Schnelle Gittervorbereitung für zeitaufgelöste Kryo-Elektronenmikroskopie

Hallo und willkommen zu diesem JoVE"-Video. Wir möchten Ihnen das Setup vorstellen, das wir hier für die schnelle Grid-Erstellung haben, eine zeitaufgelöste Studie, die wir in Leeds entwickeln. Seien Sie sich bewusst, dass dies kein Standardsystem ist, aber wir hoffen, dass Sie durch eine detaillierte Darstellung aller Dinge und Parameter, die wir tun, in der Lage sein werden, ähnliche Systeme in Ihren eigenen Labors zu entwickeln.

Eine detaillierte Beschreibung des Geräts finden Sie im Richmond-Protokoll. Hier geben wir eine Schritt-für-Schritt-Anleitung für eine schnelle Netzvorbereitung und zeitaufgelöste EM. Unserer Erfahrung nach sollte die Proteinkonzentration zwei Milligramm pro Milliliter oder höher betragen. Das Protokoll erfordert ein Mindestvolumen von etwa 50 Mikrolitern.

Schalten Sie das Gerät ein. Schalten Sie dann den Steuerungs-PC ein und starten Sie die Steuerungssoftware. Initialisieren Sie alle Spritzenpumpen, indem Sie die Initialisierungstaste an jeder Spritzenpumpe drücken.

Schalten Sie das Potentiometer-Netzteil ein, stellen Sie es auf neun Volt ein und starten Sie die Oszilloskop-Steuerungssoftware. Druck stehendes Stickstoffgas wird benötigt, um das Spray zu erzeugen. Öffnen Sie den Stickstoffzylinder und stellen Sie den Druck auf 2 bar ein.

Stellen Sie sicher, dass sich alle Spritzenpumpenventile in der Lastposition befinden. Schalten Sie dazu alle Ventile in der Steuerungssoftware zur Dosierung und dann wieder zur Last. Stellen Sie alle Spritzen auf Null.

Alle im System vorhandenen Luftblasen sollten in diesem Stadium entfernt werden. Dazu müssen die Spritzen möglicherweise abschrauben, Blasen manuell entfernt und die Spritzen wieder montiert werden, wenn sie keine Blasen mehr enthalten. Das Liquid-Handling-System wird in der Regel in Wasser gelagert.

Vor dem Laden der Probe wird das System mit Puffer ausgeglichen. Dies geschieht, indem der Schlauch mit einem Überschuss an Puffer gewaschen wird. Legen Sie ein Röhrchen mit mindestens 200 Mikrolitern Puffer auf die Spritze.

Die Oberseite des Rohres muss durchbohrt werden, um es zu befestigen. Saugen Sie eine geeignete Menge Puffer zwischen 50 und hundert Mikrolitern mit spritze eins mit der Steuerungssoftware ab. Schalterventil eins zu dosieren.

Geben Sie die gesamte Flüssigkeit in eine Spritze. Bringen Sie das erste Ventil in die Ladeposition zurück und drücken Sie die Initialisierungstaste an der Spritze eins, um das System für den nächsten Waschgang vorzubereiten. Diese Schritte werden in der Regel dreimal wiederholt, um eine gründliche Wäsche des Schlauches zu gewährleisten.

Als nächstes wird die Sprühdüse positioniert. Legen Sie ein EM-Gitter in den Eintauchenarm. Positionieren Sie das Gitter vor der Sprühdüse.

Puffer mit der Steuerungssoftware dosieren. Wenn Düse und Gitter ausgerichtet sind, sollte sich nach dem Sprühen über einen längeren Zeitraum Flüssigkeit ansammeln. Passen Sie ggf. die Düsenposition an und prüfen Sie dann erneut, wo sich die Flüssigkeit auf dem Gitter ansammelt.

Als nächstes passen Sie die Position des Ethanbechers an. Die Spitze der Pinzette sollte ungefähr bis zur Mitte des Ethanbechers reichen. Führen Sie einen Testlauf durch, um sicherzustellen, dass alle Einstellungen korrekt sind.

Schließen Sie die Feuchtigkeitskammer. Stellen Sie sicher, dass der Weg des Kolbens frei ist. Saugen Sie das Puffervolumen an, das für einen einzelnen Lauf in eine Spritze erforderlich ist.

Schalterventil eins zu dosieren. Starten Sie den Lauf, indem Sie run'in der Steuerungssoftware drücken. Überprüfen Sie, ob sich die Spritzenpumpe eins bewegt, in diesem Fall zwei Sekunden, und das Gitter wird nach einer entsprechenden Verzögerung, 1,5 Sekunden hier, eingetaucht.

Wenn der Lauf beendet ist, stellen Sie den Druck auf den Kolbenarm auf den gewünschten Wert ein. Drücken Sie OK'in der Steuerungssoftware, um den Druck vom Eintauchenarm abzulassen. Jetzt ist der Ethanbecher kühl und mit flüssigem Ethan gefüllt.

Glühen-Entladen Sie die Gitter vor dem Gebrauch. Eine typische Glühentladung beträgt 90 Sekunden bei 10 Milliampere in 0,1 Millibar Luft. Der Schlauch wird dann mit der Probe ausgeglichen.

Wenn das verfügbare Probenvolumen gering ist, kann der Schlauch mit nur einem Totvolumen ausgeglichen werden. Aspirationsprobe. Typischerweise beträgt das Totvolumen etwa 30 Mikroliter.

Schalterventil eins zu dosieren. Dosieren Sie die Probe durch Schlauch und Düse. Saugen Sie dann die Für einen einzelnen Durchlauf erforderliche Probenmenge ab.

Schalterventil eins zu dosieren. Überprüfen Sie, ob die relative Luftfeuchtigkeit den gewünschten Wert erreicht hat. In der Regel bereiten wir Raster zu 60% oder höher vor.

Dies kann einige Minuten dauern. Legen Sie die Pinzette mit einem glühenden Gitter in den Eintauchenarm. Platzieren Sie den Potentiometerschieber in der Startposition, bereit für die Geschwindigkeitsmessung.

Stellen Sie den Auslöser für die Geschwindigkeitsmessung in der Oszilloskop-Software ein. Stellen Sie den flüssigen Ethanbecher in die Nähe der Feuchtigkeitskammer. Stellen Sie sicher, dass der Weg des Kolbens frei ist.

Starten Sie den Lauf in der Steuerungssoftware. Wenn der Lauf beendet ist, drücken Sie OK'in der Steuerungssoftware, um den Druck vom Eintaucharm abzulassen. Öffnen Sie die Feuchtigkeitskammer, lösen Sie die Verbindung zwischen Eintaucharm und Pinzette.

Bewegen Sie den Eintauchenarm nach oben, während Sie das Gitter in flüssigem Ethan halten. Dann werden die Gitter in flüssigen Stickstoff und in die Lagerung überführen. Speichern Sie die Oszilloskopmessung.

Setzen Sie die Position des Potentiometer-Schiebers und -Kolbens manuell zurück. Wiederholen Sie das Protokoll, um Replikatraster vorzubereiten. Zeitaufgelöste Experimente werden auf ähnliche Weise durchgeführt.

Für zeitaufgelöste Experimente sind aufgrund der Verdünnung im Mischschritt höhere Stoffkonzentrationen erforderlich. Verwenden Sie für ein zeitaufgelöstes Experiment alle drei Spritzen. Die Schläuche werden an den Spritzenpumpen und an der Sprühdüse befestigt.

Die hier eingesetzte mikrofluidische Sprühdüse enthält ebenfalls ein Mischelement. Beachten Sie, dass längere Röhrchen ein größeres Totvolumen ergeben und Waschgleichgewichtsschritte mehr Puffer und Probe erfordern. Alle Spritzen mit Puffer und Probe separat ausgleichen.

Typischerweise wird Spritze eins für Probe A verwendet und Spritzen zwei und drei werden für Probe B verwendet'Nachdem der Schlauch ausgeglichen ist, laden Sie Probe A in Spritze eins und Probe B in Spritze zwei und drei. Dann schalten Sie die Ventile eins bis drei zum Dosieren. Starten Sie den Lauf in der Steuerungssoftware.

Beachten Sie, dass für ein zeitaufgelöstes Experiment ein anderes Ausführungsskript erforderlich ist. Unterschiedliche Zeitverzögerungen können auf zwei Arten erreicht werden. Durch Die Einstellung der Kolbengeschwindigkeit kann die Zeitverzögerung vom Mischen bis zum Einfrieren geändert werden.

Eine schnellere Tauchgeschwindigkeit führt zu einer kürzeren Zeitverzögerung. Alternativ wird der Sprühethanabstand durch Einstellung der vertikalen Position der Sprühdüse verändert. Eine Erhöhung der Entfernung führt zu einer längeren Zeitverzögerung.

Im Elektronenmikroskop bei geringer Vergrößerung sieht ein typisches Gitter so aus. Bereiche mit dünnem Eis, wie angegeben, eignen sich für die Datenerfassung. Bei höheren Vergrößerungen sollten Partikel deutlich sichtbar sein.

Bei einem Prüfling wie Apoferritin reicht ein relativ kleiner Datensatz aus einem einzigen Raster für eine Rekonstruktion bei drei bis vier Angström Auflösung aus. Für zeitaufgelöste Experimente sammeln wir Datensätze von verschiedenen Zeitpunkten oder Gittern. Es ist nützlich, die Daten für die 3D-Klassifizierung zu kombinieren und dann Partikel zu ihren Zeitpunkten zurückzuverfolgen.

Auf diese Weise können die Daten strukturelle Informationen und Informationen über die Reaktionskinetik liefern. Abschließend hoffen wir, dass Ihnen das Video gefallen hat. Wir hoffen, dass Sie mit den detaillierten Beschreibungen im JoVE-Papier zusammen mit dem Video in der Lage sein werden, Ihre eigenen Experimente über rapid grid making durchzuführen, von denen gezeigt wurde, dass sie einige der Probleme durch Mutation lindern oder bei Interaktionen an der Luft-Wasser-Schnittstelle helfen, alles, was Sie für die Durchführung Ihrer eigenen zeitaufgelösten Studien benötigen, um zu versuchen, einige dieser Nichtgleichgewichtszustände einzufangen.

Also, glückliches Grid-Making.