Name: Luft-Aufblasen der murinen Lunge mit vaskulärer Perfusionsfixierung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: Lernen Sie eine kostengünstige Methode zur Luft-Aufblasung der murinen Lunge mit vaskulärer Perfusionsfixierung für die histologische Analyse. Diese Technik bewahrt Morphologie und Zelllokalisation in den Lungenluftwegen besser als traditionelle Fixierungsmethoden.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Diese Arbeit wurde vom National Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI) mit den Zuschüssen HL140039 und HL130938 finanziert. Die Autoren danken Shannon Hott und Jazalle McClendon für ihre technische Expertise.

Alle in diesem Protokoll beschriebenen Methoden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der National Jewish Health genehmigt.
HINWEIS: Das Protokoll ist in drei Komponenten unterteilt. Die erste Komponente beschreibt den Aufbau der Luftbeblasung mit Perfusions- / Fixationsausrüstung. In einem zweiten Abschnitt wird beschrieben, wie die Ausrüstung für ein Experiment eingerichtet wird. Der letzte Abschnitt beschreibt, wie man das Tier vorbereitet und das Experiment durchführt.
1. Aufbau der Wassersäulenvorrichtung (Abbildung 1B)
<ol><li>Entfernen Sie den Kolben aus einer 60-ml-Spritze mit Schlupfspitze.</li>
	<li>Befestigen Sie Klebeband um die Spritze bei der 30-ml-Marke. Stellen Sie die Höhe der Spritze auf diese Markierung für den anfänglichen Aufblasdruck von 25 cmH2O ein. Hier sollte auch der Wasserstand in der Säule während des gesamten Verfahrens sein. Beschriften Sie das Band entweder als "25 cm" (wie in Abbildung 1Adargestellt) oder als "Inflation". HINWEIS: Ein Luftdruck von 25 cmH2O wird verwendet, um die Rekrutierung von eingestürzten Lufträumen zu gewährleisten. Sobald Die Alveolen rekrutiert wurden, wird der Druck auf 20 cmH2O gesenkt, um sicherzustellen, dass die Lufträume nicht aufgebläht werden.</li>
	<li>Messen Sie 5 cm vom Band in Richtung des Kolbenendes und befestigen Sie ein weiteres Stück Klebeband an der Spritze. Bewegen Sie die Spritze bis zu dieser Markierung, um den Aufblasdruck während der Fixierung auf20cmH 2 O zu senken. Beschriften Sie das Band entweder als "20 cm" (wie in Abbildung 1Adargestellt) oder als "Fixierung".</li>
	<li>Befestigen Sie 180 Polyvinylchlorid (PVC)-Schläuche am Ende der Slip-Spitze der Spritze. Die Länge des Schlauches ist abhängig vom Abstand zwischen Spritze und Luftaufblaskammer (ca. 25-30 cm).</li>
	<li>Legen Sie ein männliches Luer (2) Faden-T-Shirt (1,219 Zoll Länge, 0,904 Zoll Höhe, 0,0904 Zoll Innendurchmesser) in das andere Ende des Schlauchs. Dieser männliche Luer wird mit dem Absperrhahn der Luftfüllkammer verbunden (Schritt 2.4).</li>
</ol>2. Aufbau der Luftfüllkammer (Abbildung 1C)
<ol><li>Bohren Sie zwei Löcher (ca. 4 mm Durchmesser) in einen 500 mL Kunststoffbehälter mit Schraubkappe. Die Löcher sollten die gleiche Größe wie die weiblichen Luers haben (1,224 Zoll Länge, 0,312 Zoll Höhe, 0,098 Zoll Innendurchmesser). HINWEIS: Leere Medien oder Pufferbehälter können für die Luftaufblaskammer verwendet werden.</li>
	<li>Beschichten Sie die Fäden der Luers mit Silikondichtungsmaschine und legen Sie die kleinere Seite in die vorgebohrten Löcher des Behälters.</li>
	<li>Fügen Sie silikonen Dichtungsmacher um die weiblichen Luers hinzu, wo sie in den Behälter gelangen, um eine luftdichte Abdichtung zu gewährleisten.</li>
	<li>Schrauben Sie einen Einweg-Absperrhahn an der unteren Luer-Buchse an der Luftfüllkammer an.</li>
	<li>Schneiden Sie Schläuche auf eine Länge von ca. 25 cm und befestigen Sie männliche Luers an den freien Enden des Schlauches. Verbinden Sie den männlichen Luer an einem Ende des Schlauchs mit dem freien weiblichen Luer an der Luftaufblaskammer. Der andere männliche Luer verbindet sich mit dem Tierverarbeitungsbehälter.</li>
</ol>3. Aufbau des Tierverarbeitungsbehälters (Abbildung 1D)
<ol><li>Bohren Sie ein Loch (ca. 4 mm Durchmesser) in die Seite eines großen Kunststoffbehälters. Das Loch sollte den Durchmesser des weiblichen Luer haben. Der Kunststoffbehälter wird benötigt, um überschüssige Fixierungslösung aufzufangen. HINWEIS: Es wurde ein 30 cm x 22 cm großer, 3,8 l Kunststoff-Aufbewahrungsbehälter verwendet.</li>
	<li>Beschichten Sie die Fäden eines Luer-Weibchens mit einem Silikondichtungsmacher und legen Sie die kleinere Seite in das vorgebohrte Loch des Behälters.</li>
	<li>Fügen Sie silikonen Dichtungsmacher um die weibliche Luer hinzu, wo sie in den Behälter ein- und austritt, um eine luftdichte Abdichtung zu gewährleisten.</li>
	<li>Schrauben Sie einen Einweg-Absperrhahn auf die luer-Hündin. An diesem Absperrhahn werden Schläuche aus der Luftaufblaskammer befestigt.</li>
</ol>4. Herstellung von Lösungen
<ol><li>Heparin-Lösung<ol>
<li>Füllen Sie einen Behälter mit kalziumfreiem PBS und Heparin (20 U/ml). Bereiten Sie insgesamt 10 ml Heparinlösung für jede Maus vor. Heparin ist ein Gerinnungshemmstoff, das verhindert, dass sich während der Perfusionsfixierung Blutgerinnsel in den Gefäßen bilden. Heparinlösung wird verwendet, um Blut aus der Lunge vor der Perfusionsfixierung zu spülen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fixative Lösung ACHTUNG: Fixiermittel können eine Gesundheitsgefahr darstellen und sollten in einem chemischen Abzug verwendet werden. Alle Geräte sind in einem chemischen Abzug aufgebaut, um das Einatmen von Fixiermitteln zu verhindern.<ol>
<li>Füllen Sie einen Behälter mit kalziumfreiem PBS und Paraformaldehyd (4% Endkonzentration). Bereiten Sie insgesamt 50 ml Fixierlösung für jede Maus vor. HINWEIS: Die Art des verwendeten Fixiermittels kann variieren und hängt von nachgelagerten histologischen Studien ab.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5.   Herstellung von Perfusionsapparaten
HINWEIS: Für die Abgabe von Flüssigkeiten in die Gefäße wird eine Peristaltikpumpe empfohlen, um eine konstante Durchflussrate zu gewährleisten. Die folgenden Anweisungen gelten für die Einrichtung der Peristaltikpumpe und können für jedes Modell unterschiedlich sein. Alternativ kann, wenn eine Peristaltikpumpe nicht verfügbar ist, eine zweite Wassersäulenvorrichtung konstruiert werden, um Flüssigkeiten aus einer Höhe von 35 cmH2Ozu perfundieren.
<ol><li>Legen Sie zuerst den Schlauch um die Rollenbaugruppe.</li>
	<li>Befestigen Sie den Schlauch in den eingekerdeten Pfosten.</li>
	<li>Verriegeln Sie die Hebel, indem Sie zuerst den linken Hebel um den Schlauch legen und ihn mit dem oberen und dann dem rechten Hebel an Ort und Stelle besichern.</li>
	<li>Legen Sie das proximale Ende des Schlauches in die Heparinlösung und das distale Ende in den Tierverarbeitungsbehälter.</li>
	<li>Laden Sie die Heparinlösung in den Schlauch vor, indem Sie die Pumpe laufen lassen, um Luft aus dem Schlauch auszustoßen.</li>
	<li>Befestigen Sie eine 25G x 5/8" Nadel am Ende der linken Seite des Schlauches.</li>
</ol>6. Herstellung von Luftfüllgeräten
<ol><li>Legen Sie die Spritze für die Wassersäule in einen Ringhalter.</li>
	<li>Messen Sie eine vertikale Höhe von 25 cm von der Tierplattform bis zur "25 cm" Bandmarkierung (Schritt 1.2) auf der Wassersäule.</li>
	<li>Befestigen Sie das Ende des Rohres der Wassersäule am Absperrhahn der Luftkammer.</li>
	<li>Befestigen Sie ein Rohr vom weiblichen Luer der Luftkammer am Absperrhahn am Tierverarbeitungsbehälter. HINWEIS: Wenn die Luftaufblaskammer wie in Abbildung 1Cdargestellt aufgebaut ist, kann das Anbringen von Schläuchen in umgekehrter Reihenfolge dazu führen, dass Wasser in den Schlauch austritt, der mit der Trachealkanüle verbunden ist.</li>
	<li>Stellen Sie sicher, dass die Kappe zur Luftkammer fest verschlossen ist.</li>
	<li>Stellen Sie sicher, dass der Absperrhahn an der Außenseite des Tierverarbeitungsbehälters geschlossen ist und der Absperrhahn am Schlauch, der von der Wassersäule zur Luftaufblaskammer führt, offen ist.</li>
	<li>Füllen Sie die Spritze mit Wasser bis zur Markierung "25 cm". Wasser verlässt die Spritze durch den Schlauch in die Luftkammer. Sobald der Druck ausgeglichen ist, hört das Wasser auf zu fließen.<ol>
<li>Es ist möglich, dass Wasser langsam in die Luftfüllkammer austritt, da der Umgebungsluftdruck innerhalb der chemischen Haube schwankt. Behalten Sie den Wasserstand in der Spritze im Auge und fügen Sie bei Bedarf weitere hinzu. Halten Sie den Wasserstand während des gesamten Verfahrens auf der Marke "25 cm". HINWEIS: Normalerweise bleibt der Wasserstand für den ersten Teil der Luftluftluft bei 25 cmH2O konstant; Während der Fixierung muss jedoch wahrscheinlich mehr Wasser in die Spritze einfärbst. Wenn das Wasser nicht aufhört zu fließen, ist es wahrscheinlich, dass ein Luftleck in der Luftfüllkammer besteht. Möglicherweise müssen mehr Silikondichtungshersteller um die Luers herum angebracht werden, um Luftlecks zu vermeiden.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. Vorbereitung der Tiere (Abbildung 2)
HINWEIS: Dieses Verfahren wurde von Gage et al13modifiziert. Wir haben dieses Verfahren an erwachsenen männlichen und weiblichen Mäusen unterschiedlichen Alters abgeschlossen und stellen keine Alters- oder Geschlechtsverzerrung fest.
<ol><li>Euthanisieren Sie das Tier mit Natriumpentobarbital (150 mg/kg, intraperitoneal). Stellen Sie sicher, dass das Tier tot ist, bevor Sie mit der Dissektion beginnen. HINWEIS: Während dieses Verfahren an eingeschläferten Tieren durchgeführt wird, kann dieses Verfahren an lebenden Tieren durchgeführt werden, um das Herz zu nutzen, um Perfusate durch das Tier zu pumpen.</li>
	<li>Machen Sie zwei seitliche Einschnitte durch die Bauchdecke. Machen Sie den ersten Schnitt unterhalb des Brustkorbs und den zweiten über den Hüften. Schneiden Sie entlang der Mittellinie vom unteren Schnitt zum oberen Schnitt.</li>
	<li>Machen Sie mit einer stumpfen Schere vorsichtig einen Schnitt in die seitliche Seite des Zwerchfells. Die Lunge sollte kollabieren, sobald das Zwerchfell punktiert ist. HINWEIS: Es muss darauf geachtet werden, dass die Lunge nicht punktiert wird. Eine punktierte Lunge ist weniger wahrscheinlich, sich bei späteren Schritten aufzublasen.</li>
	<li>Schneiden Sie quer entlang der Membran, um die Brusthöhle zu öffnen.</li>
	<li>Schneiden Sie überlegen entlang des Brustbeins vom Xiphoid-Prozess bis zur jugulären Notch und seitlich über dem Brustkorb, um Herz und Lunge vollständig freizulegen. Stecken Sie die Seiten des Brustkorbs fest.</li>
	<li>Machen Sie einen Mittellinienschnitt im Hals oberhalb der Luftröhre. Entfernen Sie Haut, Muskeln, Schilddrüse und Bindegewebe, das die Luftröhre umgibt.</li>
	<li>Schieben Sie mit einer gekrümmten Zette zwei Gewinde- oder Nahtstücke unter die hintere Luftröhre. Verwenden Sie ein Stück Naht, um den Aufblas-Luer-Stub-Adapter an Ort und Stelle zu halten, und verwenden Sie das andere schließlich, um die Luftröhre am Ende der Luftblase und der vaskulären Perfusionsfixierung abzubinden.</li>
	<li>Stechen Sie ein kleines Loch in die Luftröhre mit einer 18G x 1" Nadel oder Vannas Federschere.</li>
	<li>Stecken Sie einen 20G Luer-Stub-Adapter in dieses Loch in der Luftröhre.</li>
	<li>Binden Sie ein Gewinde um die Luftröhre sofort distal an die Stelle, an die der Luer-Stub-Adapter eintritt, um sie an Ort und Stelle zu halten.</li>
	<li>Das Tier in den Tierverarbeitungsbehälter geben.</li>
	<li>Befestigen Sie den Luer-Stub-Adapter an der weiblichen Luer auf der Innenseite des Tierverarbeitungsbehälters.</li>
</ol>8. Luftblasen, Perfusion und Fixierung der Lunge (Abbildung 2)
<ol><li>Legen Sie die 25G x 5/8 "Nadel, die am Perfusionsapparat befestigt ist, in den rechten Ventrikel des Herzens.</li>
	<li>Schneiden Sie die Bauchaorta ab, damit Blut aus dem Herzen abfließen kann und um den Perfusatfluss durch die Lunge zu fördern.</li>
	<li>Öffnen Sie den Absperrhahn an der Außenseite des Tierverarbeitungsbehälters, um die Lunge aufzublasen. HINWEIS: Es kann einige Zeit dauern, bis sich die Lunge vollständig aufgeblasen hat. Beobachten Sie den Wasserstand in der Spritze, er sollte nicht schnell abnehmen, es sei denn, es gibt ein Leck in der Lunge.</li>
	<li>Blasen Sie die Lunge bei 25 cmH2O für 5 Minuten auf. Eine Inflation bei 25 cmH2O präditioniert die Lunge und hilft bei der Rekrutierung von atelektischen Lungenregionen. HINWEIS: Möglicherweise muss der Spritze eine kleine Menge Wasser hinzugefügt werden, um die Höhe von 25 cm zu erhalten. Entzündungen und/oder experimentell induzierte Lungenverletzungen können das Aufblasen der Lunge beeinflussen. In diesem Fall kann es erforderlich sein, den Inflationsdruck auf maximal 35 cmH2O zu erhöhen, um die Rekrutierung von atelektischen Regionen zu unterstützen.</li>
	<li>Schalten Sie in der letzten Minute der Lungeninflation die Peristaltikpumpe auf eine Durchflussrate von 10 ml/min ein. Heparinlösung sollte aus der Flasche durch den Schlauch in das Tier fließen.<ol>
<li>Das Ziel der Heparinfusion ist es, die Bildung von Thromben in den Gefäßen zu verhindern. Dementsprechend Heparin infundieren, bis die Lunge weiß wird und frei von Blut ist. Wenn die Lunge nicht weiß wird, kann eine Anpassung der rechtsventrikulären Nadel erforderlich sein.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Nach dem Aufblasen für 5 Minuten die Peristaltikpumpe ausschalten und den Perfusionsschlauch von der Heparinlösung auf das Fixiermittel umstellen.</li>
	<li>Senken Sie die Wassersäulenspritze auf die Markierung "20 cm" (Schritt 1.3). Es ist normal, dass sich Luftblasen innerhalb der Wassersäule bewegen, wenn sich der Druck von 25 auf 20 cmH2O ändert.<ol>
<li>Überprüfen Sie den Wasserstand in der Spritze. Es sollte bei der Marke "25 cm" sein. Es kann erforderlich sein, zu diesem Zeitpunkt weitere hinzuzufügen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Warten Sie 1 Minute, damit sich die Lunge von 25 auf 20 cmH2O entleeren kann.</li>
	<li>Starten Sie die Perfusionspumpe mit einer Durchflussrate von 6,5 ml/min neu.</li>
	<li>Vaskuläre Perfusion-Fix für 10 - 15 Minuten.</li>
</ol>9. Extraktion der Lunge (Abbildung 3)
<ol><li>Binden Sie das zweite Stück Gewinde um die Luftröhre distal fest mit dem Luer-Stub-Adapter. Entfernen Sie den Luer-Stub-Adapter aus der Luftröhre.</li>
	<li>Entfernen Sie die Nadel vom Herzen.</li>
	<li>Befreien Sie Lunge und Herz von der Brusthöhle, indem Sie das Bindegewebe posterior zum Mediastinum mit einer stumpfen Schere schneiden. Achten Sie darauf, eine Punktion der Lunge zu vermeiden.</li>
	<li>Entfernen Sie vorsichtig das Herz aus der Lunge.</li>
	<li>Legen Sie die Lunge über Nacht in fixierend. HINWEIS: Die Dauer des Fixativums hängt von nachgelagerten histologischen Studien ab.<ol>
<li>Legen Sie die Lunge in ein 50 ml konisches Röhrchen mit 20-25 ml Fixiermittel. Legen Sie das Gewinde, das die Luftröhre durch die Öffnung des konischen Rohrs sichert, und befestigen Sie es an den Gewinden der Kappe. Kehren Sie den konischen Schlauch um, um sicherzustellen, dass die schwimmfähigen, luftgeblasenen Lungen vollständig in Fixiermittel getaunken bleiben, da sie sonst an die Spitze der Flüssigkeit schweben.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verarbeiten Sie die Lunge für histologische Studien.</li>
</ol>

<ol><li>Hsia, C. C. W., Hyde, D. M., Ochs, M., Weibel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Official+Research+Policy+Statement+of+the+American+Thoracic+Society%2FEuropean+Respiratory+Society%3A+Standards+for+Quantitative+Assessment+of+Lung+Structure%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">An Official Research Policy Statement of the American Thoracic Society/European Respiratory Society: Standards for Quantitative Assessment of Lung Structure.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 181 (4), 394-418 (2010).</li>
<li>Weibel, E. R., Limacher, W., Bachofen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopy+of+rapidly+frozen+lungs%3A+evaluation+on+the+basis+of+standard+criteria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%3A+Respiratory%2C+Environmental+and+Exercise+Physiology%22%5BJournal%5D)">Electron microscopy of rapidly frozen lungs: evaluation on the basis of standard criteria.</a> Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 53 (2), 516-527 (1982).</li>
<li>Bachofen, H., Ammann, A., Wangensteen, D., Weibel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfusion+fixation+of+lungs+for+structure-function+analysis%3A+credits+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%3A+Respiratory%2C+Environmental+and+Exercise+Physiology%22%5BJournal%5D)">Perfusion fixation of lungs for structure-function analysis: credits and limitations.</a> Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 53 (2), 528-533 (1982).</li>
<li>Gil, J., Bachofen, H., Gehr, P., Weibel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alveolar+volume-surface+area+relation+in+air-+and+saline-filled+lungs+fixed+by+vascular+perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%3A+Respiratory%2C+Environmental+and+Exercise+Physiology%22%5BJournal%5D)">Alveolar volume-surface area relation in air- and saline-filled lungs fixed by vascular perfusion.</a> Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 47 (5), 990-1001 (1979).</li>
<li>Harris, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pressure-Volume+Curves+of+the+Respiratory+System%5BTitle%5D)+AND+%22Respiratory+Care%22%5BJournal%5D)">Pressure-Volume Curves of the Respiratory System.</a> Respiratory Care. 50 (1), 78-99 (2005).</li>
<li>Bachofen, H., Schürch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alveolar+surface+forces+and+lung+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Biochemistry+and+Physiology+Part+A%3A+Molecular+%26+Integrative+Physiology%22%5BJournal%5D)">Alveolar surface forces and lung architecture.</a> Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology. 129 (1), 183-193 (2001).</li>
<li>Mead, J., Takishima, T., Leith, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+distribution+in+lungs%3A+a+model+of+pulmonary+elasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Stress distribution in lungs: a model of pulmonary elasticity.</a> Journal of Applied Physiology. 28 (5), 596-608 (1970).</li>
<li>Mariano, C. A., Sattari, S., Maghsoudi-Ganjeh, M., Tartibi, M., Lo, D. D., Eskandari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+Mechanical+Strain+Characterization+of+Ventilated+ex+vivo+Porcine+and+Murine+Lung+using+Digital+Image+Correlation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Novel Mechanical Strain Characterization of Ventilated ex vivo Porcine and Murine Lung using Digital Image Correlation.</a> Frontiers in Physiology. 11, 600492(2020).</li>
<li>Braber, S., Verheijden, K. aT., Henricks, P. aJ., Kraneveld, A. D., Folkerts, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+fixation+methods+on+lung+morphology+in+a+murine+model+of+emphysema%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">A comparison of fixation methods on lung morphology in a murine model of emphysema.</a> American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 299 (6), 843-851 (2010).</li>
<li>Brain, J. D., Gehr, P., Kavet, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Airway+Macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22American+Review+of+Respiratory+Disease%22%5BJournal%5D)">Airway Macrophages.</a> American Review of Respiratory Disease. 129 (5), 823-826 (1984).</li>
<li>Wheeldon, E. B., Podolin, P. L., Mirabile, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alveolar+Macrophage+Distribution+in+a+Mouse+Model%3A+The+Importance+of+the+Fixation+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicologic+Pathology%22%5BJournal%5D)">Alveolar Macrophage Distribution in a Mouse Model: The Importance of the Fixation Method.</a> Toxicologic Pathology. 43 (8), 1162-1165 (2015).</li>
<li>Matulionis, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+deformation+and+macrophage+displacement+in+smoke-exposed+and+normal+mice+%28Mus+musculus%29+following+different+fixation+procedures%5BTitle%5D)+AND+%22Virchows+Archiv.+A%2C+Pathological+Anatomy+and+Histopathology%22%5BJournal%5D)">Lung deformation and macrophage displacement in smoke-exposed and normal mice (Mus musculus) following different fixation procedures.</a> Virchows Archiv. A, Pathological Anatomy and Histopathology. 410 (1), 49-56 (1986).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+Animal+Perfusion+Fixation+for+Rodents%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE+%28Journal+of+Visualized+Experiments%29%22%5BJournal%5D)">Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents.</a> JoVE (Journal of Visualized Experiments). (65), e3564(2012).</li>
<li>Crosfill, M. L., Widdicombe, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+characteristics+of+the+chest+and+lungs+and+the+work+of+breathing+in+different+mammalian+species%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Physical characteristics of the chest and lungs and the work of breathing in different mammalian species.</a> The Journal of Physiology. 158 (1), 1-14 (1961).</li>
<li>Ramos-Vara, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+and+Methods+of+Immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Safety+Evaluation%3A+Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">Principles and Methods of Immunohistochemistry.</a> Drug Safety Evaluation: Methods and Protocols. , 115-128 (2017).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preiszugeben.

Obwohl häufig verwendet, verdrängen intratracheale Fixierungsmethoden Leukozyten aus den Atemwegen und können die normale Lungenarchitektur verändern. Die in diesem Protokoll vorgesehene Methode der Luftinflation mit vaskulärer Perfusionsfixierung überwindet diese Fallstricke und bewahrt die Lungenanatomie genauer. Zu den Schlüsseln zur Gewinnung von hochwertigem Gewebe aus der vaskulären Perfusionsfixierungsmethode gehören die sorgfältige Überwachung des Luftfülldrucks, die Vermeidung von Luftlecks und die Sicherstellun...

Die Lungenhistologie stellt den Goldstandard für die Beurteilung der Lungenarchitektur während gesundheitlich und krank dar und ist eines der am häufigsten verwendeten Werkzeuge von Lungenforschern1. Einer der kritischsten Aspekte dieser Technik ist die richtige Isolierung und Erhaltung von Lungengewebe, da variabilität in diesem Schritt zu schlechter Gewebequalität und fehlerhaften Ergebnissen führen kann1,2,3. Bei lebenden Tieren wird das Lungenvolumen durch das Gleichgewicht zwischen dem nach innen elastischen Rückstoß der Lunge und den nach außen übertragenen Kräften bestimmt, die von der Brustwand und dem Zwerchfell durch Oberflächenspannung übertragen werden. Dementsprechend gehen beim Eintritt in den Thorax äußere Kräfte verloren und die Lunge kollabiert. Histologische Abschnitte, die aus kollabierten Lungen hergestellt werden, haben ein überfülltes Aussehen und Grenzen zwischen anatomischen Kompartimenten (dh Lufträumen, Gefäßen und Interstitium) können schwer zu unterscheiden sein. Um diese Herausforderung zu umgehen, blasen Forscher die Lunge während der chemischen Fixierung oft auf, so dass die Größe und Architektur des Luftraums erhalten bleibt.
Lungen können mit Luft oder Flüssigkeit aufgeblasen werden. Der Druck, der notwendig ist, um die Lunge auf das gleiche Volumen aufzublasen, unterscheidet sich zwischen Luft- und Flüssigkeitsaufblasen aufgrund von intermolekularen Kräften an der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche. Beim Luftaufblasen ist ein höherer Druck (z. B.25cmH 2 O) erforderlich als beim Flüssigkeitsaufblasen (z. B. 12 cmH2O), um die Oberflächenspannung zu überwinden und die kollabierten Alveolen zu öffnen4. Sobald die Alveolen rekrutiert wurden, kann ein niedrigerer Druck die Alveolen auf das gleiche Volumen wie die Druck-Volumen-Kurve Plateaus offen halten, und die Drücke gleichen sich in der gesamten Lunge nach Pascals Gesetz4,5,6,7,8aus.
Es gibt zwei Hauptmethoden der Lungeninflation und -fixierung, um die mausige Lunge für die Histologie zu erhalten. Am häufigsten werden die Lufträume mit Flüssigkeit eingeträufert - oft mit einem Fixiermittel. Der Hauptvorteil dieses Ansatzes ist, dass er relativ einfach ist und wenig Training erfordert. Während die intratracheale Instillation von Fixativmitteln in Studien, die sich auf das Gefäßsystem konzentrieren, bevorzugt werden kann, neigt Flüssigkeit, die über die Luftröhre eingeträufelt wird, dazu, proximale Atemwegszellen und Mucine in distalere Luftraumregionen zudrücken,während die Luftinflation nicht1,3,4,9,10,11. Darüber hinaus verändert die versehentliche Ablösung von Leukozyten vom Epithel während des flüssigen Aufblasens ihre Morphologie und verleiht ihnen künstlich ein einfaches, abgerundetes Aussehen4,10,11,12. Schließlich kann das Aufblasen der Lunge mit Flüssigkeit unbeabsichtigt das Interstitiumkomprimieren 4,10,11. Zusammen können diese Faktoren die normale Anatomie und die Zellulären Verteilungen innerhalb der konservierten Lunge verzerren und so die Technik einschränken.
Eine alternative Methode der Gewebeerhaltung ist die vaskuläre Perfusionsfixierung. Bei dieser Methode wird das Fixiermittel über die Hohlvene oder den rechten Ventrikel in das Lungengefäß perfundiert. Diese Methode bewahrt die Position und Morphologie von Zellen im Luftraumlumen. Wenn die Lunge jedoch während der Perfusionsfixierung nicht aufgeblasen wird, wird das Lungengewebe wahrscheinlich kollabieren.
Luftblasen mit vaskulärer Perfusionsfixierung nutzen die Stärken aus jeder der oben genannten Fixierungstechniken. Hierin stellen wir ein Protokoll für diese Technik zur Verfügung. Die benötigten Materialien und Geräte sind relativ kostengünstig und können leicht beschafft und montiert werden. Der fertige Aufbau, der in Abbildung 1Adargestellt ist, sorgt über eine einstellbare, flüssigkeitsgefüllte Säule für einen konstanten Atemwegsdruck in der Lunge, während eine Peristaltikpumpe das Fixiermittel über den rechten Ventrikel liefert. Lungen mit erhaltener Morphologie können dann für Struktur-Funktions-Analysen weiterverarbeitet werden.

<table><tbody><tr><td>00117XF-Hahn 1-fach 100/PK M Luer</td><td>Cole-Parmer</td><td>Mfr # VPB1000050N &ndash; Artikel # EW-00117-XF</td><td>Stopcock</td></tr><tr><td>BD 60 mL Spritze, Slip Tip</td><td>BD</td><td>309654</td><td>Spritze zum Aufbau der Wassersäule</td></tr><tr><td>BD PrecisionGlide Nadel 25G x 5/8</td><td>BD Biosciences 305122</td><td></td><td>Nadel für Gefäßperfusion/-fixierung</td></tr><tr><td>Weiblicher Luer Thread Style Panel Mount 1/4-28 UNF auf männlichen Luer</td><td>Nordson Medical</td><td>FTLLBMLRL-1</td><td>weiblicher Luer</td></tr><tr><td>Heparin-Natriumsalz aus der Darmschleimhaut von Schweinen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3393</td><td>Heparinlösung.</td></tr><tr><td>Luer-Stub Adapter BD Intramedic 20 Gauge</td><td>BD Biosciences</td><td>427564</td><td>Luer-Stub Adapter</td></tr><tr><td>männlicher Luer (2) auf weibliches Luergewinde T-Stück</td><td>Nordson Medical</td><td>LT787-9</td><td>männlicher Luer</td></tr><tr><td>Nalgene 180 durchsichtiger Kunststoff-PVC-Schlauch</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>8000-9020</td><td>Schlauch</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd wässrige Lösung - 32%</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>15714-S</td><td>Fixative Lösung. Verdünnt auf 4% mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung</td></tr><tr><td>Permatex Ultra Blue Mehrzweck-RTV-Silikondichtungsmacher</td><td>Permatex</td><td>81724</td><td>Silikondichtungsmacher zum luftdichten Abdichten von Kammern</td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung, 1x ohne Kalzium und Magnesium</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td>Flasche zum Bau der Luftaufblaskammer und Puffer für Heparin und Fixierlösungen</td></tr><tr><td>Sterilite Ultra Seal 16.0 Tasse rechteckiger Aufbewahrungsbehälter für Lebensmittel</td><td>Sterilite</td><td>0342</td><td>Behälter für die Tierverarbeitung</td></tr></tbody></table>

luft-aufblasen der murinen lunge mit vaskulärer perfusionsfixierung

Air-Inflation of Murine Lungs with Vascular Perfusion-Fixation

Die Lungenhistologie wird häufig verwendet, um die Beiträge von Luftraumzellen während der Lungenöostase und krankheitspathogenese zu untersuchen. Häufig verwendete Instillations-basierte Fixierungsmethoden können jedoch Luftraumzellen und Schleim in die terminalen Atemwege verdrängen und die Gewebemorphologie verändern. Im Vergleich dazu sind vaskuläre Perfusionsfixierungstechniken überlegen, um die Position und Morphologie von Zellen innerhalb der Lufträume und der Schleimhaut zu erhalten. Wenn jedoch nicht gleichzeitig ein positiver Atemwegsdruck ausgeübt wird, können Regionen der Lunge kollabieren und Kapillaren können sich in die Alveolarräume wölben, was zu einer Verzerrung der Lungenanatomie führt. Hierin beschreiben wir eine kostengünstige Methode zum Aufblasen der Luft während der vaskulären Perfusionsfixierung, um die Morphologie und Lage von Atemwegs- und Alveolarzellen und Interstitium in murinen Lungen für nachgeschaltete histologische Studien zu erhalten. Konstanter Luftdruck wird über die Luftröhre aus einer versiegelten, luftgefüllten Kammer, die den Druck über eine einstellbare Flüssigkeitssäule aufrechterhält, an die Lunge abgegeben, während das Fixiermittel durch den rechten Ventrikel durchblutet wird.

In einem intakten Thorax wird die Lunge durch äußere Kräfte, die von der Brustwand über den Pleuraraum6,14ausgeübtwerden,offen gehalten. Wenn das Zwerchfell während der Dissektion betreten wird, wird die Integrität des Pleuraraums aufgehoben und die Lunge sollte kollabieren (Abbildung 2A, 2B). Um die Lunge wieder zu erweitern, wird ein Luftaufblasen durchgeführt. In einem ersten Schritt werden 25 cm Wasserdruck angew...

Vorgestellt wird eine Methode zur Luftinflation mit vaskulärer Perfusionsfixierung der Lunge, die die Position von Zellen in Atemwegen, Alveolen und Interstitium für Struktur-Funktions-Analysen bewahrt. Der konstante Atemwegsdruck wird mit einer Luftfüllkammer aufrechterhalten, während das Fixiermittel über den rechten Ventrikel perfundiert wird. Lungen werden für histologische Studien verarbeitet.

Luft-Aufblasen der murinen Lunge mit vaskulärer Perfusionsfixierung

Lung histology is often used to investigate the contributions provided by airspace cells during lung homeostasis and disease pathogenesis. However, ...

Dies ist eine kostengünstige Methode, die die Vorteile von Luftinflation und vaskulärer Perfusionsfixierung zur Erhaltung der Lunge für Struktur- und Funktionsanalysen kombiniert. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die Erhaltung der Zellmorphologie und der Lage in den Lufträumen der Lunge. Beim Einsetzen des Köderstumpfadapters in die Luftröhre und der Perfusionsnadel in den rechten Ventrikel ist Vorsicht geboten, um ein ausreichendes Aufblasen und Fixieren zu gewährleisten.Um die Luftaufblasvorrichtung einzurichten, legen Sie eine Spritze für die Wassersäule in einen Ringhalter und messen eine vertikale Höhe von 25 Zentimetern von der Tierplattform bis zu 25 Zentimetern an der Wassersäule. Befestigen Sie am Ende des Wassersäulenrohrs den Absperrhahn an der Luftkammer und befestigen Sie ein Rohr vom weiblichen Köder der Luftkammer am Absperrhahn am Tierverarbeitungsbehälter. Vergewissern Sie sich, dass die Kappe zur Luftkammer und der Absperrhahn an der Außenseite des Tierverarbeitungsbehälters geschlossen sind und dass der Absperrhahn am Schlauch, der von der Wassersäule zur Luftaufblaskammer führt, offen ist.Dann füllen Sie die Spritze mit Wasser bis zur 25-Zentimeter-Marke. Was

air-inflation-of-murine-lungs-with-vascular-perfusion-fixation

Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

In diesem Video beschreiben wir das Verfahren zur Isolierung und chemischen Fixierung des Lungenwerts der Maus in geschlossener Konformation mittels Perfusionsdruckbeaufschlagung.

Druckfixierung einer isolierten Maus-Pulmonalklappe: ein Verfahren zur Isolierung und chemischen Fixierung der Maus-Pulmonalklappe in geschlossener Konformation

Hypoxische Lungenvasokonstriktion (HPV) ist ein wichtiges physiologisches Phänomen, durch das bei alveolarer Hypoxie-Lungenperfusion auf die Beatmung abgestimmt wird. Das wichtigste Gefäßsegment, das zu HPV beiträgt, ist die Intra-Acinar-Arterie. Hier beschreiben wir unser Protokoll zur Analyse von HPV von murinen Lungengefäßen mit Durchmessern von 20-100 m.

Videomorphometrische Analyse der hypoxischen Lungenvasokonstriktion der intrapulmonalen Arterien mit Murine Precision Cut Lung Slices

Die isolierten durchbluteten Lungenpräparat macht es möglich, Mikrogefäßnetzwerken auf der Lungenoberfläche zu visualisieren. Hier beschreiben wir einen Ansatz zur Durchlässigkeit der einzelnen Mikrogefäße in isolierten Lungen quantifizieren mit Echtzeit-Fluoreszenz-Bildgebung.

Quantifizierung der Mikrogefäßdurchlässigkeit im Einzel isolierten Blutdurchbluteten Lungen Rat Vorbereitung

Das Ziel dieser Arbeit ist es, einfache Methoden, die sich stark in den Aufbau und die Analyse von Mauslungen mit Lungenkrebs oder anderen Pathologien helfen werden zu beschreiben. Wir stellen 3-Protokolle, um einfach und zuverlässig durchführen Lungen Instillationen, Fixierung, und Lungenvolumenmessungen.

Instillation und Fixationsmethoden Nützlich in Maus Lung Cancer Research

Die interne Lungenoberfläche (ISA) ist ein kritisches Kriterium für die Beurteilung der Lungenmorphologie und der Physiologie bei Lungenkrankheiten und der verletzungsinduzierten alveolären Regeneration. Wir beschreiben hier eine standardisierte Methode, die die Messvorspannung für ISA sowohl in der Lungenpneumonektomie als auch in den Prothesenimplantationsmausmodellen minimieren kann.

Eine standardisierte Methode zur Messung der inneren Lungenoberfläche über Maus Pneumonektomie und Prothesenimplantation

Hier wird ein nützliches Protokoll zur Lungenfixierung vorgestellt, das einen stabilen Zustand für die histologische Auswertung von Lungenproben aus einem Mausmodell von Emphysem schafft. Der Hauptvorteil dieses Modells ist, dass es viele Lungen mit dem gleichen konstanten Druck ohne Lungenkollaps oder Deflation reparieren kann.

Lungenfixierung unter konstantem Druck zur Beurteilung von Emphysem bei Mäusen

Der Zweck dieser Methode ist es, eine einfache und effiziente Methode für die Perfusion, Inflation und Fixierung von Mauslungen für die Untersuchung der Lungentumorpathologie und die Bewertung von Metastasen an der Lunge zu präsentieren.

Perfusion und Inflation der Mauslunge für Tumorhistologie

Das Ziel dieser Technik ist die ex vivo Visualisierung von pulmonalen arteriellen Netzwerken von frühpostnatalen und erwachsenen Mäusen durch Lungeninflation und Injektion einer radio-opaque polymerbasierten Verbindung über die Lungenarterie. Mögliche Anwendungen für gegossenes Gewebe werden ebenfalls diskutiert.

Vaskuläres Gießen von Erwachsenen und frühpostnatalen Mauslungen für Micro-CT Imaging

Kombinierte Ozon- und bakterielle Endotoxin-exponierte Mäuse zeigen einen weit verbreiteten Zelltod, einschließlich des von Neutrophilen. Wir beobachteten zelluläre Anpassungen wie die Störung der zytoskelettalen Lamellipodie, eine erhöhte zelluläre Expression der komplexen V-ATP-Synthase-Untereinheit β und Angiostatin in der broncho-alveolären Lavage, die Unterdrückung der Lungenimmunantwort und eine verzögerte Neutrophilenrekrutierung.

Visualisierung von lungenzellulären Anpassungen während kombinierter Ozon- und LPS-induzierter akuter Lungenverletzungen bei Der Maus

Das Ziel ist es, ein neues ex vivo Lungenperfusionsmodell (EVLP) an Ratten zu entwickeln, das eine konsistente Lungenfunktion für 4 Stunden während der gesamten EVLP aufrechterhalten kann und der Industrie Implementierungsspezifikationen liefert, die eine robuste Methode zur Anwendung von EVLP auf Nagetiermodelle bieten.

Etablierung eines neuartigen ex vivo Lungenperfusionssystems für Rattenlungen nach Kreislauftod

Wir stellen eine Methode für ein Pilzpathogenesemodell vor, das die natürliche Positionierung von Pilzsporen in den Lungenatemwegen für die Analyse mittels Fluoreszenzmikroskopie beibehält.

Effiziente Methode zur Bildgebung der Lunge von Mäusen, die die räumliche Dynamik von Pilzsporen in den Atemwegen bewahrt

Lernen Sie eine kostengünstige Methode zur Luft-Aufblasung der murinen Lunge mit vaskulärer Perfusionsfixierung für die histologische Analyse. Diese Technik bewahrt Morphologie und Zelllokalisation in den Lungenluftwegen besser als traditionelle Fixierungsmethoden.

Luft-Aufblasen der murinen Lunge mit vaskulärer Perfusionsfixierung

Weitere Videos entdecken