Luft-Aufblasen der murinen Lunge mit vaskulärer Perfusionsfixierung

Dies ist eine kostengünstige Methode, die die Vorteile von Luftinflation und vaskulärer Perfusionsfixierung zur Erhaltung der Lunge für Struktur- und Funktionsanalysen kombiniert. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die Erhaltung der Zellmorphologie und der Lage in den Lufträumen der Lunge. Beim Einsetzen des Köderstumpfadapters in die Luftröhre und der Perfusionsnadel in den rechten Ventrikel ist Vorsicht geboten, um ein ausreichendes Aufblasen und Fixieren zu gewährleisten.

Um die Luftaufblasvorrichtung einzurichten, legen Sie eine Spritze für die Wassersäule in einen Ringhalter und messen eine vertikale Höhe von 25 Zentimetern von der Tierplattform bis zu 25 Zentimetern an der Wassersäule. Befestigen Sie am Ende des Wassersäulenrohrs den Absperrhahn an der Luftkammer und befestigen Sie ein Rohr vom weiblichen Köder der Luftkammer am Absperrhahn am Tierverarbeitungsbehälter. Vergewissern Sie sich, dass die Kappe zur Luftkammer und der Absperrhahn an der Außenseite des Tierverarbeitungsbehälters geschlossen sind und dass der Absperrhahn am Schlauch, der von der Wassersäule zur Luftaufblaskammer führt, offen ist.

Dann füllen Sie die Spritze mit Wasser bis zur 25-Zentimeter-Marke. Wasser fließt durch die Spritze und den Schlauch in die Luftkammer. Sobald der Druck ausgeglichen ist, hört das Wasser auf zu fließen.

Um die Lunge auf das Aufblasen vorzubereiten, machen Sie einen seitlichen Schnitt in der Bauchdecke unterhalb des Brustkorbs der eingeschläferten Maus und einen zweiten seitlichen Bauchwandschnitt über den Hüften. Schneiden Sie entlang der Mittellinie vom inneren Schnitt zum oberen Schnitt und verwenden Sie eine stumpfe Schere, um vorsichtig einen Schnitt in die seitliche Seite des Zwerchfells zu machen. Die Lunge sollte kollabieren, sobald das Zwerchfell punktiert ist.

Schneiden Sie quer entlang des Zwerchfells, um die Brusthöhle zu öffnen, und schneiden Sie überlegen entlang des Brustbeins vom Xiphoid-Prozess bis zur Jongleur-Notbe und seitlich über dem Brustkorb, um Herz und Lunge vollständig freizulegen. Stecken Sie die Seiten des Brustkorbs fest und machen Sie einen Mittellinienschnitt im Nacken oberhalb der Luftröhre. Entfernen Sie die Haut, den Muskel, die Schilddrüse und das Bindegewebe, die die Luftröhre umgeben, und verwenden Sie eine gekrümmte Zinnen, um zwei Nahtstücke unter die hintere Luftröhre zu schieben.

Verwenden Sie ein Stück Naht, um den Aufblasköder-Stub-Adapter an Ort und Stelle zu halten, und verwenden Sie eine 18-Gauge-Nadel mit einer Zoll-Nadel, um ein kleines Loch in die Luftröhre zu machen. Setzen Sie einen 20-Gauge-Köder-Stub-Adapter in das Loch ein und binden Sie die Naht um die Luftröhre sofort distal an der Stelle, an der der Köder-Stub-Adopter in das Loch eintritt. Dann überführen Sie das Tier in den Tierverarbeitungsbehälter und befestigen Sie den Köderstumpfadapter am weiblichen Köder auf der Innenseite des Tierverarbeitungsbehälters.

Um die Lunge aufzublasen, legen Sie die 25 Gauge by 5/8 zoll Nadel, die an der Perfusionsapparatröhre befestigt ist, in den rechten Ventrikel des Herzens und schneiden Sie die Bauchaorta, damit Blut aus dem Herzen abfließen kann und um den Perfusatfluss durch die Lunge zu fördern. Öffnen Sie den Absperrhahn an der Außenseite des Tierverarbeitungsbehälters und blasen Sie die Lunge fünf Minuten lang bei 25 Zentimetern Wasser auf, wobei Sie darauf achten, dass der Wasserstand in der Spritze nicht zu schnell abnimmt. Schalten Sie in der letzten Minute der Lungeninflation die Peristaltikpumpe auf eine Durchflussrate von 10 Millilitern pro Minute ein.

Heparinlösung sollte aus der Flasche durch den Schlauch in das Tier fließen. Nachdem Sie die Lunge fünf Minuten lang aufgeblasen haben, schalten Sie die Pumpe aus und schalten Sie das Perfusat von Heparin auf Fixiermittel um. Senken Sie die Wassersäulenspritze auf 20 Zentimeter.

Es ist normal, dass sich Luftblasen innerhalb der Wassersäule bewegen, wenn sich der Druck ändert. Überprüfen Sie den Wasserstand in der Spritze. Es sollte bei der 25-Zentimeter-Marke liegen.

Warten Sie dann eine Minute, damit die Lunge von 25 auf 20 Zentimeter Wasserdruck abfließen kann, bevor Sie die Pumpe mit einer Durchflussrate von 6,5 Milliliter pro Minute für 10 bis 15 Minuten neu starten, vaskuläre fixative Perfusion. Um das aufgeblasene und fixierte Lungengewebe zu extrahieren, binden Sie das zweite Stück Faden fest um die Luftröhre, distal an den Köder-Stub-Adapter, und entfernen Sie den Köder-Stub-Adapter aus der Luftröhre. Entfernen Sie die Nadel aus dem Herzen und verwenden Sie eine stumpfe Schere, um das Bindegewebe zu schneiden, hinter dem Mediastinum, um die Lunge und das Herz von der Brusthöhle zu befreien, wobei Sie darauf achten, dass die Lunge nicht punktiert wird.

Entfernen Sie vorsichtig das Herz aus der Lunge und legen Sie die Lunge in 20 bis 25 Milliliter Fixmittel in einem 50 Milliliter konischen Rohr. Ziehen Sie die Naht, die die Luftröhre hält, durch die Öffnung im konischen Rohr und befestigen Sie die Naht an den Fäden der Kappe. Dann kehren Sie den Schlauch um, um sicherzustellen, dass die schwimmfähigen, luftgeblasenen Lungen vollständig in Fixiermittel getaert bleiben und die Lunge für histologische Studien nach Standardprotokollen verarbeiten.

Wenn das Zwerchfell während der Dissektion betreten wird, wird die Integrität des Pleuraraums aufgehoben und die Lunge sollte kollabieren. Bei Anwendung von 25 Zentimetern Wasserdruck gelangt Luft über die Luftröhre in die Lunge und das Aufblasen sollte leicht beobachtet werden. Sobald sich die Lunge vollständig ausgedehnt hat, kann der Aufblasdruck auf 20 Zentimeter gesenkt werden, um die Lunge ohne Überdehnung aufgeblasen zu halten.

Die Lunge sollte nach der Trachealligatur und Entfernung aus dem Thorax aufgeblasen bleiben. Eine Deflation kann auftreten, wenn die Lunge während der Tiervorbereitung oder Lungenextraktion punktiert wird. Die histologische Analyse von aufgeblasenen Lungenabschnitten zeigt, dass nur sehr wenige Immunzellen im Atemwegslumen von Geweben vorhanden sind, die mit herkömmlicher flüssigkeitsbasierter Inflation fixiert sind.

Im Gegensatz dazu werden Entzündungszellen in den Lufträumen von Geweben konserviert, die durch vaskuläre Perfusion mit Luftbelästigung fixiert sind. Nach Luftaufblasen mit Profusionsfixierung kann Lungengewebe in Formalin für die Gewebeschnitte und die anschließende Analyse mittels histologischer Techniken, einschließlich Färbung, Immunhistochemie und immunfluoreszierende Bildgebung, eingebettet werden.