Name: In vitro 3D-zellkulierte arterielle Modelle zur Untersuchung des vaskulären Wirkstoff-Targetings unter Flow (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-14T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min
Description: Erfahren Sie die Herstellung 3D-zellulierter arterieller Modelle mit Endothelzellen und deren Einsatz zur Untersuchung von Wirkstoff-Targeting unter physiologischem Fluss. Diese Methode ermöglicht die Optimierung von Arzneiträgern für kardiovaskuläre Erkrankungen.

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Diese Arbeit wurde von der Israel Science Foundation unterstützt (ISF-Stipendium # 902/18). Maria Khourys Stipendium wurde vom Baroness Ariane de Rothschild Women Doctoral Program unterstützt.

HINWEIS: Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung eines 3D-Modells der Halsschlagader und kann angewendet werden, um jede andere Arterie von Interesse zu erzeugen, indem einfach die geometrischen Parameter geändert werden.
1. Entwurf und Herstellung einer 3D-Verzweigung des Modells der menschlichen Halsschlagader
<ol><li>Wählen Sie Bilder von Patienten oder zuvor untersuchte Geometrien der Verzweigung der menschlichen Halsschlagader und erstellen Sie ein computergestütztes Designmodell der Form, das gedruckt werden muss. HINWEIS: Die Karotisverzweigung hat einen Einlass und zwei Auslässe. Es ist wichtig, einen 3D-Formrahmen um die Arterie und temporäre Druckstützen zwischen dem Rahmen und der Arterienform zu entwerfen (Abbildung 2A-C).</li>
	<li>Drucken Sie die Geometrien mit einem 3D-Drucker. Schneiden Sie die temporären Druckstützen ab und verwenden Sie Schleifpapier, um die Formen zu polieren und zu glätten, insbesondere in den Bereichen, in denen die Stützen geschnitten wurden. Spülen Sie das geschliffene Modell mit Isopropylalkohol ab, um den Kunststoffstaub zu entfernen, und lassen Sie es in einer chemischen Haube für 2-3 h vollständig trocknen. HINWEIS: Hier wurden die gedruckten Formen aus Klarem Harz v4 hergestellt (Abbildung 2D, E).</li>
	<li>Um den Kunststoff leicht aufzulösen, sprühen Sie die Formen mit transparentem Lack in eine chemische Haube und lassen Sie sie 1 h an der Luft trocknen. Wiederholen Sie dies 3x. HINWEIS: Hier wurde 2X Ultra Cover Clear Spray verwendet, aber jede andere Art sollte geeignet sein, solange es sich nicht um Holzlack handelt. Vergewissern Sie sich, dass kein freiliegender Kunststoff mehr vorhanden ist, da der Kunststoff möglicherweise mit dem Silikon reagiert und verhindert, dass es sich richtig verfestigt. Die Qualität der besprühten Oberfläche bestimmt die Qualität der Oberfläche des endgültigen Silikonmodells.</li>
	<li>Schneiden Sie transparente rechteckige Dias / Streifen aus glattem Kunststoff mit den gleichen Abmessungen wie der Formrahmen und kleben Sie sie mit dem Lack auf allen Seiten und von einer Seite des Rahmens auf den Rahmen, so dass er unten versiegelt und oben geöffnet wird. Tragen Sie den Lack mit einem Pinsel in eine chemische Haube auf und lassen Sie die Dias mindestens 24 Stunden vollständig trocknen(Abbildung 2F).</li>
	<li>Um die Silikonkautschukmischung vorzubereiten, fügen Sie Flüssigsilikon mit seinem Härter (Massenverhältnis 1:10) in eine Kunststoffplatte ein und rühren Sie gründlich um, um eine vollständige Mischung zu gewährleisten. Für das Carotis-Modell fügen Sie 54 g des Silikons und 6 g seines Härters hinzu.</li>
	<li>Kühlen Sie das Gemisch für 15 min bei 4 °C ab und entgasen Sie es dann in einem Vakuum-Trockenmittel, bis alle Luftblasen beseitigt sind. Legen Sie die Form in den Trockenmittel (mit der offenen Seite nach oben), gießen Sie die Silikonmischung langsam in die Form und entfernen Sie die Luftblasen erneut, bis die Mischung klar ist.</li>
	<li>Lassen Sie die Form mit dem Silikon über Nacht bei Raumtemperatur stehen (wenn möglich, lassen Sie es ohne Vakuum im Ausstecher). Wenn die Mischung noch nicht vollständig getrocknet ist, inkubieren Sie sie bei 60 °C für weitere Stunden.</li>
	<li>Sobald die Mischung vollständig getrocknet ist, entfernen Sie die transparenten Dias und tauchen Sie das Modell 48 h lang in absolutes Aceton in eine chemische Haube, bis der Kunststoff vollständig gelöst ist. Entfernen Sie alle Plastikreste mit einem Holzstab. Um das im Modell eingeschlossene Aceton zu verdampfen, inkubieren Sie es bei 60 °C für mindestens 4 Tage, bevor Sie die Zelle aussäen.</li>
</ol>2. Zellkultur und Seeding in Modellen
<ol><li>Bereiten Sie drei Anschlüsse für das Carotismodell vor: einen für den Einlass und zwei für die Auslässe (siehe Materialtabelle). Sterilisieren Sie das Modell und die Anschlüsse durch ultraviolette Bestrahlung in einer biologischen Haube für 20 min.</li>
	<li>Beschichten Sie die Modelle mit 4 mL 100 μg/ml Fibronektin (in 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung, (PBS)) für 2 h bei 37 °C oder über Nacht bei 4 °C. Injizieren Sie die Fibronektinlösung durch den Einlass mit einer 5- oder 10-ml-Kunststoffspritze in das Modell. Entfernen Sie das Fibronektin durch den Auslass und waschen Sie das Modell mit EC-Medium.</li>
	<li>Suspendieren Sie 2,5 × 106 Zellen/ml humane Nabelschnurvenendothelzellen (HUVECs, Passage < 6) und füllen Sie das Modell mit 4 ml der Zellsuspension mit einer 5 oder 10 ml Kunststoffspritze (Abbildung 3A). Legen Sie das Modell auf einen Rotator in einem Inkubator (37 °C) mit einer Geschwindigkeit von 1 U / min für 48 h, um eine homogene Aussaat zu gewährleisten. Stellen Sie sicher, dass das Modell gut am Rotator befestigt ist (Abbildung 3B). Wechseln Sie das Medium nach 24 h in einer biologischen Haube und kehren Sie für weitere 24 h zum Rotator im Inkubator zurück. HINWEIS: Nach 24 h sind die Zellen ausgesät und können mit einem Mikroskop abgebildet werden.</li>
	<li>Entfernen Sie das Modell aus dem Rotator und waschen Sie es mit 1x PBS mit einer 10-ml-Kunststoffspritze. Um die Zellen zu fixieren, inkubieren Sie die Zellen mit 4 ml 4% Paraformaldehyd (PFA) für 15 minuten in einer chemischen Haube zum Modell und spülen Sie sie dann 3x mit PBS ab. Fügen Sie 4 ml PBS hinzu und lagern Sie es bei 4 °C bis zum Experiment (Abbildung 3C). Färben Sie die Zellen innerhalb des Modells mit Standard-Färbeprotokollen (z. B. Kernfärbung mit 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI), Abbildung 3D).</li>
</ol>3. Aufbau des Perfusionssystems
<ol><li>Das Perfusionssystem verfügt über zwei Einlässe und zwei Auslassröhrchen. Verschmelzen Sie die beiden Einlässe zu einem einzigen 4 mm ID-Rohr und wieder zu zwei 6 mm ID-Rohren, die mit der Peristaltikpumpe verbunden sind. Verschmelzen Sie die beiden 6-mm-ID-Rohre, die aus der Peristaltikpumpe kommen, zu einem einzigen 4-mm-Rohr und verbinden Sie es mit einem Schwingungsdämpfer, um Schwingungen von der Pumpe zu eliminieren. Verwenden Sie eine 250 ml schmalmundige Flasche mit einem dreiblendeigen Deckel als Dämpfer.</li>
	<li>Schließen Sie eine Öffnung an den Einlass der Pumpe an, schließen Sie die zweite mit einem Korken, der in Notfällen zur Druckentlüftung verwendet wird, und verlängern Sie die dritte Öffnung (die der Auslass ist) bis zum Boden der Flasche.</li>
	<li>Verbinden Sie den Dämpfer mit dem Einlass des kultivierten Halsschlagadermodells über den Auslassschlauch. Verschmelzen Sie die beiden Auslässe des Modells zu einem Schlauch, der der Auslass des Systems ist (Alle Schläuche sind 4 mm ID).</li>
	<li>Teilen Sie den Auslassschlauch in zwei Auslassrohre auf (eines für den geschlossenen Kreislauf und das andere für den Abfallbehälter im offenen Kreislauf). Befestigen Sie an jedem Rohr eine Kunststoffklemme. HINWEIS: Die Kombination aus offenen/geschlossenen Klemmen bestimmt, ob sich das System in einer geschlossenen oder offenen Konfiguration befindet. Wie in Abbildung 1dargestellt, ist das System ein geschlossener Stromkreis, wenn die Klemmen a und d geschlossen sind, während b und c geöffnet sind. Die Rückseite bringt das System zur Konfiguration des offenen Stromkreises.</li>
	<li>Bereiten Sie drei Behälter vor: einen, der 300 ml Flüssigkeit aufnehmen kann (für geschlossenen Kreislauf) und zwei weitere von jeweils 1 L: einen zum Waschen und den anderen für Abfälle (für den offenen Kreislauf).</li>
</ol>4. Geschlossene Konfiguration: Perfusionsexperiment und Bildgebung
<ol><li>Fügen Sie dem Behälter mit geschlossenem Kreislauf 300 ml PBS hinzu, was ausreicht, um das gesamte System einschließlich des Schlauchs und des Modells zu füllen. Legen Sie ein Einlassrohr und ein Auslassrohr (offene Klemmen b und c) in den Behälter.</li>
	<li>Füllen Sie den 1 L Waschbehälter mit destilliertem Wasser (zum Waschen am Ende des Experiments) und lassen Sie den anderen 1 L Abfallbehälter leer. Legen Sie die anderen Ein- und Auslassschläuche (schließen Sie die Klemmen a und d) in die Wasch- bzw. Abfallbehälter.</li>
	<li>Nehmen Sie das fest zellkulierte Carotismodell aus dem 4 °C-Speicher und leeren Sie das PBS. Schließen Sie den Ein- und Auslass der Halsschlagader wie in den Schritten 3.3-3.4 beschrieben an. Lassen Sie das Modell nicht lange trocken. Sobald das Modell angeschlossen ist, aktivieren Sie die Pumpe, um Flüssigkeit zu perfundieren.</li>
	<li>Legen Sie das Carotismodell unter das Mikroskop. Öffnen Sie den Schlauch vor dem Einlass und nach dem Auslass des Halsschlagadermodells. Stellen Sie die Peristaltikpumpe auf 10 U / min ein und schalten Sie sie ein. Erhöhen Sie die Geschwindigkeit in Schritten von 5 U / min, alle 4-5 minuten. Stellen Sie sicher, dass es keine Leckagen gibt.</li>
	<li>Bei 100 U/min, was der maximalen Durchflussrate der physiologischen Wellenform der menschlichen Halsschlagader (~400 ml/min) entspricht, fügen Sie fluoreszierende carboxylierte Polystyrolpartikel (PS) (2 μm, in einer Konzentration von 1,6 μg/ml) zu den 300 ml PBS im geschlossenen Kreislaufbehälter hinzu. Stellen Sie die Region von Interesse alle 10 s für 1,5 h ab (standbildlich einzelne Bilder oder Videos nach Bedarf).</li>
</ol>5. Open-Circuit-Konfiguration: der Waschschritt
<ol><li>Öffnen Sie die Klemmen der Wasch- und Abfallrohre in den 1-L-Behältern (Klemmen a und d) und schließen Sie sofort die Klemmen der Einlass- und Auslassrohre im 300-ml-Behälter (Klemmen b und c), um das System von einer geschlossenen in eine offene Kreislaufkonfiguration zu wechseln.</li>
	<li>Lassen Sie den größten Teil des Wassers mit 100 U / min vom Waschbehälter zum Abfallbehälter fließen. Bevor es vollständig übertragen wird, drücken Sie Stopp auf der Peristaltikpumpe und schließen Sie die Rohrklemmen vor dem Einlass und nach dem Auslass des Halsschlagadermodells.</li>
	<li>Erfassen Sie mit den entsprechenden Filtern Bilder des Modells im interessierende Bereich, um die Ablagerung und Haftung von Partikeln an den Zellen zu zeigen. Trennen Sie das Carotismodell. Fügen Sie vorsichtig und langsam 4 ml PBS mit einer 10-ml-Spritze durch den Einlass des Modells hinzu.</li>
	<li>Verbinden Sie ein "Dummy-Modell" (das auch ein Silikonkautschuk-3D-Carotismodell ist, das nur zum Waschen ohne kultivierte Zellen verwendet wird) anstelle des Carotismodells und spülen Sie das System aus. Fügen Sie weitere 1 L Wasser hinzu und waschen Sie das System erneut, bis das gesamte Wasser aus dem Waschbehälter in den Abfall überführt ist. Schalten Sie die Peristaltikpumpe aus.</li>
</ol>6. Datenerfassung und -analyse
<ol><li>Erfassen Sie einen digitalen Film der Partikelablagerung im interessierende Bereich mit den während des Experiments aufgenommenen Bildern mit einem benutzerdefinierten Softwarecode (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Für die Abbildung der Ablagerung der Partikel entlang des Modells kacheln Sie mehrere Bilder, um den untersuchten Bereich von Interesse abzudecken (Abbildung 4A, B). HINWEIS: Ein benutzerdefinierter Softwarecode kann geschrieben werden, um die Anzahl der anhaftenden Partikel an einem interessanten Ort zu quantifizieren (eine Beispieldatei wurde als ergänzende Informationbereitgestellt)17.</li>
</ol>

<ol><li>Chiu, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+effect+of+disturbed+flow+on+monocytic+adhesion+to+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanics%22%5BJournal%5D)">Analysis of the effect of disturbed flow on monocytic adhesion to endothelial cells.</a> Journal of Biomechanics. 36 (12), 1883-1895 (2003).</li>
<li>Martorell, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extent+of+flow+recirculation+governs+expression+of+atherosclerotic+and+thrombotic+biomarkers+in+arterial+bifurcations%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Extent of flow recirculation governs expression of atherosclerotic and thrombotic biomarkers in arterial bifurcations.</a> Cardiovascular Research. 103 (1), 37-46 (2014).</li>
<li>Karino, T., Goldsmith, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+behaviour+of+blood+cells+and+rigid+spheres+in+an+annular+vortex%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+transactions+of+the+Royal+Society+of+London.+Series+B%2C+Biological%22%5BJournal%5D)">Flow behaviour of blood cells and rigid spheres in an annular vortex.</a> Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological. 279 (967), 413-445 (1977).</li>
<li>Goldsmith, H. L., Karino, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelets+in+a+region+of+disturbed+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Transactions+-+American+Society+for+Artificial+Internal+Organs%22%5BJournal%5D)">Platelets in a region of disturbed flow.</a> Transactions - American Society for Artificial Internal Organs. 23, 632-638 (1977).</li>
<li>Farcas, M. A., Rouleau, L., Fraser, R., Leask, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+3-D%2C+in+vitro%2C+endothelial+culture+models+for+the+study+of+coronary+artery+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Engineering+Online%22%5BJournal%5D)">The development of 3-D, in vitro, endothelial culture models for the study of coronary artery disease.</a> Biomedical Engineering Online. 8, 30(2009).</li>
<li>Peng, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+nanoparticle+targeting+to+a+vascular+surface+in+shear+flow+through+diffusive+particle+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale+Research+Letters%22%5BJournal%5D)">Modeling nanoparticle targeting to a vascular surface in shear flow through diffusive particle dynamics.</a> Nanoscale Research Letters. 10 (1), 942(2015).</li>
<li>Shah, S., Liu, Y., Hu, W., Gao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+particle+shape-dependent+dynamics+in+nanomedicine%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nanoscience+and+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Modeling particle shape-dependent dynamics in nanomedicine.</a> Journal of Nanoscience and Nanotechnology. 11 (2), 919-928 (2011).</li>
<li>Hossain, S. S., Hughes, T. J., Decuzzi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+deposition+patterns+for+nanoparticles+in+an+inflamed+patient-specific+arterial+tree%5BTitle%5D)+AND+%22Biomechanics+and+Modeling+in+Mechanobiology%22%5BJournal%5D)">Vascular deposition patterns for nanoparticles in an inflamed patient-specific arterial tree.</a> Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 13 (3), 585-597 (2014).</li>
<li>Charoenphol, P., Huang, R. B., Eniola-Adefeso, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+role+of+size+and+hemodynamics+in+the+efficacy+of+vascular-targeted+spherical+drug+carriers%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Potential role of size and hemodynamics in the efficacy of vascular-targeted spherical drug carriers.</a> Biomaterials. 31 (6), 1392-1402 (2010).</li>
<li>Ta, H. T., Truong, N. P., Whittaker, A. K., Davis, T. P., Peter, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+particle+size%2C+shape%2C+density+and+flow+characteristics+on+particle+margination+to+vascular+walls+in+cardiovascular+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Drug+Delivery%22%5BJournal%5D)">The effects of particle size, shape, density and flow characteristics on particle margination to vascular walls in cardiovascular diseases.</a> Expert Opinion on Drug Delivery. 15 (1), 33-45 (2018).</li>
<li>Cooley, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+particle+size+and+shape+on+their+margination+and+wall-adhesion%3A+implications+in+drug+delivery+vehicle+design+across+nano-to-micro+scale%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Influence of particle size and shape on their margination and wall-adhesion: implications in drug delivery vehicle design across nano-to-micro scale.</a> Nanoscale. 10 (32), 15350-15364 (2018).</li>
<li>Jiang, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantum+dot+interactions+and+flow+effects+in+angiogenic+zebrafish+%28Danio+rerio%29+vessels+and+human+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%3A+Nanotechnology%2C+Biology%2C+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Quantum dot interactions and flow effects in angiogenic zebrafish (Danio rerio) vessels and human endothelial cells.</a> Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 13 (3), 999-1010 (2017).</li>
<li>Zarins, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carotid+bifurcation+atherosclerosis.+Quantitative+correlation+of+plaque+localization+with+flow+velocity+profiles+and+wall+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Carotid bifurcation atherosclerosis. Quantitative correlation of plaque localization with flow velocity profiles and wall shear stress.</a> Circulation Research. 53 (4), 502-514 (1983).</li>
<li>Chien, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+disturbed+flow+on+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Effects of disturbed flow on endothelial cells.</a> Annals of Biomedical Engineering. 36 (4), 554-562 (2008).</li>
<li>Malek, A. M., Alper, S. L., Izumo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemodynamic+shear+stress+and+its+role+in+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">Hemodynamic shear stress and its role in atherosclerosis.</a> JAMA. 282 (21), 2035-2042 (1999).</li>
<li>Glagov, S., Zarins, C., Giddens, D. P., Ku, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemodynamics+and+atherosclerosis.+Insights+and+perspectives+gained+from+studies+of+human+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Pathology+%26+Laboratory+Medicine%22%5BJournal%5D)">Hemodynamics and atherosclerosis. Insights and perspectives gained from studies of human arteries.</a> Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 112 (10), 1018-1031 (1988).</li>
<li>Khoury, M., Epshtein, M., Zidan, H., Zukerman, H., Korin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+deposition+of+particles+in+reconstructed+models+of+human+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Mapping deposition of particles in reconstructed models of human arteries.</a> Journal of Controlled Release. 318, 78-85 (2020).</li>
</ol>

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Aktuelle Ansätze zur Untersuchung des vaskulären Targetings von Partikeln versagen bei der Replikation der physiologischen Bedingungen im menschlichen Körper. Hier wird ein Protokoll zur Herstellung von 3D-rekonstruierten Modellen menschlicher Arterien vorgestellt, um das Partikel-Targeting auf die ECs zu untersuchen, die die Arterie unter physiologischem Fluss auskleiden, der mit einem maßgeschneiderten Perfusionssystem angewendet wird. Bei der Auswahl des Materials für den 3D-Druck ist es am besten, einen klaren Kunsts...

In jüngster Zeit wurden mehrere Ansätze unter Verwendung von 3D-Modellen der menschlichen Arterien1,2,3,4,5angewendet. Diese Modelle replizieren die physiologische Anatomie und Umgebung verschiedener Arterien im menschlichen Körper in vitro. Sie wurden jedoch hauptsächlich in zellbiologischen Studien verwendet. Aktuelle Studien zum vaskulären Targeting von Partikeln auf das Endothel umfassen in silico Computersimulationen6,7,8, in vitro mikrofluidische Modelle9,10,11und in vivo Tiermodelle12. Trotz der Erkenntnisse, die sie geliefert haben, haben diese experimentellen Modelle den Targeting-Prozess, der in menschlichen Arterien auftritt, nicht genau simuliert, wobei Blutfluss und Hämodynamik dominante Faktoren darstellen. Zum Beispiel kann die Untersuchung von Partikeln, die auf atherosklerotische Regionen in der Karotisarterienverzweigung abzielen, die für ihr komplexes Rezirkulationsflussmuster und ihren Wandscherspannungsgradienten bekannt sind, die Reise der Partikel beeinflussen, bevor sie das Endothel erreichen13,14,15,16. Daher müssen diese Studien unter Bedingungen durchgeführt werden, die die physiologische Umgebung replizieren, d. H.Größe, Dimension, Anatomie und Strömungsprofil.
Vor kurzem fertigte diese Forschungsgruppe 3D-rekonstruierte menschliche arterielle Modelle, um die Ablagerung und das Targeting von Partikeln auf das Gefäßsystem zu untersuchen17. Die Modelle basierten auf geometrischen 3D-Nachbildungen menschlicher Blutgefäße, die dann mit menschlichen ECs kultiviert wurden, die anschließend ihre Innenwände auskleideten. Darüber hinaus replizierten die Modelle, wenn sie einem Perfusionssystem unterzogen wurden, das einen physiologischen Fluss erzeugt, die physiologischen Bedingungen genau. Das Perfusionssystem wurde entwickelt, um Flüssigkeiten mit einer konstanten Durchflussrate zu perfusionieren, wobei eine Peristaltikpumpe sowohl in geschlossenen als auch in offenen Kreisläufen verwendet wird (Abbildung 1). Das System kann als geschlossener Kreislauf verwendet werden, um die Partikelablagerung und das Targeting auf die Zellen abzubilden, die innerhalb des Carotismodells ausgesät sind. Darüber hinaus kann es als offener Kreislauf verwendet werden, um nicht haftende Partikel am Ende der Experimente auszuwaschen und das System zu reinigen und zu warten. Dieser Artikel stellt Protokolle für die Herstellung von 3D-Modellen der menschlichen Carotisverzweigung, das Design des Perfusionssystems und die Abbildung der Ablagerung von Zielpartikeln innerhalb der Modelle vor.

<table><tbody><tr><td>3D-Drucker</td><td>FormLabs</td><td>PKG-F2-REFURB</td><td></td></tr><tr><td>Aceton, absolut (AR-Qualität)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Steckverbinder</td><td>Nordson Medical</td><td>FTLL013-1</td><td>Luer-Buchse</td></tr><tr><td></td><td></td><td>FTLL230-1</td><td>Luer-Buchse</td></tr><tr><td></td><td></td><td>FTLL360-1</td><td>Luer-Buchse</td></tr><tr><td></td><td></td><td>LP4-1</td><td>Luer-Buchse Integral Lock</td></tr><tr><td>Dämpfer</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>DS2127-0250</td><td>Nalgene Polycarbonat, Validierung</td></tr><tr><td>Flaschen-Dämpferabdeckung</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>2162-0531</td><td>Nalgene Füll-/Entlüftungsverschlüsse</td></tr><tr><td>Elastosil Elastosil RT 601 A</td><td>Wacker</td><td>60003805</td><td></td></tr><tr><td>Elastosil RT 601 B</td><td>Wacker</td><td>60003817</td><td>Der Vernetzer</td></tr><tr><td>Endothelzellmedien</td><td>ScienCell</td><td>1001</td><td></td></tr><tr><td>Fibrontectin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F0895-5mg</td><td></td></tr><tr><td>HUVEC</td><td>Lonza</td><td>CC-2519</td><td></td></tr><tr><td>Isopropylalkohol, AR-Klasse 99,5</td><td></td><td></td>%<td>Entfernen Sie den Kunststoffstaub vom geschliffenen Modell</td></tr><tr><td>Lack</td><td>Rost-Oleum</td><td></td><td>2X-Ultra Abdeckung Glanz</td></tr><tr><td>Klar Matlab</td><td>Mathworks</td><td></td><td>https://www.mathworks.com/products/matlab.html</td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Nikon</td><td>SMZ25</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Kamera</td><td>Nikon</td><td>DS-Qi2</td><td></td></tr><tr><td>Schlauchpumpe</td><td>Watson Marlow</td><td>530U IP31</td><td>Mit 2 Pumpenköpfen: 313D</td></tr><tr><td>Kunststoff Rohrschelle</td><td>Quickun</td><td>1-2240-Absperrventil-2 Stück</td><td></td></tr><tr><td>Polystyrol Partikel</td><td>&nbsp; Thermo-Fisher Scientific</td><td>&nbsp; F8827</td><td>&nbsp; Durchmesser = 2 &micro; m</td></tr><tr><td>Drucker Harz</td><td>FormLabs</td><td>RS-F2-GPCL-04</td><td></td></tr><tr><td>Rotator</td><td>ELMI Ltd.</td><td></td><td>Intelli-Mixer RM-2</td></tr><tr><td>Solidworks&nbsp;</td><td>SolidWorks Corp.,&nbsp; Dassault Syst&egrave; mes</td><td></td><td>https://www.solidworks.com/</td></tr> <tr><td>Schlauch</td><td>Watson Marlow</td><td>933.0064.016</td><td>Schlauch für die Pumpe: 6,4 mm ID</td></tr><tr><td colspan="4">Alle anderen Schläuche: Silikonschlauch: 4 mm ID</td></tr></tbody></table>

in vitro 3d-zellkulierte arterielle modelle zur untersuchung des vaskulären wirkstoff-targetings unter flow

In Vitro 3D Cell-Cultured Arterial Models for Studying Vascular Drug Targeting Under Flow

Die Verwendung von dreidimensionalen (3D) Modellen menschlicher Arterien, die mit den richtigen Abmessungen und Anatomie entworfen sind, ermöglicht die korrekte Modellierung verschiedener wichtiger Prozesse im Herz-Kreislauf-System. Obwohl in letzter Zeit mehrere biologische Studien mit solchen 3D-Modellen menschlicher Arterien durchgeführt wurden, wurden sie nicht zur Untersuchung des vaskulären Targetings angewendet. Dieser Artikel stellt eine neue Methode vor, um reale, rekonstruierte menschliche arterielle Modelle mit einer 3D-Drucktechnik herzustellen, sie mit menschlichen Endothelzellen (ECs) auszukleiden und partikelspezifische Ziele unter physiologischem Fluss zu untersuchen. Diese Modelle haben den Vorteil, dass sie die physiologische Größe und den Zustand der Blutgefäße im menschlichen Körper mit kostengünstigen Komponenten replizieren. Diese Technik könnte als neue Plattform für die Untersuchung und das Verständnis von Wirkstoff-Targeting im Herz-Kreislauf-System dienen und das Design neuer injizierbarer Nanomedikamente verbessern. Darüber hinaus kann der vorgestellte Ansatz wichtige Instrumente für die Untersuchung der gezielten Verabreichung verschiedener Wirkstoffe für Herz-Kreislauf-Erkrankungen unter patientenspezifischen Fluss- und physiologischen Bedingungen liefern.

Dieser Artikel stellt ein neues Protokoll vor, um die Ablagerung von Partikeln in realen 3D-Modellen menschlicher Arterien abzubilden, die eine neue Plattform für die Erforschung der Wirkstoffabgabe bieten könnten. Mit Hilfe einer 3D-Drucktechnik wurde ein Modell der menschlichen Karotisverzweigungsarterie hergestellt (Abbildung 2). Das Modell wurde aus Silikonkautschuk gefertigt und mit menschlichen ECs ausgesät (Abbildung 3). Wichtig ist, dass dieses Protokoll...

Hier stellen wir ein neues Protokoll vor, um die gezielte Ablagerung von Wirkstoffträgern an Endothelzellen in fabrizierten, realen, dreidimensionalen menschlichen Arterienmodellen unter physiologischem Fluss zu untersuchen und abzubilden. Die vorgestellte Methode könnte als neue Plattform für die Gezielter von Wirkstoffträgern innerhalb des Gefäßsystems dienen.

In vitro 3D-zellkulierte arterielle Modelle zur Untersuchung des vaskulären Wirkstoff-Targetings unter Flow

The use of three-dimensional (3D) models of human arteries, which are designed with the correct dimensions and anatomy, enables the proper modeling of ...

Das vorliegende Protokoll könnte als neue Plattform für die Untersuchung und Entwicklung von Arzneimittelträgern dienen, um Krankheitsstellen innerhalb des menschlichen Gefäßsystems anzusprechen. Der Hauptvorteil unserer Technik besteht darin, dass sie die Untersuchung der Akkumulation von Arzneimittelträgern innerhalb des vom Menschen replizierten arteriellen 3D-Modells ermöglicht. Dies geschieht unter physiologischen Bedingungen, einschließlich des Blutflusses.Dieser Ansatz kann verwendet werden, um Arzneimittelträger für die Diagnose und Behandlung einer Vielzahl von Gefäßerkrankungen, einschließlich einer atherosklerotischen Arterie, zu optimieren. Beginnen Sie mit der Auswahl von Bildern von Patienten oder zuvor untersuchten Geometrien der Verzweigung der menschlichen Halsschlagader und verwenden Sie die Bilder, um ein computergestütztes Designmodell der Form zu erstellen. Verwenden Sie einen 3D-Drucker, um das Design zu drucken, entfernen Sie die temporären Druckstützen und spülen Sie das Modell mit Aceton, bevor Sie Schleifpapier verwenden, um die Formen zu polieren und zu glätten, insbesondere die Bereiche, aus denen die Stützen geschnitten wurden.Spülen Sie das Modell nach

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Dieses Protokoll repliziert physiologische oder pathologische Blutfluss in vitro zur Bestimmung Zellantwort bei Krankheitspathologien unterstützen. Durch Einführung einer Druckdämpfungskammer stromabwärts von einer Blutpumpe, kann die Blutströmung durch die Vaskulatur rekapituliert und auf einer Monoschicht von Gefäßendothel oder eines Mimetikums Kokultur auferlegt.

In-vitro-Modell von physiologischen und pathologischen Blutfluss mit Anwendung auf Untersuchungen der Gefäßzell Remodeling

Dieses Manuskript stellt ein Spritzgussverfahren microvessels zu entwickeln, die physiologischen Eigenschaften des Endothels rekapitulieren. Die Mikrofluidik-basierten Prozess erstellt Patent 3D Gefäßnetze mit tailor Bedingungen, wie Durchfluss, zelluläre Zusammensetzung, Geometrie und biochemische Steigungen. Das Herstellungsverfahren und Beispiele für mögliche Anwendungen beschrieben.

Mikrostrukturierung und Montage von 3D-Micro-Ader

Wir beschreiben ein mikrochirurgisches Ansatz zur Erzeugung eines arteriovenösen (AV) loop als Modell Vaskularisierung in vivo in einem isolierten und gut charakterisierten Umgebung zur Analyse. Dieses Modell ist nicht nur nützlich für die Untersuchung der Angiogenese, ist aber auch für den Maschinenbau axial vaskularisiert und transplantierbaren Geweben optimal geeignet.

Die arteriovenöse (AV) Loop in einem Kleintiermodell zur Untersuchung Angiogenesis und Vaskularisierte Tissue Engineering

Das Protokoll beschreibt, wie ein perfusable Kreislauf Netzwerk in ein Sphäroid zu konstruieren. Das Sphäroid umliegenden Mikroumgebung ist entworfen, um induzieren Angiogenese und der Sphäroid an die Mikrokanäle in einem mikrofluidischen Gerät anschließen. Die Methode erlaubt die Perfusion der Sphäroid, das eine lang ersehnte Technik in dreidimensionale Kulturen ist.

Perfusable vaskuläre Netzwerk mit einem Gewebe-Modell in einem mikrofluidischen Gerät

Endotheliale Vorläufer, die aus induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC-EPs) gewonnen werden, haben das Potenzial, Herz-Kreislauf-Behandlungen zu revolutionieren und die Schaffung von originalgetreueren Herz-Kreislauf-Erkrankungen zu ermöglichen. Dabei werden die Verkapselung von iPSC-EPs in dreidimensionalen (3D) Kollagen-Mikroumgebungen und eine quantitative Analyse des vaskulogenen Potenzials dieser Zellen beschrieben.

Ein In-Vitro-3D-Modell und eine Computational Pipeline zur Quantifizierung des vaskulogenen Potenzials von iPSC-derived endotheliaalen Vorläufern

Diese Methode beschreibt die Kultur von iPSC-abgeleiteten Endothelzellen als 40 durchfundierte 3D-Mikrogefäße in einer standardisierten mikrofluidischen Plattform. Diese Plattform ermöglicht die Untersuchung von gradientengetriebenen angiogenen Keimen in 3D, einschließlich Anastomose und Stabilisierung der angiogenen Sprossen in einer skalierbaren und hochdurchsatzigen Weise.

Standardisierter und skalierbarer Assay zur Untersuchung perfused 3D Angiogenic Sprouting of iPSC-derived Endothelial Cells In Vitro

Das dreidimensionale Co-Kultur-Sphäroid-Angiogenese-Assay-System wurde entwickelt, um die physiologische Angiogenese nachzuahmen. Co-Kultur-Sphäroide werden von zwei menschlichen Gefäßzellvorläufern, EFCCs und MSCs, gebildet und in Kollagengel eingebettet. Das neue System ist wirksam für die Bewertung angiogener Modulatoren und liefert relevantere Informationen für die in vivo-Studie.

Dreidimensionales Angiogenese-Assay-System mit Co-Culture-Spheroiden, die von endotheliaalen Koloniebildenden Zellen und mesenchymalen Stammzellen gebildet werden

Dieser Assay verwendet embryonale Stammzellen der Maus, die in Embryoidkörperchen differenziert sind, die in 3D-Kollagengel kultiviert werden, um die biologischen Prozesse zu analysieren, die die Keimangiogenese in vitro steuern. Die Technik kann zum Testen von Medikamenten, zur Modellierung von Krankheiten und zur Untersuchung spezifischer Gene im Zusammenhang mit embryonal tödlichen Deletionen eingesetzt werden.

In vitro Dreidimensionaler Keimtest der Angiogenese unter Verwendung embryonaler Stammzellen der Maus für die Modellierung von Gefäßerkrankungen und Arzneimitteltests

Hier wird ein einfacher Arbeitsablauf zur Unterscheidung von Endothelzellen von humanen pluripotenten Stammzellen beschrieben, gefolgt von einem detaillierten Protokoll für ihre mechanische Stimulation. Dies ermöglicht die Untersuchung der Entwicklungsmechanobiologie von Endothelzellen. Dieser Ansatz ist kompatibel mit nachgeschalteten Assays von lebenden Zellen, die nach mechanischer Stimulation aus dem Kulturchip entnommen wurden.

In vitro On-Chip-Modell eines fötalen menschlichen Gefäßes zur Untersuchung der Entwicklungsmechanobiologie

In dieser Arbeit stellen wir eine Technik zur schnellen Herstellung von lebendem Gefäßgewebe durch direkte Kultivierung von Kollagen, glatten Muskelzellen und Endothelzellen vor. Darüber hinaus wird ein neues Protokoll zur mechanischen Charakterisierung von künstlich hergestellten Gefäßgeweben beschrieben.

Engineering 3D cellularized Kollagengele für Gefäßgeweberegeneration

Erfahren Sie die Herstellung 3D-zellulierter arterieller Modelle mit Endothelzellen und deren Einsatz zur Untersuchung von Wirkstoff-Targeting unter physiologischem Fluss. Diese Methode ermöglicht die Optimierung von Arzneiträgern für kardiovaskuläre Erkrankungen.

In vitro 3D-zellkulierte arterielle Modelle zur Untersuchung des vaskulären Wirkstoff-Targetings unter Flow

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