Myosin-spezifische Anpassungen von In-vitro-Fluoreszenzmikroskopie-basierten Motilitätsassays

Dieses Protokoll kann verwendet werden, um die Nicht-Muskel-Myosin-Dynamik auf Proteinebene zu charakterisieren, die die beweglichen Eigenschaften beeinflussen kann, die zu ihrer Rolle in Zellen beitragen. Dies ist eine schnelle, reproduzierbare und hochgradig kontrollierte Methode, mit der die Auswirkungen verschiedener regulatorischer Bedingungen auf die Myosinmotilität untersucht und ihr zelluläres Verhalten beeinflusst werden können. Mit diesen Techniken kann untersucht werden, wie krankheitsverursachende Mutationen in Nicht-Muskel-Myosinen ihr Verhalten auf Einzelmolekül- und Ensembleebene beeinflussen.

Der allgemeine Ansatz seiner Methodik kann auf verschiedene andere Zytoskelettsysteme angewendet werden, wie z.B. die Charakterisierung von gereinigten Kinesinen und Dyneinen mit Mikrotubuli. Die Vielseitigkeit dieses Protokolls kann Fragen aufwerfen, welche Fluorophore und chemischen Bedingungen am besten geeignet sind, aber die Methode kann relativ schnell optimiert werden. Zu verstehen, wie man die Strömungskammern aufstellt und beschichtet, bildet eine starke Grundlage, auf der man sich an verschiedene Bedingungen für diese Experimente anpassen kann.

Bereiten Sie zunächst eine einprozentige Nitrocelluloselösung in Amylacetat vor und legen Sie ein kreisförmiges Filterpapier mit einem Durchmesser von 125 Millimetern auf den Boden einer Gewebekulturplatte. Laden Sie acht quadratische Abdeckungsscheiben auf ein Gestell und waschen Sie sie gründlich mit etwa zwei bis fünf Millilitern 200-proof Ethanol, gefolgt von zwei bis fünf Millilitern destilliertem Wasser. Fahren Sie dann die Deckelschlupfe vollständig mit einer gefilterten Luftleitung oder Stickstoffleitung an.

Pipette langsam 10 Mikroliter einprozentige Nitrocelluloselösung entlang einer Kante eines Deckels. Schmieren Sie es über den Rest des Deckelschlupfes mit der Seite einer 200 Mikroliter Pipettenspitze in einer sanften Bewegung. Dann legen Sie diesen Deckzettel mit der Nitrocelluloseseite nach oben auf die Gewebekulturschale.

Wiederholen Sie dies für die restlichen Deckzettel und lassen Sie sie trocknen. Wischen Sie einen Objektträger mit einem optischen Linsenpapier ab, um große Ablagerungen zu entfernen. Schneiden Sie zwei Stücke doppelseitiges Klebeband mit einer Länge von etwa zwei Zentimetern und legen Sie ein Stück entlang der Mitte des langen Randes des Objektträgers.

Legen Sie das zweite Stück Band etwa zwei Millimeter unter das erste Stück Band, so dass die beiden parallel sind und eine Strömungskammer entstehen, die etwa 10 Mikroliter Lösung aufnehmen kann. Kleben Sie vorsichtig eine der Nitrocelluloseabdeckungen auf das Klebeband, so dass die mit Nitrocellulose beschichtete Seite direkten Kontakt mit dem Band hat. Drücken Sie mit einer Pipettenspitze vorsichtig auf die Schiebebandschnittstelle, um sicherzustellen, dass der Abdeckzettel ordnungsgemäß auf dem Schlitten haftet.

Schneiden Sie dann das überschüssige Klebeband, das über dem Rand des Dias hängt, mit einer Rasierklinge ab. Bereiten Sie die Lösungen für Myosin 5a vor und halten Sie sie auf Eis. 10 Mikroliter des Myosin 5a durch die Gleitflusskammer strömen und eine Minute warten.

Dann fließen 10 Mikroliter von einem Milligramm pro Milliliter BSA in Motilitätspuffer mit DTT. Wiederholen Sie dies zweimal und warten Sie eine Minute nach dem dritten Waschen. Verwenden Sie die Ecke eines Seidenpapiers oder Filterpapiers, um die Lösung durch den Kanal zu leiten, indem Sie die Ecke des Papiers vorsichtig am Ausgang der Durchflusskammer platzieren.

Dann mit 10 Mikrolitern Motilitätspuffer mit DTT waschen. Pipetten Sie die schwarze Aktinlösung mit einer Ein-Milliliter-Spritze und einer 27-Gauge-Nadel, um die Aktinfilamente zu scheren, bevor Sie diese Lösung in die Kammer einführen. Fügen Sie das schwarze Aktin in Gegenwart eines millimolaren ATP in 50 millimolar MB mit einem millimolaren DTT in die Kammer ein.

Als nächstes fließen 50 Mikroliter Motilitätspuffer mit DTT und einem millimolaren ATP ein, um die Kammer der freien Aktinfilamente zu erschöpfen. Dreimal mit 10 Mikrolitern Motilitätspuffer mit DTT waschen, um die Kammer eines ATP zu erschöpfen. Strömen Sie in 10 Mikroliter 20 nanomolare RH-Aktinlösung, die Motilitätspuffer enthält, mit DTT und warten Sie eine Minute, um eine rigore Bindung der Aktinfilamente an das Myosin 5a zu ermöglichen, das an der Oberfläche des Deckzettels befestigt ist.

Mit 10 Mikrolitern 50 Millimolar motilitätspuffer mit DTT zweimal waschen, um ungebundene RH-Aktinfilamente zu entfernen. 30 Mikroliter Endpuffer einfließen lassen. Nehmen Sie Bilder auf einem Fluoreszenzmikroskop mit einer Anregungswellenlänge von 561 Nanometern auf, um das RH-Aktin zu visualisieren.

Bereiten Sie die Lösungen für Myosin 5a invertierte Motilitätstests vor und halten Sie sie auf Eis. Waschen Sie sie in der Kammer mit 10 Mikrolitern Motilitätspuffer mit DTT. Durchfluss in 10 Mikrolitern von einem Milligramm pro Milliliter BSA im Motilitätspuffer mit DTT.

Wiederholen Sie dies zweimal und warten Sie eine Minute nach der dritten Wäsche. Verwenden Sie Tissue- oder Filterpapier, um die Lösung durch den Kanal zu leiten, indem Sie die Ecke des Papiers vorsichtig am Ausgang der Durchflusskammer platzieren. Dann waschen Sie die Kammer dreimal mit 10 Mikrolitern Motilitätspuffer mit DTT.

10 Mikroliter der NeutrAvidin-Lösung im Motilitätspuffer mit DTT einfließen lassen und eine Minute warten. Dann dreimal mit 10 Mikrolitern dieser Lösung waschen. 10 Mikroliter BRH-Aktin mit Motilitätspuffer mit DTT unter Verwendung einer großgebohrten Pipettenspitze einfließen lassen.

Und warten Sie eine Minute. Dann dreimal mit 10 Mikrolitern Motilitätspuffer mit DTT waschen. Durchfluss in 30 Mikroliter Endpuffer mit 10 nanomolarem Myosin 5a.

Und sofort auf das gesamte interne Reflexionsfluoreszenzmikroskop laden. Beginnen Sie mit der Aufnahme, sobald der optimale Fokus für die TIRF-Bildgebung gefunden wurde. Die Reinigung von nicht-muskelfreiem Myosin 2b, essentiellen Leichtketten und regulatorischen Leichtketten sowie Myosin 5a und Calmodulin wurde durch SDS-PAGE evaluiert.

Der Gleit-Aktin-Filament-Assay zeigt die Eigenschaften eines idealen und verfolgbaren Films mit sanften Bewegungen von markierten Aktinfilamenten. Die schwarze Aktinwäsche sorgte dafür, dass die abgestorbenen Myosinköpfe aus dem Messfeld entfernt wurden, was weiter zur insgesamt reibungslosen Bewegung der Aktinfilamente beitrug. Filament-Tracking-Ausgabebilder aus dem Fast-Track-Programm wurden für Nicht-Muskel-Myosin 2b und Myosin 5a erhalten.

Ein repräsentatives Histogramm zeigt, dass die Gleitgeschwindigkeit von Actomyosin 2b 77 Nanometer pro Sekunde beträgt. Und die von Actomyosin 5a ist 515 Nanometer pro Sekunde. In Abwesenheit von Methylcellulose bleiben die Aktinfilamente nicht so eng mit der myosinbeschichteten Oberfläche verbunden, wodurch sie nahe an der Oberfläche der nicht-muskelfreien Myosin 2b-beschichteten Deckrutsche flattert.

Die Myosinbewegung wurde an oberflächengebundenen fluoreszierenden Aktinfilamenten mit dem invertierten Motilitätstest beobachtet. Es ist wichtig, das unbeschriftete Aktin zu scheren, bevor es in die Durchflusszelle für die schwarze Aktinwäsche eingeführt wird, die eine reibungslose Translokation von Aktin ermöglicht. Zusätzliche Experimente können untersuchen, wie die Myosinmotilität durch Myosinmutationen, lastinduzierende Proteine, Ionenstärke und regulatorische Proteine beeinflusst wird.

Verschiedene zelluläre Zustände können für zukünftige Studien rekonstituiert werden. Diese Methoden ermöglichen die biochemischen und biophysikalischen Untersuchungen, wie sich verschiedene Myosin-Isoformen in ihren beweglichen und mechanischen Eigenschaften auf Einzelmolekül- und Ensembleebene unterscheiden.