Name: Generierung von selbst zusammengesetzten vaskularisierten äquivalenten menschlicher Haut (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-12T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Lernen Sie die Generierung vaskularisierter humaner Hautäquivalente für Tissue Engineering und personalisierte Medizin. Dieses Protokoll ermöglicht langfristige Kultur und physiologisch relevante Studien zu Krankheiten und Alterung.

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Die Autoren danken Dr. Jim Rheinwald59 und Dr. Ellen H. van den Bogaard20 für ihre großzügige Schenkung von N/TERT-Zelllinien. Diese Arbeit wurde von der American Heart Association (19IPLOI34760636) unterstützt.

Die Autoren haben nichts preiszugeben.

Dieses Protokoll hat eine einfache und wiederholbare Methode zur Erzeugung von VHSEs und deren dreidimensionaler Analyse demonstriert. Wichtig ist, dass diese Methode auf wenigen spezialisierten Techniken oder Ausrüstungsteilen beruht, was sie für eine Reihe von Laboren zugänglich macht. Darüber hinaus können Zelltypen durch begrenzte Änderungen im Protokoll ersetzt werden, so dass forscher dieses Protokoll an ihre spezifischen Bedürfnisse anpassen können.
Die richtige Kollagengelierung ist ein herausfordernder Schritt bei der Etablierung der Hautkultur. Insbesondere bei der Verwendung von Rohpräparaten ohne Reinigung können Spurenverunreinigungen den Gelierungsprozess beeinflussen. Um die Konsistenz zu gewährleisten, sollten Gruppen von Experimenten mit dem gleichen Kollagenbestand durchgeführt werden, der für die VHSE-Erzeugung verwendet wird. Darüber hinaus sollte die Gelierung idealerweise bei einem pH-Wert von 7-7,4 erfolgen, und Spurenverunreinigungen können den pH-Wert verschieben. Vor der Verwendung eines Kollagenvorrats sollte ein azelluläres Übungsgel in der gewünschten Konzentration hergestellt und der pH-Wert vor der Gelierung gemessen werden. Wenn Sie diese Kollagenqualitätsprüfung vor Beginn der aussaat dermalen Komponenten durchführen, werden die Probleme mit der richtigen Gelierung und Kollagenhomogenität identifiziert, bevor ein vollständiges Experiment eingerichtet wird. Anstatt azelluläres Kollagen direkt auf einen Kultureinsatz zu säen, säen Sie etwas Kollagen auf einen pH-Streifen, der die gesamte pH-Skala bewertet und einen pH-Wert von 7-7,4 überprüft. Die Gelierung kann bewertet werden, indem ein Tröpfchen der Kollagengellösung auf eine Abdeck- oder Gewebekultur-Kunststoff-Well-Platte auftät wird (eine Well-Platte wird empfohlen, um die engen Seiten eines Kultureinsatzes zu simulieren). Nach der Gelationszeit sollte das Kollagen fest sein, d.h. es sollte nicht fließen, wenn die Platte geneigt ist. Unter Phasenkontrastmikroskopie sollte das Kollagen homogen und klar aussehen. Gelegentliche Blasen aus der Kollagenaussaat sind normal, aber große amorphe Klumpen von undurchsichtigem Kollagen im klaren Gel weisen auf ein Problem hin - wahrscheinlich aufgrund unzureichender Mischung, falschem pH-Wert und / oder Versagen, das Kollagen während des Mischens gekühlt zu halten.
Die Zellaussaatmengen und -medien können angepasst werden. Im obigen Protokoll wurden die verkapselten Zellmengen für einen 12-Well-Insert bei 7,5 x 104 Fibroblasten und 7,5 x 105 Endothelzellen pro ml Kollagen mit 1,7 x 10 5 Keratinozyten optimiert, die auf dem hautlichenKonstrukt ausgesät sind. Die Zelldichten wurden für dieses VHSE-Protokoll optimiert, basierend auf den Vorstudien und den bisherigen Forschungen, die die 3D-Gefäßnetzwerkerzeugung in verschiedenen Kollagenkonzentrationen48 und der HSE-Generation22,80,81untersuchten. In ähnlichen Systemen betragen die veröffentlichten Endothelzelldichten 1,0 x 106 Zellen/ml Kollagen48; die Fibroblastenkonzentrationen reichen oft von 0,4 x 105 Zellen/ml Kollagen22,28,82 bis 1 x 105 Zellen / ml Kollagen8,58,83,84,85; und die Keratinozytenkonzentrationen reichen von 0,5 x 105 [Zellen/cm2]80 bis 1 x 105 [Zellen/cm2]8. Zelldichten können für bestimmte Zellen und Forschungsfragen optimiert werden. Dreidimensionale Kulturen mit kontraktilen Zellen, wie Fibroblasten, können sich zusammenziehen, was zu einer Verringerung der Lebensfähigkeit und einem Kulturverlust führt86,87. Vorläufige Experimente sollten durchgeführt werden, um die Kontraktion des Hautkompartiments zu testen (was bei mehr hautlichen Zellen, kontraktileren Hautzellen, längeren Tauchkulturen oder weicheren Matrizen auftreten kann) und um die epidermale Oberflächenabdeckung zu testen. Darüber hinaus können die Anzahl der Tage im Untertauchen und die Rate der Verjüngung des Serumgehalts auch angepasst werden, wenn eine übermäßige Hautkontraktion auftritt oder eine andere Keratinozytenabdeckung erforderlich ist. Wenn beispielsweise während der Periode des dermalen Submersions eine Kontraktion bemerkt wird oder während Keratinozyten eine Oberflächenmonoschicht aufbauen, kann eine schnellere Bewegung durch den Serumverjüngungsprozess und das Anheben von VHSEs auf ALI dazu beitragen, zusätzliche Kontraktion zu verhindern. Wenn die Keratinozytenabdeckung nicht ideal ist, kann die Änderung der Anzahl der Tage, an denen die VHSE ohne Serum untergetaucht wird, dazu beitragen, die epidermale Monoschichtabdeckung zu erhöhen und die Kontraktion zu mildern, da das Serum weggelassen wird. Veränderungen der Zelldichten oder andere oben genannte Vorschläge müssen für die spezifischen Kulturen und Forschungsziele optimiert werden.
Um eine ordnungsgemäße Schichtung der Epidermis während der ALI-Periode (Air Liquid Interface) zu erreichen, ist es wichtig, den Flüssigkeitsstand in jeder Vertiefung regelmäßig zu überprüfen und aufrechtzuerhalten, damit ALI und eine angemessene Hydratation jedes Konstrukts während der gesamten Kulturlänge erhalten bleiben. Medienpegel sollten täglich überprüft und verfolgt werden, bis konsistente ALI-Werte festgelegt sind. Die epidermale Schicht sollte hydratisiert aussehen, nicht trocken, aber es sollte keine Medienpools auf dem Konstrukt geben. Während der ALI entwickelt das Konstrukt eine undurchsichtige weiße / gelbe Farbe, die normal ist. Die epidermale Schicht wird sich wahrscheinlich ungleichmäßig entwickeln. Üblicherweise sind die VHSEs aufgrund der Kollagenaussaat oder dermalen Kontraktion geneigt. Es ist auch normal, einen höheren epidermalen Anteil in der Mitte des Konstrukts in kleineren Konstrukten (24 Well-Größe) und eine Ridge-Formation um den Umfang des VHSE in 12 Well-Größe zu beobachten. Die Kontraktion derKonstrukte 13 kann diese topographischen Formationen verändern und/oder überhaupt nicht beobachtet werden.
Die Färbung und Bildgebung von VHSEs führt zu mechanischer Manipulation der VHSEs. Es ist sehr wichtig, die Manipulation jeder Kultur zu planen und zu begrenzen. Wenn eine Manipulation erforderlich ist, sollten Sie beim Entfernen von VHSEs von den Einlegemembranen, beim Hinzufügen von Flecken- oder Waschlösungen zur Konstruktionsoberfläche und beim Entfernen und Ersetzen von VHSEs in ihren Lager- / Bildgebungsbrunnen während der Bildgebungsvorbereitung sanfte Bewegungen beibehalten. Insbesondere die apikalen Schichten der epidermalen Komponente können zerbrechlich sein und laufen Gefahr, die basalen epidermalen Schichten abzusedeln. Apikale Schichten der Epidermis sind zerbrechlich und durchlaufen auch im nativen Gewebe eine Abschämierung4, aber für eine genaue Analyse der epidermalen Struktur ist es wichtig, Schäden oder Verluste zu minimieren. Wenn epidermale Schichten vom Konstrukt abheben, können sie separat abgebildet werden. Die Basalschichten der Epidermis sind höchstwahrscheinlich noch an der Dermis befestigt, während sich Teile der apikalen Schichten lösen können. Für die Visualisierung der Epidermis ist ein Kernfleck hilfreich, um dies zu beobachten, da dichte Kerne ein Merkmal der unteren und mittleren Schichten der Epidermis sind.
Die konfokale Bildgebung der VHSE-Postfixierung wurde im Protokoll diskutiert, aber es ist auch möglich, die VHSEs in der gesamten Kultur über die aufrechte optische Kohärenztomographie (OCT)88 , 89,90,91,92,93abbilden. VHSE sind stabil genug, um der Bildgebung ohne Inkubation oder Befeuchtung für mindestens zwei Stunden ohne spürbare Effekte standzuhalten. Da OCT markierungsfrei und nichtinvasiv ist, ist es möglich, die epidermale Dicke während der Reifung zu verfolgen. Andere nichtinvasive Bildgebungsmodalitäten können wahrscheinlich ebenso eingesetzt werden.
Die volumetrische Bildgebung der kombinierten dermalen und epidermalen Strukturen kann aufgrund der Laserdämpfung tiefer in der VHSE eine Herausforderung darstellen. Dies kann durch die Abbildung des Konstrukts in zwei Orientierungen gemildert werden, von der epidermalen Seite (Abbildung 1) und von dermalen Seite (Abbildung 2), was eine gute Auflösung dermaler vaskulärer Strukturen und der Epidermis ermöglicht. Darüber hinaus kann die Probe gelöscht werden, was volumetrische Bilder der gesamten Struktur mit minimaler Dämpfung ermöglicht. Es wurden mehrere Clearingmethoden versucht, jedoch lieferte die beschriebene Methanol/Methylsalicylat-Methode die besten Ergebnisse. Forscher, die an der Optimierung anderer Clearing-Methoden interessiert sind, werden auf diese Reviews49,61,62gerichtet. Beim Clearing wird empfohlen, die Probe vor dem Clearing vollständig abbilden, da die Methode die Fluorophore und/oder die Struktur beschädigen kann. Weiterhin sollte die Bildgebung so schnell wie möglich nach dem Löschen abgeschlossen sein, da die Fluoreszenz innerhalb von Tagen verblassen kann.
Aus Gründen der Einfachheit und Zugänglichkeit verwendete dieses Protokoll die einfachsten Medienmischungen, die in der vorherigen Literatur11,80zu finden waren. Obwohl die Verwendung einfacher Medienmischungen viele Vorteile bietet, werden auch die Einschränkungen dieser Wahl erkannt. Andere Gruppen haben die Auswirkungen spezifischer Medienkomponenten auf die epidermale und dermale Gesundheit untersucht und festgestellt, dass andere Medienzusätze94, wie externe freie Fettsäuren / Lipide, das Stratum corneum der Epidermis verbessern und die Hautbarrierefunktion verbessern. Obwohl unsere Immunfluoreszenzmarker eine angemessene Differenzierung und Schichtung in der Epidermis zeigen, kann je nach durchgeführten Studien eine zusätzliche Medienoptimierung erforderlich sein. Darüber hinaus wurde bei der Bewertung der hier vorgestellten VHSEs keine umfassende Analyse des epidermalen BM durchgeführt. Die Integrität des BM ist ein wichtiger Hinweis auf Hautäquivalente; Verschiedene Gruppen haben die Kulturdauer und ihre Wirkung auf BM-Markierungen95 sowie die Analyse der Fibroblastenpräsenz und der zusätzlichen Wachstumsfaktoreffekte auf die BM-Expression14 untersucht. Es ist wichtig zu beachten, dass die Analyse der BM-Komponente bei verwendung dieses Protokolls ausgewertet und optimiert werden sollte.
In diesem Protokoll wird ein Verfahren zur VHSE-Erzeugung beschrieben, das Ergebnisse nach 8 Wochen bei ALI zeigt. VHSE-Kulturen wurden bis zu 12 Wochen bei ALI kultiviert, ohne dass sich die Lebensfähigkeit merklich verändert oder verloren hat, und es ist möglich, dass sie länger lebensfähig sind. Wichtig ist, dass dieses Protokoll leicht an allgemein verfügbare Zelltypen angepasst werden kann, wie der Ersatz von dermalen Fibroblasten durch IMR90-Lungenfibroblasten zeigt. Abhängig vom Bedarf des Forschers und den verfügbaren Ressourcen können die Zelltypen und Medienmischungen auf der Kultur angepasst werden, obwohl andere Zelltypen eine Medienoptimierung erfordern können. Zusammenfassend sollen diese Verfahren Klarheit über die Kultur von VHSEs für das Studium der Hautbiologie und -krankheit schaffen. Um die Zugänglichkeit zu maximieren, wurde das Protokoll so einfach und robust mit gängigen Geräten, Zelllinien und Reagenzien als minimaler effektiver Ansatz entwickelt, der weiter an die spezifischen Bedürfnisse von Forschungsstudien angepasst werden kann.

Die menschliche Haut erfüllt viele wesentliche biologische Funktionen, einschließlich der Funktion als immune / mechanische Barriere, regulierung der Körpertemperatur, Teilnahme an Wassereinlagerungen und sensorischen Rollen1,2,3,4. Anatomisch ist die Haut das größte Organ im menschlichen Körper und besteht aus drei Hauptschichten (Epidermis, Dermis und Hypodermis) und besitzt neben epidermalen Zellen ein komplexes System von Stroma-, Vase-, Drüsen- und Immun- / Nervensystemkomponenten. Die Epidermis selbst besteht aus vier Zellschichten, die kontinuierlich erneuert werden, um die Barrierefunktion und andere Strukturen der nativen Haut (z. B. Schweiß und Talgdrüsen, Nägel)aufrechtzuerhalten 3. Die Hautphysiologie ist wichtig für die Immunfunktion, die Wundheilung, die Krebsbiologie und andere Bereiche, was die Forscher dazu veranlasst, eine breite Palette von Modellen zu verwenden, von In-vitro-Monokulturen bis hin zu In-vivo-Tiermodellen. Tiermodelle bieten die Möglichkeit, die volle Komplexität der Hautphysiologie zu untersuchen, jedoch haben häufig verwendete Tiermodelle wie Mäuse signifikante physiologische Unterschiede im Vergleich zum Menschen5. Diese Einschränkungen und die gestiegenen Kosten für Tiermodelle haben viele Forscher dazu veranlasst, sich auf die Entwicklung von In-vitro-Modellen zu konzentrieren, die die Physiologie der menschlichen Haut besser widerspiegeln1,6. Von diesen ist einer der einfacheren Modelltypen das humane epidermale Äquivalent (HEE; auch als halbdicke Hautmodelle bezeichnet), das nur aus epidermalen Keratinozyten auf einer azellulären dermalen Matrix besteht, aber die epidermale Differenzierung und Schichtung in vivo erfasst. Darauf aufbauend werden Modelle, die dermale und epidermale Komponenten (Keratinozyten und Fibroblasten) enthalten, oft als humane Hautäquivalente (HSE), Hautmodelle mit voller Dicke oder organotypische Hautkonstrukte (OSC) bezeichnet. Kurz gesagt, diese Modelle werden durch Einkapselung von Hautzellen in Gelmatrizen und Aussaat von epidermalen Zellen darüber erzeugt. Epidermale Differenzierung und Schichtung können dann über spezialisierte Medien und Luftexposition erreicht werden7. Hautäquivalente wurden am häufigsten durch Selbstorganisationstechniken unter Verwendung von Hautgelen aus Kollagen Typ I (entweder aus Rattenschwanz oder Rinderhaut)1,8erzeugt, aber ähnliche Modelle haben andere Matrixkomponenten wie Fibrin9,10, Fibroblast abgeleitet11,12, Cadaveric deepidermisierte Membranen13,14,15,16, handelsübliche Gele und andere1,12,13 ,17,18,19. Derzeit gibt es Skin-Äquivalente im Handel erhältlich (wie zuvor überprüft1,2). Diese werden jedoch in erster Linie für therapeutische Zwecke entwickelt und können nicht ohne weiteres an spezifische Forschungsfragen angepasst werden.
HSEs wurden in Studien zur Wundheilung, Transplantation, Toxikologie und Hauterkrankungen / -entwicklung11,12,13,16,8,20,21,22,23angewendet. Obwohl die 3D-Kultur die Funktionen des menschlichen Gewebes im Vergleich zu 2D-Kulturenumfassender modelliert 24,ermöglicht die Einbeziehung verschiedener Zelltypen, die die In-vivo-Population genauer widerspiegeln, Studien zur Zell-Zell-Koordination in komplexen Geweben24,25,26. Die meisten HSEs umfassen nur dermale Fibroblasten und epidermale Keratinozyten27, obwohl die In-vivo-Hautumgebung viele andere Zelltypen umfasst. Jüngste Studien haben begonnen, mehr Zellpopulationen einzubeziehen; Dazu gehören Endothelzellen inGefäßen 10,28,29,30,31,32,33,34, Adipozyten im Subkutangewebe35,36, Nervenkomponenten19,21, Stammzellen27, 37,38, Immunzellen10,39,40,41,42und andere krankheits- / krebsspezifische Modelle16,40,43,44,45,46,47. Besonders wichtig unter diesen ist vaskulatur; Während einige HSEs Gefäßzellen umfassen, fehlen ihnen insgesamt immer noch umfassende Kapillarelemente mit Konnektivität über die gesamte Dermis10,29 , erweiterte In-vitro-Stabilität28und angemessene Gefäßdichte. Darüber hinaus werden HSE-Modelle typischerweise durch histologische Abschnitte nach der Kultur bewertet, die die Analyse der dreidimensionalen Struktur von HSEs begrenzen. Die dreidimensionale Analyse ermöglicht die volumetrische Beurteilung derGefäßdichte 48,49 sowie die regionale Variation der epidermalen Dicke und Differenzierung.
Obwohl HSEs eines der häufigsten organotypischen Modelle sind, gibt es viele technische Herausforderungen bei der Generierung dieser Konstrukte, einschließlich der Identifizierung geeigneter extrazellulärer Matrix- und Zelldichten, Medienrezepturen, geeigneter Luftflüssigkeitsschnittstellenverfahren und Postkulturanalyse. Während HEE- und HSE-Modelle Protokolle veröffentlicht haben, gibt es kein detailliertes Protokoll, das dermale Vaskulatur und volumetrische Bildgebung anstelle einer histologischen Analyse enthält. Diese Arbeit stellt ein zugängliches Protokoll für die Kultur vaskularisierter menschlicher Hautäquivalente (VHSE) aus hauptsächlich kommerziellen Zelllinien dar. Dieses Protokoll ist so geschrieben, dass es leicht anpassbar ist und eine einfache Anpassung an verschiedene Zelltypen und Forschungsbedürfnisse ermöglicht. Im Interesse der Zugänglichkeit, Verfügbarkeit und Kosten wurde der Einsatz einfacher Produkte und Erzeugungstechniken gegenüber der Verwendung kommerziell erhältlicher Produkte priorisiert. Des Weiteren werden einfache volumetrische Bildgebungs- und Quantifizierungsverfahren beschrieben, die eine Beurteilung der dreidimensionalen Struktur der VHSE ermöglichen. Die Umsetzung dieses Verfahrens in ein robustes und zugängliches Protokoll ermöglicht es nicht-spezialisierten Forschern, diese wichtigen Modelle in der personalisierten Medizin, dem vaskularisierten Tissue Engineering, der Transplantatentwicklung und der Arzneimittelbewertung anzuwenden.

<table><tbody><tr><td>1 N NaOH</td><td>Fisher Chemical</td><td>S318-100</td> <td>(Verdünnt aus Labormaterial)</td></tr><tr><td>4% Paraformaldehyd</td><td>ACROS Organics</td><td>#41678-5000, Los # B0143461</td><td>Hergestellt aus festem Paraformaldehyd in PBS, pH-Wert eingestellt auf 6,9</td></tr><tr><td>Autoklavierte Pinzette</td><td>Fine Science Tools</td><td>#11295-00</td><td>Dumont #5 Pinzette</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Fisher Bioreagenzien</td><td>Katze # BP510-250, Los # 190231</td><td>Rnase, Dnase, Proteasefreie</td></tr><tr><td>Zelllinie, Endothel: Mikrovaskuläre Endothelzelle (HMEC1)</td><td>ATCC</td><td>CRL-3243</td><td>SV40 Immortalisierte mikrovaskuläre Endothelzelle. Beachten Sie, dass 750.000 Zellen/ml Kollagen verwendet wurden.</td></tr><tr><td>Zelllinie, Fibroblasten: dermal Humane Fibroblasten, adulte</td><td>ATCC</td><td>PCS-201-012</td><td>Primäre dermale Zellen. Beachten Sie, dass 75.000 Zellen/ml Kollagen verwendet wurden.</td></tr><tr><td>Zelllinie, Fibroblasten: humane Lungen-Firbroblasten (IMR90)</td><td>ATCC</td><td>CCL-186</td><td>Primäre embryonale Zellen. Beachten Sie, dass 75.000 Zellen/ml Kollagen verwendet wurden.</td></tr><tr><td>Zelllinie, Keratinozyten: N/TERT-1</td><td></td><td></td><td>immortalisiert über hTERT-Expression. N/TERT-1 wurde unter Verwendung eines retroviralen Vektors hergestellt, der Hygromycinresistenz verleiht. Zelllinie etabliert von Dickson et al. 2000. Kann durch ATCC PCS-200-010 oder PCS-200-011 ersetzt werden. Beachten Sie, dass 170.000 Zellen pro Konstrukt verwendet wurden; N/TERT1-Zellen müssen von Platten verwendet werden, die zu 30 % konfluent sind – zwei 30 % konfluente 90-mm-Gewebekulturschalen liefern mehr als genug Zellen. Die Autoren danken Dr. Jim Rheinwald und Dr. Ellen H. van den Bogaard für ihre großzügige Spende von N/TERT-Zelllinien.</td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Thermo Scientific; Sorvall Legend X1R</td><td></td> <td>(Standard-Laborausrüstung)</td></tr><tr><td>Computersoftware</td><td>MATLAB MATLAB</td><td>2020a</td><td>MathWorks, Natick, MA.</td></tr><tr><td>Konfokales Mikroskop</td><td>Leica TCS SPEII konfokal</td><td></td><td>Laserscanning konfokal. Kann durch andere Konfokale oder Dekonvolutionsmikroskopie ersetzt werden.</td></tr><tr><td>Deckglas (22 x 22)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545F</td><td>0,13-0,17 mm Nr.1 Dicke</td></tr><tr><td>Cyanacrylat Sekundenkleber oder Silikonfett</td><td>Glue Masters</td><td>#THI0102</td><td>Glue Masters, THICK, Instant Glue, Cyanacrylat; Sekundenkleber wird bevorzugt</td></tr><tr><td>DMEM Medienbasis</td><td>Corning; Mediatech, Inc</td><td>REF # 10-013-CM; Los # 26119007</td><td>DMEM, 1X (Dulbecco's Modifikation von Eagle's Medium) mit 4,5 g/L Glukose, L-Glutamin & Natriumpyruvat</td></tr><tr><td>DMEM/F-12 50/50</td><td>Corning; Mediatech, Inc</td><td>REF # 10-090-CV; Los # 21119006</td><td>DMEM/F-12 50/50, 1X (Dulbecco's Mod. Of Eagle's Medium/Ham's F12 50/50 Mix) mit L-Glutamin-Ethanol</td></tr><tr><td></td><td>Decon Labs</td><td>#V1101</td><td>(Standard-Laborreagenz)</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Fisher Scientific</td><td>Katze # FB12999102, Los # AE29451050</td><td>Fötales Rinderserum in Forschungsqualität, dreifach 0,1 μm steril gefiltert</td></tr><tr><td>Pinzette mit feiner Spitze</td><td>Fine Science Tools</td><td>#11295-00</td><td>Dumont #5 Pinzette</td></tr><tr><td>Menschlicher epidermaler Wachstumsfaktor EGF</td><td>Peprotech</td><td>Cat # AF-100-15-1MG, Lot # 0318AFC05 D0218</td><td>Hergestellt in 0,1% BSA in PBS</td></tr><tr><td>Hydrocortison</td><td>Alpha Easar</td><td>Lot # 5002F2A</td><td>Hergestellt in DMSO</td></tr><tr><td>Insulin (Human)</td><td>Peprotech</td><td>Lot # 9352621</td><td></td></tr><tr><td>Inverses Licht-/Phasenkontrastmikroskop</td><td>VWR</td><td>76317-470</td> <td>(Standard-Laborausrüstung)</td></tr><tr><td>Isoproterenol</td><td>Alfa Aesar</td><td>#AAJ6178806</td><td>DL-Isoproterenolhydrochlorid, 98%</td></tr><tr><td>Keratinozyten-SFM (1x) Medienbasis</td><td>Gibco; Life Technologies Corporation</td><td>REF #: 10724-011; Charge # 2085518</td><td>Keratinocyte-SFM (1X); serumfreies Medium</td></tr><tr><td>L-Ascorbinsäure</td><td>Fisher Chemical</td><td>Cat # A61-100, Lot # 181977, CAS # 50-81-7</td><td>kristallin. L-Ascorbinsäure kann auch als Salz gekauft werden</td></tr><tr><td>L-Glutamin (fest)</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>CAT # BP379-100, LOT # 172183, CAS # 56-85-9</td><td>L-Glutamin, weiße Kristalle oder kristallines Pulver</td></tr><tr><td>MCDB 131 Medienbasis</td><td>Gen Depot</td><td>CM034-050, Los # 03062021</td><td>MCDB 131 mittlere Base, kein L-Glutamin, steril gefiltert</td></tr><tr><td>Metallstempel</td><td>Sona Enterprises (SE)</td><td>791LP, 12PC</td><td>Hohlleder-Stanzsatz, Stahl mit hohem Kohlenstoffgehalt, Härte: 48HRC; (verschiedene Größen einschließlich): 1/8", 5/32", 3/16", 7/32", 1/4", 9/32", 5/16", 3/4", 7/16", 1/2", 5/8:, 3/4". Dieses Stanzset ist hilfreich, aber das x-acto Messer kann auch funktionieren. Die Größe des Metallstempels, der gut für 12-Well-Transwell-VHSE geeignet ist, beträgt 3/8" oder 1/2".</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher Chemical</td><td>CAS # 67-56-1</td> <td>(optional). Zur Beseitigung des Dehydrationsschritts.</td></tr><tr><td>Methylsalicylat</td><td>Fisher Chemical</td><td>O3695-500; Los # 164535; CAS # 119-36-8</td> <td>(fakultativ). Zum Clearing.</td></tr><tr><td>Mikroröhrchen, 1,7 mL</td><td>Genesee Scientific Corporation; Olympus Plastics</td><td>Katze # 24-282; Los # 19467</td><td>1,7 ml Mikroröhrchen, klar; Kochfestes, polypropulenes, zertifiziertes Rnase-, Dnase-, DNA-, PCR-Inhibitor- und Endotoxin-freies</td></tr><tr><td>PBS, 10x Kulturqualität oder autoklaviert</td><td>APEX Bioresearch Products</td><td>Cat # 20-134, Los # 202237</td><td>PBS-Puffer, 10x Trockenpackung; geben Sie den Inhalt der Packung in den Behälter und fügen Sie Wasser zu 1 Liter hinzu, um 10x konzentriertes Produkt herzustellen.</td></tr><tr><td>PBS, 1x Kulturqualität, (-) Kalzium, (-) Magnesium</td><td>Genesee Scientific Corporation</td><td>Ref # 25-508; Los # 07171015</td><td></td></tr><tr><td>PBS, 1x</td><td>APEX Bioresearch Products</td><td>Cat # 20-134, Los # 202237</td><td>PBS Puffer, 10x Trockenpackung; Inhalt der Packung in den Behälter geben und Wasser auf 1 Liter geben, um 10x konzentriertes Produkt herzustellen. 1x mit Wasser verdünnen.</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Gibco; Life Technologies Corporation</td><td>Ref # 15140-122, Los # 2199839</td><td>Pen Strep (10.000 Einheiten/ml Penicillin; 10.000 μg/ml Streptomycin)</td></tr><tr><td>Petrischale, Glas, klein</td><td>Corning</td><td>PYREX 316060</td> <td>(optional). Zur Verwendung als Clearing-Behälter</td></tr><tr><td>Petrischale, 100 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713</td><td>Zur Herstellung von PDMS verwenden.</td></tr><tr><td>Polydimethylsiloxan (PDMS)</td><td>Dow Corning</td><td>GMID 02065622, Charge # H04719H035</td><td>Sylgard 184 Silikonelastomerbasis, Dow Corning, Midland, MI)</td></tr><tr><td></td><td>Dow Corning</td><td>GMID 02065622, Charge # H047JC4003</td><td>DOWSIL 184, Silikonelastomer-Härter</td></tr><tr><td colspan="4">Hinweis: PDMS wird normalerweise als Kit verkauft, das sowohl die Basis- als auch die Härterkomponente enthält.</td></tr><tr><td>Verdrängerpipetten (1000 & 250 μl)</td><td>Gilson</td><td>1000 μl: HM05136, M1000. 250 μl: T12269L</td><td>M1000 Pipettenkapazität (100-1000 μl); M250 Pipettenkapazität bis 250 μl</td></tr><tr><td>Verdrängerspitzen/Kolben (1000 & 250 μl)</td><td>Gilson</td><td>1000 μl: CAT # F148180, BATCH # B01292902S; 250 μl: CAT # F148114, BATCH # B05549718S</td><td>Sterilisierte Kapillaren und</td></tr><tr><td>Kolben Scoopula</td><td></td><td></td> mit runder Spitze <td>(optional; Standard-Laborausrüstung) Zur Manipulation von VHSEs vor der</td></tr><tr><td>Bildgebung Ergänzungen für Keratinozyten-SFM-Medien</td><td>Gibco; Life Technologies Corporation</td><td>Ref # 37000-015, Los # 2154180</td><td>Enthält EGF Human Recombinant (Kat # 10450-013), Rinder-Hypophysenextrakt (Kat # 13028-014)</td></tr><tr><td>Gewebekulturplatteneinsätze, 12 Well-Größe, 3 & Mikro; m Porengröße</td><td>Corning; Costar</td><td>REF # 3462 - Klarsicht; Los # 14919057</td><td>Transwell; Einsätze mit 12 mm Durchmesser, Porengröße 3,0 μm, Gewebekultur behandelt, Polyestermembran, Polystyrolplatten,&nbsp;</td></tr><tr><td>Gewebekulturplatten, Greiner Bio-one in der Größe 12 Wells</td><td>; CellStar</td><td>Katze # 665 180; Los # E18103QT</td><td>12-Well-Zellkulturplatte; steril, mit Deckel; die Produkte sind steril, frei von nachweisbarer Dnase, Rnase, menschlicher DNA und Pyrogenen. Inhalt nicht-zytotoxische</td></tr><tr><td>Gewebekulturplatten, 60,8cm^2 Wachstumsfläche</td><td>Genesee Scientific Corporation</td><td>Kat # 25-202; Los-Nr.: 191218-177B</td><td>Gewebekulturschalen; behandelt, Wachstumsfläche 60,8 cm^2; steril, Dnase, Rnase, Pyrogenfrei; reines Polystyrol</td></tr><tr><td>Triton x 100</td><td>Ricca Chemical Company</td><td>Cat # 8698.5-16, Los # 4708R34</td><td>Netzmittel</td></tr><tr><td>Trypsin 0,25%</td><td>Corning; Mediatech, Inc</td><td>Ref # 25-053-CI</td><td>0,25% Trypsin, 2,21 mM EDTA, 1x [-] Natriumbicarbonat</td></tr><tr><td>Typ 1 Kollagen isoliert aus Rattenschwanz</td><td>Pel-Freez Biologicals</td><td>56054-1</td><td>Sprauge-Dawley Rattenschwänze können gefroren von Pel-Freez oder anderen Lieferanten gekauft werden. Kollagen kann aus den Schwanzsehnen isoliert werden. Referenzen zum Isolationsprotokoll [Cross et al.,2010; Rajan et al., 2007; Bornstein, 1958] . Alternativ kann hochkonzentriertes Rattenschwanzkollagen von Lieferanten wie Corning (Katalognummer: 354249)</td></tr><tr><td>Vakuumkammer, Tischgerät</td><td>Bel-Art</td><td>F42010-0000</td> <td>(Standard-Laborausrüstung)</td></tr> erworben werden. <tr><td>Handheld-Präzisionsmesser</td><td>X-Acto</td><td>X3311</td> <td>(X-Acto-Messer optional, wenn Stahlstempel gekauft wurden)</td></tr></tbody></table>

generierung von selbst zusammengesetzten vaskularisierten äquivalenten menschlicher haut

Generation of Self-assembled Vascularized Human Skin Equivalents

Human Skin Equivalents (HSEs) sind gewebegefertigte Konstrukte, die epidermale und dermale Komponenten der menschlichen Haut modellieren. Diese Modelle wurden verwendet, um hautentwicklung, Wundheilung und Transplantationstechniken zu untersuchen. Vielen HSEs fehlt es weiterhin an Vaskulatur und sie werden zusätzlich durch histologische Postkulturschnitte analysiert, die die volumetrische Beurteilung der Struktur einschränken. Hier wird ein einfaches Protokoll vorgestellt, das zugängliche Materialien verwendet, um vaskularisierte menschliche Hautäquivalente (VHSE) zu erzeugen. Weiter beschrieben sind volumetrische Bildgebungs- und Quantifizierungstechniken dieser Konstrukte. Kurz gesagt, VHSEs werden in 12 Well-Culture-Inserts aufgebaut, in denen dermale und epidermale Zellen in Rattenschwanzkollagen Typ I Gel eingesät werden. Das dermale Kompartiment besteht aus Fibroblasten und Endothelzellen, die im Kollagengel verteilt sind. Das epidermale Kompartiment besteht aus Keratinozyten (Hautepithelzellen), die sich an der Luft-Flüssig-Grenzfläche differenzieren. Wichtig ist, dass diese Methoden basierend auf den Bedürfnissen des Forschers anpassbar sind, wobei die Ergebnisse die VHSE-Erzeugung mit zwei verschiedenen Fibroblastenzelltypen zeigen: menschliche dermale Fibroblasten (hDF) und menschliche Lungenfibroblasten (IMR90s). VHSEs wurden entwickelt, durch konfokale Mikroskopie abgebildet und volumetrisch mit Computersoftware zu 4- und 8-Wochen-Zeitpunkten analysiert. Ein optimierter Prozess zum Fixieren, Färben, Abbilden und Löschen von VHSEs für die volumetrische Untersuchung wird beschrieben. Diese umfassenden Modell-, Bildgebungs- und Analysetechniken können leicht an die spezifischen Forschungsanforderungen einzelner Labore mit oder ohne vorherige HSE-Erfahrung angepasst werden.

Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Erzeugung und volumetrische Analyse von vaskularisierten menschlichen Hautäquivalenten unter Verwendung zugänglicher und einfacher Techniken für die Langzeitkultur zu beschreiben. Soweit möglich, wird die Begründung für die Schritte beschrieben, um den Forschern die Möglichkeit zu geben, sich an ihre Forschungsbedürfnisse anzupassen.

Generierung von selbst zusammengesetzten vaskularisierten äquivalenten menschlicher Haut

Human skin equivalents (HSEs) are tissue engineered constructs that model epidermal and dermal components of human skin. These models have been used to ...

Die in diesem Protokoll enthaltenen Details behandeln die äquivalente Erzeugung menschlicher Haut, die oft technisch anspruchsvoll ist. Neuartige äquivalente Protokollelemente der menschlichen Haut, wie Vaskulatur und volumetrische Bildgebung, sind enthalten. Die Technik ermöglicht die einfache Konstruktion eines Hautmodells, das in-vivo-Gewebe für die Untersuchung von Krankheiten, Alterung und personalisierter Medizin enger zusammenpasst.Der schwierigste Teil dieses Protokolls ist der Übergang zwischen Tauch- und Luft-Flüssig-Schnittstelle. Es wird wahrscheinlich ein paar Versuche dauern, um das Timing und die Medienebenen für konsistente Ergebnisse zu optimieren. Um zu beginnen, fügen Sie 516 Mikroliter Medien zu einem kalt verschlossenen Röhrchen hinzu und fügen Sie sofort 375 Mikroliter kaltes Kollagen mit der 1000-Mikroliter-Verdrängerpipette hinzu.Entfernen Sie die leere Pipettenspitze und wechseln Sie zum Mischen in die vorbereitete 250-Mikroliter-Verdrängerpipette. Mischen Sie schnell, aber sanft, um eine übermäßige Blasenbildung zu verhindern. Halten Sie die Spitze in der Lösung, mischen Sie gleichmäßig von verschiedenen Positionen des Rohres, bis die Lösung von homogener Farbe ist, was typischerweise etwa fünf Pipettenzyklen oder 10 Sekunden dauert.Verteilen Sie sofort 125 Mikroliter azelluläres Kollagen auf die Membran des 12-Well-Kultureinsatzes. Um eine gleichmäßige Abdeckung zu gewährleisten, neigen Sie die Platte und verwenden Sie die Pipettenspitze, um die Membran zu bemalen, indem Sie Kollagen sanft verteilen. Bewegen Sie die 12-Well-Platte sofort in einen 37-Grad-Celsius-Zellkultur-Inkubator, um sie mindestens 20 Minuten gelieren zu lassen.Nach der Gelationszeit nehmen Sie die 12-Well-Platte aus azellulärem Kollagen aus dem Inkubator. Entfernen Sie das 1,7 Milliliter-Kappenrohr aus nassem Eis, entfernen Sie dann das Brühekol aus der Kühlung und legen Sie es bei geöffnetem Deckel auf nasses Eis. 516 Mikroliter gekühlte Zellsuspension in das kalt verschlossene Rohr geben.Verwenden Sie die 1000-Mikroliter-Pipette, um sofort 375 Mikroliter kalte Kollagenlösung direkt in die Lösung im verschlossenen Röhrchen zu pipetten. Das gesamte Kollagen aus der Pipette in das Röhrchen ausstoßen und die Verdrängerpipettenspitze verwerfen. Wechseln Sie sofort zur 250-Mikroliter-Pipette und mischen Sie die Kollagenlösung Nach dem Mischen 250 Mikroliter zelluläre Kollagenlösung auf die azellulären Kollagenträger im 12-Well-Kultureinsatz übertragen und dann die 12-Well-Platte in einen 37 Grad Celsius Zellkultur-Inkubator bewegen.Nach der 30-minütigen Gelzeit neigen Sie die Platte vorsichtig, um die Gelierung zu beurteilen und stellen Sie sicher, dass das Kollagen verfestigt ist. 500 Mikroliter bzw. 1000 Mikroliter Mischmedien werden in die obere Kammer bzw. untere Kammer des Einsatzes gegeben. Stellen Sie sicher, dass das Kollagengel untergetaucht ist, und fügen Sie bei Bedarf weitere Medien hinzu.Legen Sie die Well-Platte zur Inkubation über Nacht in den Zellkultur-Inkubator. Verwenden Sie am siebten Tag des Untertauchens eine manuelle Pipette, um Medien aus der unteren und oberen Kammer jedes Konstruktbrunnens zu sammeln und zu entsorgen. Um Medien zu sammeln, die direkt unter der durchlässigen Membran stecken, legen Sie die Pipettenspitze unter die Membran und schlagen Sie den Einsatz vorübergehend aus dem Platz.Fügen Sie einen Milliliter menschliches Hautäquivalent oder HSE-Medium, ergänzt mit 5% FPS, in die untere Kammer jeder Vertiefung und 200 Mikroliter Zellsuspension in die obere Kammer jeder Vertiefung hinzu. Säen Sie die Keratinozyten direkt auf die Hautkonstruktoberfläche und lassen Sie sie zwei Stunden im Inkubator absetzen. Zwei Stunden nach der Aussaat der Keratinozyten fügen Sie vorsichtig 300 Mikroliter HSE-Medien hinzu, ergänzt mit 5% FPS in die obere Kammer jedes Konstruktbrunnens.Nachdem Sie das Medium geladen haben, legen Sie das Konstrukt wieder in den Inkubator. Heben Sie jedes Konstrukt mit einer manuellen Pipette an seine Luft-Flüssigkeits-Schnittstelle (ALI), indem Sie Nur Medienabfälle aus der oberen Kammer entfernen. Versuchen Sie, der epidermalen Schicht so nahe wie möglich zu kommen, ohne sie zu berühren oder zu beschädigen.Neigen Sie die Platten leicht in verschiedenen Winkeln, um das Medium zu sammeln, und fügen Sie dann etwa zwei Milliliter steriles Wasser zu den umgebenden Brunnen in der Platte hinzu, um eine konstante Feuchtigkeit aufrechtzuerhalten. Überprüfen Sie die Platte einige Stunden später, um sicherzustellen, dass sich die Keratinozyten noch am ALI befinden. Entfernen Sie alle Medien in der oberen Kammer und verfolgen Sie, wie viele Medien aus jedem Brunnen entfernt werden.Die epidermalen Schichten sollten hydratisiert und nicht trocken aussehen, aber es sollten keine Medien auf dem Konstrukt gebündelt sein. Um das Konstrukt für die immunfluoreszierende Färbung vorzubereiten, drehen Sie einen Einsatz auf den Kopf und legen Sie ihn über seinen Brunnen auf die Bohrplatte. Stabilisieren Sie den Einsatz mit einer Hand, während Sie mit einer feinen Spitzenzette oder einem Präzisionsmesser etwa die Hälfte des Membranumfangs schneiden.Schneiden Sie so nah wie möglich am Kunststoffgehäuse. Greifen Sie mit der Feinspitzenzette den Rand der geschnittenen Membranklappe und schälen Sie die poröse Membran vorsichtig vom Einsatz sowie vom VHSE-Konstrukt. Wenn das Konstrukt an der Seite der Kammer hängen bleibt, verwenden Sie die feine Spitzenzette oder eine kleine Schaufel, um es zum Brunnen zu bewegen.Sobald sich die VHSE im Bohrplatz befindet, entsorgen Sie alle verbleibenden Teile der Einlegemembran und halten Sie das Kultureinsatzgehäuse in jedem Bohrplatz, um die VHSEs während der Färbung in einer untergetauchten Position zu halten. Zwei Tage vor der Bildgebung Polydimethylsiloxan oder PDMS vorbereiten. Stellen Sie ein sauberes Mischgefäß auf eine Waage und tarieren Sie die Waage.Fügen Sie die Basis hinzu und fügen Sie dann den Vernetzer hinzu. Rühren Sie die Lösung mindestens vier Minuten lang kräftig um und erzeugen Sie kleine Blasen. Nach ausreichendem Mischen das PDMS in eine 90 oder 100 Millimeter große Petrischale gießen.Entgasen Sie das PDMS in einer Vakuumkammer, bis alle Blasen verschwinden und das PDMS klar ist. Lassen Sie das Vakuum langsam los und entfernen Sie das PDMS. Legen Sie das Gericht in einen Ofen, um über Nacht bei 50 bis 60 Grad Celsius auszuhärten, und stellen Sie sicher, dass das Gericht flach sitzt, damit PDMS gleichmäßig aushärten kann.Verwenden Sie einen Tag vor der Bildgebung einen Stahlstempel oder ein Handpräzisionsmesser, um einen kreisförmigen Brunnen aus dem PDMS-Blatt zu stanzen oder auszuschneiden, der etwa so groß ist wie das VHSE-Konstrukt. Schneiden Sie einen quadratischen Fleck um den kreisförmigen Brunnen, um einen einzelnen PDMS-Brunnen zu erstellen. Mit einem Glasabdeckungsschlupf von ähnlicher Größe wie der PDMS fügen Sie Cyanacrylatkleber auf die Unterseite des PDMS hinzu und schmieren Sie gleichmäßig mit einer Einwegpipettenspitze.Zentrieren Sie das Glas und drücken Sie es gut auf das PDMS, während Sie ein klares Glasfenster innerhalb des gestanzten Kreises lassen. Lassen Sie den Kleber vor dem Verwenden über Nacht trocknen. Die Charakterisierung der Epidermis und Dermis zeigt geeignete immunfluoreszierende Marker für die menschliche Haut in den VHSE-Konstrukten.Cytokeratin 10 ist ein Keratinozytenmarker für die Frühdifferenzierung, der normalerweise alle suprabasalen Schichten in Hautäquivalenten markiert. Involucrin und Filaggrin sind späte Differenzierungsmarker in Keratinozyten und markieren die obersten suprabasalen Schichten in Hautäquivalenten. Das Löschen der VHSE ermöglichte eine einfache Bildgebung in einer Umgebung und eliminierte die Notwendigkeit, das Konstrukt neu auszurichten, um die Dermis und die Epidermis separat abbilden zu können.Volumetrische Bilder ermöglichen es, 3D-Renderings zu generieren, um Gefäße in jedem Konstrukt abzubilden. Bildstapel wurden in Rechensoftware geladen und ein benutzerdefinierter Algorithmus wurde für das 3D-Rendering und die Quantifizierung verwendet. Die Skelettierung bestimmte das definitive Zentrum jedes Kollagen-IV-markierten Gefäßes und die resultierenden Daten wurden verwendet, um den Gefäßdurchmesser sowie die vaskuläre Fraktion zu berechnen.Nach diesem Verfahren können Charakterisierungsmethoden wie Barriereanalyse, Rasterelektronenmikroskopie, Lipidprofile und andere durchgeführt werden, um zu verstehen, wie Gefäße spezifisch die epidermale Reifung und Stabilität beeinflussen. Dieses Protokoll ermöglicht geweberelevante und zelltypspezifische Studien in einem vaskularisierten Hautmodell. Es eignet sich besonders für die Forschung in der Alterung und personalisierten Medizin.

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Biotechnik

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Lernen Sie die Generierung vaskularisierter humaner Hautäquivalente für Tissue Engineering und personalisierte Medizin. Dieses Protokoll ermöglicht langfristige Kultur und physiologisch relevante Studien zu Krankheiten und Alterung.

Generierung von selbst zusammengesetzten vaskularisierten äquivalenten menschlicher Haut

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