Kryo-elektronenmikroskopische Gittervorbereitung für zeitaufgelöste Studien mit einem neuartigen Robotersystem, Spotiton
February 25th, 2021
Das hier vorgestellte Protokoll beschreibt die Verwendung von Spotiton, einem neuartigen Robotersystem, um zwei interessante Proben auf ein selbstableitendes Nanodrahtgitter zu liefern, das sich vor der Vitrifikation in flüssigem Kryogen mindestens 90 ms vermischt.
Mit dem Spotiton-Robotersystem kann man ein interessantes Protein mit einem interagierenden Partner auf einem Elektronenmikroskopgitter in nur 90 Millisekunden mischen und vitrifizieren. Dieses Protokoll ermöglicht die Erfassung von Intermediärproteinbestätigungen, die zu transient sind, um mit Standard-Gittervorbereitungstechniken erfasst zu werden. Zeitaufgelöst Spotiton kann biologische oder biochemische Systeme im Sekundenbruchteil wie Membrankanalaktivierung, DNA- oder RNA-Synthese oder frühe Interaktion eines Arzneimittels oder Antikörpers mit seinem Zielprotein beeinflussen.
Der Benutzer muss gleichzeitig mehrere Komponenten verwalten, die sich direkt auf die Qualität eines Rasters auswirken. Es ist wichtig, das System vor der Verwendung zu verstehen und Geduld bei der Vorbereitung von Gittern zu haben. Öffnen Sie zunächst das Hauptventil am Stickstoffversorgungstank und stellen Sie sicher, dass der Systembehälter mit entgastem Reinstwasser gefüllt ist.
Schalten Sie den Computer und das Spotiton-System an der Steckdosenleiste mit mehreren Steckdosen ein. Klicken Sie auf das Desktop-Symbol, um die Benutzeroberfläche der Spotiton-Software zu öffnen. Wählen Sie im Menü Extras die Option Stufen initialisieren aus, um die dreiachsigen Roboter und die rotierende Dispenserkopfbaugruppe zu initialisieren und zu homeen, um sicherzustellen, dass die Dispenserspitzen vor der Initialisierung und dem Homing nach unten zeigen.
Klicken Sie im Hauptmenü auf Zur sicheren Position gehen, um die Roboter in die sichere Position zu schicken. Wählen Sie auf der Registerkarte Aspirieren die Option Prime aus, um die Spenderköpfe mehrmals mit Wasser aus dem Reservoir zu spülen. Fahren Sie fort, bis zwei ununterbrochene Wasserströme aus den Spitzen auftauchen können.
Senden Sie auf der Registerkarte Inspect tip one an die Inspektionskamera und testen Sie das Löschwasser, wobei Sie die Amplitude anpassen, bis diskrete Tröpfchen erzeugt werden. Drücken Sie die Aufnahmetaste im oberen Kameramonitor, um ein Video von Tipp eins aufzunehmen. Senden Sie Tipp zwei an die Inspektionskamera.
Spielen Sie das Video von Spitze eins ab, das auf dem rechten Monitor feuert, während Spitze zwei im oberen Kameramonitor ausgelöst wird, entsprechend dem Muster der Tröpfchenproduktion aus den beiden Spendern. Entfernen Sie die Pinzette mit dem mitgelieferten Inbusschlüssel von der Halterung des Gitterroboters. Positionieren Sie auf einem nahe gelegenen Tischgerät einen Testgitter-Nanodraht seit oben am Rand des Gitterblocks.
Greifen Sie vorsichtig den Rand des Gitters und positionieren Sie ihn richtig in der Pinzette. Dann stellen Sie die Pinzette wieder auf. Klicken Sie auf der Registerkarte Kryo auf Tipp zur Kamera, um Spitze eins in das Sichtfeld der oberen Tauchpfadkamera zu verschieben, um sicherzustellen, dass Live im oberen Kameramonitor ausgewählt ist.
Schalten Sie das obere Kameralicht ein und stellen Sie es ein. Positionieren Sie die Spitze eins sichtbar im oberen Kameramonitor, indem Sie mit der Maus innerhalb des Monitors klicken. Klicken Sie auf Raster zu Kamera, um das Raster vor der oberen Kamera zu positionieren, und passen Sie dann bei Bedarf die Spitze um eine Position an.
Stellen Sie auf der Registerkarte Kryo sicher, dass Vitrified Grid nicht ausgewählt ist, klicken Sie auf Queue Target und dann auf Plunge. Bewerten Sie die oberen und unteren Bilder, um zu bestätigen, dass die Spender normal funktionieren. Verdünnen Sie zwei Proben mit einem geeigneten Puffer auf die gewünschten Konzentrationen, idealerweise verwenden Sie den gleichen für beide, und füllen Sie die Kryogenschüssel mit flüssigem Stickstoff.
Plasma reinigt drei bis vier Nanodrahtgitter mit fünf Watt Wasserstoff und Sauerstoff und 1,5 Minuten als Ausgangspunkt. Stecken Sie den Vernebler ein und beobachten Sie, wie der Dampf den zentralen Anschluss der Verneblerkappe verlässt. Beobachten Sie den Live Humidity Monitor im Hauptfenster oder öffnen Sie den Ambient Humidity Tracker unter Berichte und Umgebung.
Überprüfen Sie die Luftfeuchtigkeit in den Kammer- und Verkleidungszonen. Geben Sie fünf Mikroliter jeder Probe in die Probenbecher. Legen Sie die Probenbecher in das Auffangfach mit einer Probe für Spitze eins auf der linken und für Spitze zwei auf der rechten Seite.
Schieben Sie dann das Tablett zurück in die Maschine, bis es sitzt. Wählen Sie auf der Registerkarte Aspirat drei Mikroliter für das Volumen aus, das von jeder Spitze aspiriert werden soll. Stellen Sie sicher, dass das Probenfach sicher eingesetzt wurde, klicken Sie auf Aspirate und beobachten Sie, wie die Pipettenstufe die Spenderköpfe in die Probenbecher bewegt.
Überprüfen Sie die erfolgreiche Aspiration beider Proben, indem Sie die Probenbecher entfernen und einen Abfall des Flüssigkeitsstandes beobachten. Senden Sie auf der Registerkarte Prüfen jeden Tipp an die Inspektionskamera, um die ungehinderte Dosierung zu bestätigen. Passen Sie die Amplitude nach Bedarf an, um die Tröpfchenbildung von jeder Spitze anzupassen.
Laden Sie ein frisch plasmageputztes Gitter in die Pinzette, montieren Sie die Pinzette aber noch nicht. Stellen Sie sicher, dass die Luftfeuchtigkeit auf etwa 90 bis 95% erhöht ist Füllen Sie den Ethanbecher und führen Sie einen abschließenden Testbrand beider Spitzen vor der Inspektionskamera durch, um zu bestätigen, dass keine Behinderung besteht. Klicken Sie auf der Registerkarte Kryo auf Tipp zur Kamera.
Überprüfen Sie den Ethanbecher. Wenn sich Ethaneis gebildet hat, schmelzen Sie nach Bedarf mit zusätzlichem Ethangas. Montieren Sie die Pinzette mit dem Gitter auf der Gitterbühne.
Klicken Sie auf der Registerkarte Kryo auf Raster zur Kamera, um sicherzustellen, dass Tipp eins korrekt im oberen Kameramonitor positioniert ist. Klicken Sie auf Vitrified Grid, Queue Target und dann Auf Plunge. Klicken Sie auf OK, wenn Sie aufgefordert werden, dem Gitterroboter zu befehlen, das Gitter von Ethan in flüssigen Stickstoff zu hüpfen und es in das untergetauchte Regal freizugeben.
Untersuchen Sie die Bilder des Rasters, um zu entscheiden, ob es beibehalten oder verworfen werden soll. Wenn Sie das Gitter halten, kühlen Sie die feinspitzige Zette vor, greifen Sie das Gitter vorsichtig an der Kante und legen Sie es in einen Gitterkastenschlitz, beginnend mit dem ersten Schlitz links von der Notch und im Uhrzeigersinn. Verwenden Sie den Experiment Viewer, um die Rasterbilder der oberen und unteren Kameras zusammen mit den Maschineneinstellungen und Feuchtigkeitsmessungen zum Zeitpunkt des Tauchgangs zu überprüfen und zu vergleichen, indem Sie Berichte und Experiment auswählen.
Bilder von Gittern, die während einer einzigen zeitaufgelösten Spotiton-Sitzung durch Mischen von RNA-Polymerase in einem 105-Basenpaar-DNA-Oligomer mit einer Promotorsequenz für 150 Millisekunden vor der Vitrifikation hergestellt wurden, werden hier gezeigt. Von den sechs Gittern zeigt nur eines einen suboptimalen Docht. Das Muster der Eisablagerung auf einem verglasten Gitter stimmt eng mit dem Muster der abgelagerten Flüssigkeit überein, das im oberen Kamerabild zu sehen ist.
Ein effektiver Docht der gemischten Proben erfolgt entlang der mit Nanodrähten bedeckten Gitterstäbe, wo die Probe selten in Quadrate überläuft, die an diejenigen angrenzen, in denen sie gelandet ist. In eisgefüllten Quadraten ist das Eis typischerweise am dicksten in Löchern in der Mitte des Quadrats und wird dünner in Löchern, die näher an den Gitterstäben sind. Löcher, die unmittelbar an die Gitterstäbe angrenzen, sind aufgrund der Nähe zu den Nanodrähten oft leer.
Die richtige Vorbereitung und Handhabung der Nanodrahtgitter gewährleistet eine gute Eisdicke auf gemischten Probengittern. Das Spotiton-System ermöglicht es dem Benutzer auch, die beiden Proben separat auf einem einzigen Gitter zu deponieren, was die Sammlung einer ungemischten Steuerung während derselben Netzwartungssitzung ermöglicht. Spotiton hat es ermöglicht, die ersten Zwischenprodukte in der bakteriellen Genexpression in Echtzeit zu erfassen.
Da sie sich auf einer Zeitskala von unter einer Sekunde bilden, waren ihre Strukturen bisher unbekannt.
Überblick
Diese Studie präsentiert ein Protokoll, das das Spotiton-Robotersystem für das schnelle Mischen und die Vitrifikation von Proteinen auf einem Elektronenmikroskop-Raster nutzt. Die Technik erfasst vorübergehende Proteinkonformationen, die Standardmethoden nicht erfassen können, und ebnet den Weg für Einblicke in dynamische biologische Prozesse.
Wichtige Studienkomponenten
Forschungsbereich
- Proteininteraktionen
- Vorübergehende Konformationen
- Kryo-Elektronenmikroskopie
Hintergrund
- Bedeutung der Untersuchung schneller Proteininteraktionen
- Herausforderungen beim Erfassen vorübergehender Zustände
- Nützlichkeit der Vitrifikation in der biologischen Forschung
Verwendete Methoden
- Verwendung des Spotiton-Systems für Probenmischen und Vitrifikation
- Anwendung umfasst Protein und Interaktionspartner auf Nanodraht-Rastern
- Hochgeschwindigkeitsmischen zur Erfassung von Zwischenprodukten
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Vitrifikation gemischter Proteinproben in nur 90 ms
- Effizientes Kapillarverhalten entlang von Nanodraht-Rastern, das die Probenintegrität gewährleistet
- Klare Visualisierung von Eisablagerungsmustern, die mit Mischergebnissen korrelieren
Schlussfolgerungen
- Diese Studie demonstriert effektiv den Nutzen von Time-resolved Spotiton bei der Beobachtung schneller biologischer Prozesse.
- Die Ergebnisse verbessern das Verständnis der Proteindynamik und Interaktionen, die für die biologische Forschung entscheidend sind.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Capturing transient molecular intermediates is a critical challenge in early-stage drug discovery and structural biology. The Spotiton robotic system enables time-resolved cryo-EM grid preparation, allowing R&D teams to interrogate rapid biomolecular interactions and conformational changes with high temporal precision. This capability enhances predictive confidence in target validation and supports risk-adjusted portfolio decisions at key discovery inflection points.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct observation of short-lived protein conformations relevant to target engagement.
- Supports mechanistic de-risking by capturing intermediate states in protein-ligand or protein-nucleic acid interactions.
- Facilitates functional target validation by revealing structural transitions on sub-second timescales.
Screening & Assay Development
- Prepares validated biological grids for downstream cryo-EM analysis with minimal sample volume.
- Standardizes grid preparation for reproducible, quantitative structural readouts.
- Enables rapid, scalable grid production to support high-throughput screening of molecular interactions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns structural snapshots with disease-relevant mechanisms, informing translational biomarker strategies.
- Provides continuity from discovery-stage mechanistic insights to preclinical model validation.
- Reduces ambiguity in structure-based drug design by capturing elusive intermediate states.
Pipeline & Workflow Integration
The Spotiton system integrates at the interface of early discovery and lead identification, bridging mechanistic interrogation with structural validation workflows.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling capture of rapid molecular events and pathway transitions.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative cryo-EM grids for comparative analysis of compound or biomolecule effects.
- Analytics: Provides high-resolution structural data to inform condition comparisons and mechanistic hypotheses.
- Translational Research: Connects early structural findings to preclinical validation when disease-relevant systems are studied.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, standardized workflow for repeated use across multiple discovery programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable grid preparation for structural studies.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient advancement of discovery assets.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by revealing transient states critical to biological function.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cryo-EM grid handling and robotic system operation.
- Needs access to Spotiton instrumentation and compatible nanowire EM grids.
- Demands rigorous calibration and cross-team standardization for reproducible results.
- Adaptation may be needed for different biomolecular systems or sample types.
- Grid quality is sensitive to humidity control, dispenser calibration, and sample preparation protocols.
