpensysteme</td><td>NE-1002X-US</td><td>ausgestattet mit einer 50-ml-Spritze und einer stumpfen 22-G-Nadel</td></tr><tr><td>Slide-a-Lyzer MINI-Dialysegeräte, 10 kDa MWCO, 0,1 mL Thermo</td><td>Scientific</td><td>69570 oder 69572</td><td>für den Pufferaustausch während der Quantenpunktkopplung an die DNA</td></tr>, <tr><td>Natriumbicarbonat</td><td>EMD Millipore</td><td>SX0320</td><td>zur Herstellung von Puffern für die Oberflächenfunktionalisierung; 100 mM, pH 8</td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Macron</td><td>7581-12</td><td>Verwendung zur Herstellung von experimentellen Puffern</td></tr><tr><td>Zweibasische Natriumphosphatlösung (BioUltra, 0,5 M in Wasser)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>94046</td><td>zur Herstellung von 100 mM Natriumphosphatpuffer</td></tr><tr><td>Monobasische Natriumphosphatlösung (BioUltra, 5 M in Wasser)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>74092</td><td>zur Einstellung des pH-Werts von 100 mM Natriumphosphatpuffer</td></tr><tr><td>Streptavidin aus Streptomyces avidinii</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S4762</td><td>lösen Sie sich bei 1 mg/mL auf und lagern Sie 25 mL Aliqouts bei -20 ?</td></tr><tr><td>Sulfosuccinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)-cyclohexan-1-carboxylat (Sulfo-SMCC)</td><td>Thermo Scientific</td><td>A39268</td><td>No-Weigh-Format, 2 mg/Fläschchen</td></tr><tr><td>Spritze mit stumpfer 21-G-Nadel</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spritzenpumpe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>thioliertes Oligonukleotid</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>kundenspezifisch - siehe Protokoll für Designüberlegungen</td><td>Anfrage 5' Thiol-Modifikator C6 S-S und HPLC-Reinigung</td></tr><tr><td>TIRF-Bildgebungssystem mit 488 nm Laserbeleuchtung</td><td>verschiedene</td><td></td><td>kundenspezifische</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Research Products International</td><td>T60050</td><td>zur Herstellung von experimentellen Puffern</td></tr><tr><td>Tris-Basis</td><td>JT Baker</td><td>4101</td><td>zur Herstellung von experimentellen Puffern</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P7949</td><td>zur Blockierung verwenden Puffer</td></tr><tr><td>Reinstwasser-Wirbelmischer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>10153-842</td><td></td></tr><tr><td>Wash-N-Dry Deckglasgestell</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>70366-16</td><td>zur Oberflächenfunktionalisierung von Deckgläsern</td></tr></tbody></table>

einzelmolekül-verweilzeitanalyse der restriktionsendonuklilease-vermittelten dna-spaltung

Single-Molecule Dwell-Time Analysis of Restriction Endonuclease-Mediated DNA Cleavage

Dieser neuartige, auf der Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie basierende Assay ermöglicht die gleichzeitige Messung der Länge des katalytischen Zyklus für Hunderte von einzelnen Restriktionsendonuklease (REase)-Molekülen in einem Experiment. Dieser Assay erfordert keine Proteinmarkierung und kann mit einem einzigen Bildgebungskanal durchgeführt werden. Darüber hinaus können die Ergebnisse mehrerer Einzelexperimente gepoolt werden, um gut gefüllte Verweilzeitverteilungen zu erzeugen. Die Analyse der resultierenden Verweilzeitverteilungen kann helfen, den DNA-Spaltungsmechanismus aufzuklären, indem sie das Vorhandensein von kinetischen Schritten aufdeckt, die nicht direkt beobachtet werden können. Beispieldaten, die mit diesem Assay mit der gut untersuchten REase EcoRV - einer dimeren Typ-IIP-Restriktionsendonuklease, die die palindromische Sequenz GAT↓ATC (wobei ↓ die Schnittstelle ist) - gesammelt wurden, stimmen mit früheren Studien überein. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass es mindestens drei Schritte auf dem Weg zur DNA-Spaltung gibt, der durch die Einführung von Magnesium eingeleitet wird, nachdem EcoRV die DNA in deren Abwesenheit gebunden hat, mit einer durchschnittlichen Rate von 0,17 s-1 für jeden Schritt.

Die Durchflusszelle ist direkt mit einem Ölimmersionsobjektiv mit 60-facher Vergrößerung mit hoher numerischer Apertur an einem inversen Mikroskop gekoppelt, das mit Laserbeleuchtung für die durchzielbare TIRF-Bildgebung ausgestattet ist (Abbildung 5A). Nach dem Einbringen des DNA-Substrats und dem Wegspülen von überschüssiger DNA und Quantenpunkten befinden sich typischerweise Tausende von einzelnen Quantenpunkten in einem Sichtfeld (Abbildung 5B). Diese Quante...

Mit Hilfe von Quantenpunkt-markierter DNA und Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie können wir den Reaktionsmechanismus von Restriktionsendonukleasen untersuchen, während wir unmarkierte Proteine verwenden. Diese Einzelmolekültechnik ermöglicht die massiv gemultiplexte Beobachtung einzelner Protein-DNA-Wechselwirkungen, und Daten können gepoolt werden, um gut bevölkerte Verweilzeitverteilungen zu erzeugen.

Einzelmolekül-Verweilzeitanalyse der Restriktionsendonuklilease-vermittelten DNA-Spaltung

This novel total internal reflection fluorescence microscopy-based assay facilitates the simultaneous measurement of the length of the catalytic cycle for ...

Mit diesem Protokoll können wir die ortsspezifische DNA-Spaltung durch Restriktionsendonukleasen auf Einzelmolekülebene direkt beobachten. Unser Multiplex-Ansatz ermöglicht es uns, die Zeit zu messen, die Hunderte von einzelnen REasen benötigen, um den katalytischen Zyklus abzuschließen. Multiplexing ermöglicht es uns, gut gefüllte Verteilungen von der Verweildauer bis zur Spaltung zu generieren, die wir mit der Gamma-Wahrscheinlichkeitsverteilung abgleichen können, um Einblicke in den Mechanismus der DNA-Spaltung zu erhalten.Beginnen Sie mit der Vorbereitung eines frischen Röhrchens für jedes resuspendierte Oligonukleotid mit 50 Mikrolitern des Oligonukleotids und 50 Mikrolitern frisch zubereiteter DTT-Lösung in jedes Röhrchen, pipettieren Sie auf und ab, um es zu mischen und 30 Minuten lang bei Raumtemperatur zu inkubieren. Pipettieren Sie das gesamte Volumen jeder Probenmischung vorsichtig auf eine vorbereitete Säule und zentrifugieren Sie sie zwei Minuten lang bei 750 g. Lagern Sie nach der Zentrifugation alle Proben, die nicht sofort verwendet werden, bei 20 Grad Celsius, um die Oxidation der Thiolgruppen und die Bildung von Disulfidbindungen zu verhindern.Pipettieren Sie für jedes herzustellende Konstrukt ein Aliquot von 50 Mikrolitern des Quantenpunktstocks in ein Dialysegerät, wobei Sie darauf achten müssen, die Membran nicht mit der Pipettenspitze zu berühren. Dialysieren Sie gegen ein Volumen CHES-Puffer, das mindestens das 1.000-fache des Probenvolumens beträgt, und rühren Sie 15 Minuten lang bei 100 U/min. Entnehmen Sie mit einer Pipette vorsichtig die suspendierten Quantenpunkte aus dem Dialysegerät und geben Sie sie in ein frisches Röhrchen mit dem gleichen Volumen frisch zubereiteter Sulfo-SMCC-Lösung, wobei Sie zum Mischen auf und ab pipettieren.1 Stunde lang bei Raumtemperatur mit Schütteln bei 1.000 U/min inkubieren, damit das Sulfo-SMCC mit den primären Aminen auf den Quantenpunkten reagieren kann. Verwenden Sie dann eine Pipette, um jede Probe vorsichtig in ein frisches Dialysegerät zu überführen. Um überschüssiges Sulfo-SMCC zu entfernen, dialysieren Sie unter Rühren 15 Minuten lang gegen ein Volumen des CHES-Puffers, das mindestens dem 1.000-fachen des im Dialysegerät enthaltenen Volumens entspricht.Tauschen Sie den Puffer zweimal aus und führen Sie die Dialyse mit frischem CHES-Puffer insgesamt dreimal durch, so dass die Dialyse nach jedem Pufferwechsel 15 Minuten lang fortgesetzt werden kann. Wiederholen Sie dann die Dialyse mit PBS. Gewinnen Sie mit einer Pipette vorsichtig die Lösung mit den Quantenpunkten aus dem Dialysegerät und überführen Sie jede Probe in ein frisches Röhrchen, das eine äquimolare Menge an dilatiertem Oligonukleotid enthält, das in PBS verdünnt ist.2 Stunden bei Raumtemperatur unter Schütteln bei 1.000 U/min inkubieren. Geben Sie BSA zu jeder Probe für eine Endkonzentration von 0,5 Milligramm pro Milliliter. Verwenden Sie dann eine Pipette, um jede Probe vorsichtig in ein frisches Dialysegerät zu überführen und gegen einen Lagerpuffer zu dialysieren.Entnehmen Sie nach der Dialyse vorsichtig jede Probe und geben Sie sie in ein frisches Röhrchen. Lagern Sie die Proben bei 4 Grad Celsius. Kombinieren Sie eine Probe von Quantenpunkt-markierten Oligonukleotiden mit einem zehnfachen molaren Überschuss an biotinyliertem Oligonukleotid.Die Mischung in einem Heizblock auf 75 Grad Celsius erhitzen und 5 Minuten auf dieser Temperatur halten. Schalten Sie dann den Heizblock aus und lassen Sie die Mischung langsam abkühlen. Lagern Sie das fertige Konstrukt bei 4 Grad Celsius. Bohren Sie mit einem handgeführten Multifunktionswerkzeug, das mit einer konischen Diamantschleifscheibe ausgestattet ist, zwei Löcher in gegenüberliegende Ecken des Quarzschlittens, die als Ein- und Auslass dienen.Achten Sie darauf, den Schlitten an Ort und Stelle zu sichern, schmieren Sie den Bohrer und schieben Sie ihn während des Bohrens ständig mit Wasser. Stellen Sie nach jedem Experiment den vorbereiteten Quarzobjektträger wieder her, indem Sie das gebrauchte Gerät in Aceton einweichen, um den Klebstoff und das Epoxidharz aufzulösen. Verwerfen Sie die restlichen Komponenten.Kombinieren Sie 25 Mikroliter Streptavidin-Lösung mit 80 Mikrolitern PBS und 20 Mikrolitern Blockierungspuffer. Beschichten Sie ein mit PEG behandeltes Deckglas mit dieser Mischung und inkubieren Sie es 30 Minuten lang in einer feuchten Umgebung. Bereiten Sie während der Inkubation des Deckglases den Abstandshalter vor, um einen Strömungskanal zu erstellen.Schneiden Sie ein 1 Zoll großes quadratisches Stück Abstandshaltermaterial aus und markieren Sie dann einen 2 Millimeter breiten Kanal, der an den Enden der Löcher ausgerichtet ist, die in den Quarzschlitten gebohrt wurden. Schneiden Sie den Kanal mit einem Skalpell aus dem Abstandsmaterial heraus. Reinigen Sie den Quarzobjektträger gründlich mit Aceton, um alle Klebstoffreste von früheren Experimenten zu entfernen.Ziehen Sie eine Seite der Rückseite vom Bildabstandshalter ab und legen Sie sie vorsichtig auf den Quarzträger, wobei Sie darauf achten, dass die Ein- und Auslasslöcher nicht verdeckt werden. Waschen Sie den Deckbezug mit Wasser und trocknen Sie ihn mit Druckluft. Entfernen Sie die andere Seite der Rückseite vom Abstandshalter und klemmen Sie sie mit einer Kunststoffpinzette zwischen den Quarzobjektträger und den funktionalisierten Streptavidin-beschichteten Deckglas, um die Baugruppe zusammenzudrücken und Luftblasen vom Klebstoff zu entfernen.Schneiden Sie das Ende des Schlauchs schräg ab, um einen freien Fluss der Lösung zu gewährleisten. Führen Sie dann in jedes Loch des Quarzschiebers einen 30 Zentimeter langen Polyethylenschlauch ein. Halten Sie die Rohre mit einem Rohrgestell fest und verwenden Sie dann Epoxidharz, um die Rohre und die Kanten des zusammengebauten Geräts zu versiegeln.Sobald das Epoxidharz ausgehärtet ist, führen Sie die stumpfe Nadel einer leeren Spritze in das Auslassrohr des Geräts ein und tauchen Sie das Ende des Einlassrohrs in einen Behälter, der mit dem Blockierungspuffer gefüllt ist. Ziehen Sie den Spritzenkolben zurück, um das Gerät mit Blockierungspuffer zu füllen. Lassen Sie das Gerät dann mindestens 30 Minuten lang inkubieren, bevor Sie es verwenden.Befestigen Sie das mikrofluidische Gerät mit Klebeband an der Tischplatte des Mikroskops. Bringen Sie das Objektiv in Kontakt mit der Unterseite des Geräts und positionieren Sie das Objektiv so, dass sich das Sichtfeld innerhalb des mikrofluidischen Kanals befindet. Nachdem Sie den Auslassschlauch an die Spritzenpumpe angeschlossen haben, spülen Sie den mikrofluidischen Kanal mit frischem Blockierungspuffer, indem Sie den Spritzenkolben zurückziehen.Stellen Sie sicher, dass keine Blasen im Schlauch oder im Kanal eingeschlossen sind. 1 Mikroliter des vorbereiteten DNA-Substrats wird in 1 Milliliter Blockierungspuffer verdünnt. Legen Sie das Einlassröhrchen in das verdünnte DNA-Substrat und lassen Sie 800 Mikroliter der Substratlösung mit einer Geschwindigkeit von 200 Mikrolitern pro Minute durch den Kanal fließen.Lassen Sie die DNA-Lösung 15 Minuten lang im Kanal inkubieren, nachdem der Fluss gestoppt wurde. Nach der Inkubation fließen mindestens 800 Mikroliter Blockierungspuffer mit einer Geschwindigkeit von 200 Mikrolitern pro Minute durch den Kanal, um die ungebundene DNA aus dem Kanal zu spülen. Stellen Sie den Fokus des Mikroskops so ein, dass die oberflächengebundenen Quantenpunkte deutlich sichtbar sind.Spülen Sie das mikrofluidische Gerät mit 800 Mikrolitern experimentellem Puffer ohne Magnesium bei einer Durchflussrate von 200 Mikrolitern pro Minute. Die REase wird zu einem Aliquot aus experimentellem Puffer ohne Magnesium gegeben und durch Pipettieren vorsichtig gemischt. Fließen Sie 800 Mikroliter von 400 Einheiten pro Milliliter EcoRV mit einer Durchflussrate von 200 Mikrolitern pro Minute durch den Kanal.Beginnen Sie das Experiment, indem Sie den experimentellen Puffer, der Magnesium und Fluorescein enthält, mit einer Durchflussrate von 200 Mikrolitern pro Minute fließen. Beginnen Sie sofort nach dem Starten der Spritzenpumpe mit der Datenerfassung. Stoppen Sie die Datenerfassung, nachdem 800 Mikroliter Puffer geflossen sind.Nach dem Einbringen des DNA-Substrats in die Flusszelle und dem Wegspülen von überschüssiger DNA und Quantenpunkten befinden sich typischerweise Tausende von einzelnen Quantenpunkten in einem Sichtfeld. Sie sind stabil mit der Glasoberfläche verbunden und erleiden während des gesamten Versuchs kein merkliches Dimmen oder signifikantes Ausbleichen. Wenn die REase in Abwesenheit von Magnesium durch den Kanal geflossen ist, sind am Ende des Beobachtungszeitraums noch mindestens 95% der zu Beginn des Experiments vorhandenen Quantenpunkte zu sehen.Wird der magnesiumhaltige Puffer jedoch unmittelbar nach der REase geflowt, verschwinden bis zum Ende des Beobachtungszeitraums bis zur Hälfte der Quantenpunkte, ähnlich wie bei der gemeinsamen Strömung von REase und Magnesium durch den Kanal. Das Verschwinden von Quantenpunkten geschieht schnell und führt zu einer starken Abnahme der Intensitätskurve, was einen klaren Hinweis auf den Zeitpunkt gibt, zu dem ein bestimmtes DNA-Molekül gespalten wird. Dieses Experiment wurde mit der gut untersuchten Typ II P REase EcoRV durchgeführt.Sowohl die nichtlineare Kurvenanpassung der kleinsten Quadrate als auch die Schätzung der Maximum-Likelihood-Parameter wurden verwendet, um die Werte von n und beta aus den Daten zu extrahieren. Die beiden Methoden zur Parameterschätzung stimmten überein. Unter Verwendung der nichtlinearen Anpassung der kleinsten Quadrate betrug n 3,52 und beta 5,78 Sekunden.Unter Verwendung der Maximum-Likelihood-Schätzung betrug n 3,41 und Beta 6,06 Sekunden. Dieser Assay kann den Nachweis erbringen, dass Zwischenschritte entlang des Spaltungswegs vorhanden sind. Die Durchführung dieses Assays unter sich ändernden Reaktionsbedingungen kann dazu beitragen, die Art von Reaktionszwischenprodukten zu bestimmen, die nicht direkt beobachtet werden können.

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Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

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Einzelmolekül-Verweilzeitanalyse der Restriktionsendonuklilease-vermittelten DNA-Spaltung

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