Name: Herstellung von humanen CRISPR-engineered CAR-T Zellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-15T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 33 s
Description: Erfahren Sie die Herstellung von CRISPR-engineered CAR-T-Zellen für Immuntherapie und Krebsforschung. Diese Methode ermöglicht effizientes multiplexes Gen-Editing und klinische Translation.

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Wir erkennen den Human Immunology Core für die Bereitstellung normaler Spender-T-Zellen und den Flow Cytometry Core an der University of Pennsylvania an.

Menschliche T-Zellen wurden über den Human Immunology Core der University of Pennsylvania beschafft, der nach den Prinzipien der Guten Laborpraxis mit etablierten Standardbetriebsverfahren und / oder Protokollen für den Probeneingang, die Verarbeitung, das Einfrieren und die Analyse gemäß den Ethikrichtlinien von MIATA und der University of Pennsylvania arbeitet.
1. Lentivirale Vektorproduktion
HINWEIS: Die viralen Produkte wurden durch Trennung von Verpackungskonstrukten (Rev, Gag/Pol/RRE, VSVg und Transferplasmid) in vier separate Plasmide replikationsdefekt gemacht, wodurch die Wahrscheinlichkeit von Rekombinationsereignissen, die zu replikationskompetenten Viren führen können, erheblich reduziert wird.
<ol><li>Bereiten Sie HEK293T-Zellen einen Tag vor der Transfektion vor. Platte ca. 6 x 106 Zellen in T150-Kulturgefäßen in 30 ml Standardkulturmedien (bezeichnet als R10:RPMI 1640 ergänzt mit 10% fetalem Kälberserum, 10 mM HEPES, 1% Pen/Strep, 1% L-Glutamin) und über Nacht bei 37 °C inkubieren. 18-24 h später sollten die Zellen zu 60-70% konfluent sein und gesund aussehen (dendritische Projektionen und gleichmäßige Verteilung über den Kolben). Wenn die Zellen gesund aussehen, fahren Sie mit Schritt 1.2 fort.</li>
	<li>Bereiten Sie die Transfektionsmischung vor, die Lipofektionsreagenz (96 μL), pTRP gag/pol (Lot# RR13SEP19A) (18 μg), pTRP RSV-Rev (Lot# RR13SEP19B-3) (18 μg), pTRP VSVG (Lot# RR13SEP19C) (7 μg) Verpackungsplasmide und 15 μg Expressionsplasmid (CD19bbz scFv geklont in pTRPE) enthält.<ol>
<li>Bereiten Sie für jede Transfektionsreaktion ein Röhrchen mit 1 ml minimalen essentiellen Medien mit reduziertem Serum plus den vier in Schritt 1.2 beschriebenen Plasmiden sowie ein Röhrchen mit 2 ml minimalen essentiellen Medien mit reduziertem Serum plus 90 μL Lipofektionsreagenz vor. Kombinieren Sie diese beiden Lösungen durch tropfenweise Zugabe der 1-ml-Plasmidmischung zu der 2-ml-Lipofektionsreagenzmischung. Achten Sie darauf, die Lösung kräftig zu mischen, indem Sie mehrmals auf und ab pipettieren. Inkubieren Sie die Lösung für 15 min bei Raumtemperatur.</li>
		<li>In der Zwischenzeit die Medien aus dem Zellkolben HEK293T absaugen und die Zellen vorsichtig mit 10 ml serumreduzierten minimalen essentiellen Medien waschen und erneut absaugen.</li>
		<li>Die Transfektionsmischung (3 ml) aus Schritt 1.2.1 wird vorsichtig mit einer 5 mL serologischen Pipette in die untere Ecke des Zellkulturkolbens geben. Kippen Sie den Kolben vorsichtig, um die Transfektionsmischung gleichmäßig über den Zellkulturkolben zu verteilen, und inkubieren Sie ihn für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Achten Sie darauf, die Zellmonoschicht nicht zu stören. Nach einer 10-minütigen Inkubation 35 ml R10-Medien hinzufügen und den Kolben für 24 h in den Inkubator zurückgeben.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Nach 24 h den Überstand aus den ZELLKULTURkolben HEK293T sammeln und in 50 mL konische Röhrchen überführen. Geben Sie frisches R10 zu den HEK29T-Zellen und legen Sie die Zellen für weitere 24 Stunden in den Inkubator zurück. Drehen Sie den Überstand (300 x g) herunter, um Zelltrümmer zu entfernen, und filtern Sie den Überstand durch einen 0,45 μm-Filter.</li>
	<li>Konzentrieren Sie das Filtrat aus Schritt 1.3 durch Hochgeschwindigkeits-Ultrazentrifugation (25.000 x g für 2,5 h oder 8000 x g über Nacht (O/N)). Lagern Sie das 24-Stunden-Viruspellet bei 4 °C, während Sie das 48-Stunden-Virus bündeln.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 1.3-1.4 für die 48-Stunden-Sammlung, und kombinieren Sie 24-Stunden- und 48-Stunden-Virensammlungen. Pellets aus der 48-Stunden-Sammlung enthalten eine kombinierte Ernte des Lentivirus.</li>
	<li>Virales Pellet in ca. 1 ml kaltem R10 und aliquot in 100 μL Fläschchen resuspendieren. Sofort die Aliquoten mit Trockeneis einfrieren und bei -80 °C lagern.</li>
	<li>Berechnen Sie den funktionellen Viraltiter in Transduktionseinheiten/ml, indem Sie eine feste Menge an CD3/CD28-Perlen-aktivierten primären menschlichen T-Zellen mit seriellen Verdünnungen des lentiviralen Überstands transduzieren. Messung der CAR-Transduktion nach 72 h mittels Durchflusszytometrie.<ol>
<li>Färbung für das CD19-gerichtete CAR mit einem Anti-FCM63 scFv-Antikörper. Für andere chimäre Antigenrezeptoren, Färbung mit Fluorophor-markierten rekombinanten Protein, das spezifisch für das CAR scFv ist. Die Virusverdünnung, die durch Durchflusszytometrie unter 20% CAR-positive Zellen erzeugt, ist die genaueste Verdünnung, um den Viraltiter zu berechnen. Über 20% CAR-positive Zellen erhöht sich die Wahrscheinlichkeit, dass jede positive Zelle zweimal transduiert wird, was zu einer Unterschätzung der Anzahl der transduzierenden Partikel führt. Berechnen Sie die Wandlereinheiten pro ml (TU/ml) = (Anzahl der transduzierten Zellen x Prozent CAR-positive Zellen x Verdünnungsfaktor)/(Transduktionsvolumen in ml).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Design von sgRNAs und Genstörungen in primären menschlichen T-Zellen
<ol><li>Entwerfen von CRISPR sgRNA's HINWEIS: Mehrere Server und Programme erleichtern das Design von zielspezifischen sgRNs. In diesem Protokoll wurden CRISPR sgRNAs mit CHOPCHOP (https://chopchop.cbu.uib.no) und dem gRNA-Designportal des Broad Institute (https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design) entwickelt.<ol>
<li>Entwerfen Sie für jedes Zielgen sechs bis zehn sgRNA-Sequenzen, um auf frühe kodierende Exonsequenzen abzuzielen. HINWEIS: sgRNA sollte eine hohe On-Target-Wirksamkeit und eine niedrige Off-Off-Target-Wirksamkeit aufweisen. Jeder Machine-Learning-Algorithmus zur Bestimmung der sgRNA-Wirksamkeit funktioniert etwas anders. Daher wird empfohlen, mehrere sgRNA-Design-Tools zu vergleichen und eine Liste von sechs bis zehn sgRNA für das Screening zu kuratieren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Genstörung in primären menschlichen T-Zellen<ol>
<li>Erhalten Sie autologe periphere mononukleäre Blutzellen (PBMC) von gesunden freiwilligen Spendern. Eine schematische Zeitleiste des Protokolls wird in Abbildung 2A beschrieben und unten beschrieben.</li>
		<li>Isolieren Sie CD4+ und CD8+ T-Zellen mit handelsüblichen CD4- und CD8-Auswahlkits.</li>
		<li>Kombinieren Sie CD4+ und CD8+ T-Zellen im Verhältnis 1:1 und inkubieren Sie über Nacht bei 3x106 Zellen/ml in R10, ergänzt mit jeweils 5 ng/ml huIL-7 und huIL-15. Die Zugabe von IL-7 und IL-15 wird empfohlen, da sie bekanntermaßen einen zentralen Gedächtnisphänotyp fördern und CAR-T-Zellen, die mit IL-7 und IL-15 expandiertwurden,eine überlegene Antitumorwirksamkeit im Vergleich zu IL-2 expandierten CAR-T-Zellenhaben 22,23,24.</li>
		<li>Am nächsten Tag zählen T-Zellen und Zentrifuge 5-10 x 106 Zellen bei 300 x g für 5 min. Entsorgen Sie den gesamten Überstand und waschen Sie das Zellpellet in minimalen essentiellen Medien mit reduziertem Serum. Das Pellet wird in 100 μL Nukleofektionslösung gemäß den Anweisungen des Herstellers (Materialtabelle ) wieder verwendet.</li>
		<li>Bereiten Sie beim Waschen der Zellen den Ribonukleoproteinkomplex (RNP) mit Cas9 und gRNA vor, indem Sie 10 μg Cas9-Nuklease mit 5 μg sgRNA für 10 minuten bei Raumtemperatur (RT) inkubieren. Das molare Verhältnis von Cas9 zu sgRNA beträgt 1:2,4. Eine Mock-Kontrolle, die Cas9 und Elektroporationsverstärker, aber keine sgRNA enthält, wird empfohlen. HINWEIS: Die Multiplex-Genbearbeitung kann in diesem Schritt durchgeführt werden, indem RNP-Komplexe für jedes Ziel separat gemacht und mit Zellen zum Zeitpunkt der Nukleofektion kombiniert werden, wie im nächsten Schritt beschrieben. Die Auswahl der Reagenzien für die Montage des RNP-Komplexes ist der Schlüssel zu einer hohen KO-Effizienz. Zum Beispiel haben Cas9-Nukleasen von verschiedenen Anbietern unterschiedliche Off-Target-Effekte und chemisch modifizierte gRNA verringern die Toxizität für T-Zellen, wodurch die KO-Effizienz erhöht wird.</li>
		<li>Kombinieren Sie die resuspendierten Zellen aus Schritt 2.2.4 mit dem RNP-Komplex aus Schritt 2.2.5 und fügen Sie 4,2 μL 4 μM Elektroporationsverstärker (ssDNA-Oligonukleotid, das nicht homolog zum menschlichen Genom ist) hinzu. Gut mischen und in Elektroporationsküvetten überführen. Vermeiden Sie Blasen, da sie die Elektroporationseffizienz beeinträchtigen.</li>
		<li>Elektropulverzellen mit Pulscode EH111. Nach der Elektroporation inkubieren Sie Zellen in R10, ergänzt mit 5 ng/ml huIL-7 und huIL-15 bei 5x106 Zellen/ml bei 30 °C für 48 h in 12-Well-Platten. Fahren Sie nach 48 h mit der Aktivierung und Expansion der T-Zelle fort.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. T-Zell-Aktivierung, lentivirale Transduktion und Expansion
HINWEIS: Für das Screening von sgRNs ist eine lentivirale Transduktion (Schritt 3.2) des CAR-Konstrukts nicht erforderlich.
<ol><li>Zählen Sie elektroporierte T-Zellen und verdünnen Sie sie auf eine Konzentration von 1 x10 6 Zellen/ml mit warmem R10, ergänzt mit 5 ng/ml huIL-7 und huIL-15. Aktivieren Sie die Zellen durch Zugabe von monoklonalen anti-CD3/anti-CD28-Antikörper-beschichteten magnetischen Perlen im Verhältnis von 3 Perlen pro lebender T-Zelle. HINWEIS: Elektroporation verursacht einen signifikanten Zelltod, was zu etwa 60% ± 15% lebensfähigen Zellen im Vergleich zu nicht elektroporierten Zellen führt. Verwenden Sie eine Anzahl lebender / toter Zellen, um die geeignete Menge an Perlen zu bestimmen. Die Zellen auf 37 °C umstellen und über Nacht inkubieren.</li>
	<li>Nach der Stimulation über Nacht transduzieren Sie CRISPR-manipulierte T-Zellen mit lentiviralem Überstand aus Schritt 1. Fügen Sie das geeignete Volumen basierend auf dem in Schritt 1.7 berechneten Viraltiter hinzu, um eine Multiplizität der Infektion (MOI) von 3 zu erreichen, und inkubieren Sie die Zellen für 72 h bei 37 °C. HINWEIS: Das in R10 resuspendierte Viruspellet wird einfach auf die Zellen auf die Zellen aufgesetzt, je nach Zellkonzentration, Virustiter und gewünschtem MOI.</li>
	<li>Nach 72 h die Zellen mit 50% des aktuellen Kulturvolumens R10 mit 10 ng/ml huIL-7 und huIL-15 füttern und für weitere 48 h in den Inkubator zurückbringen. Stören Sie nicht die Cluster, die sich zwischen den T-Zellen und den Perlen gebildet haben.</li>
	<li>Nach 48 h entfernen Sie die Perlen aus den Zellen, indem Sie die Zell-Perlen-Mischung vorsichtig bürsten, gefolgt von einer magnetischen Trennung. Zählen Sie die Zellen nach der Perlenentfernung und bringen Sie sie mit R10, ergänzt mit 5 ng/ml huIL-7 und huIL-15 auf eine Konzentration von 0,8 x 106 Zellen/ml. Nach dem Abperlen sollten die Zellzahlen der Zellzahl an Tag 1 vor der Elektroporation ähnlich sein (Abbildung 2B).</li>
	<li>Nach 24 h die Zellen zählen und auf eine Konzentration von 1 x 106 Zellen/ml mit R10 + 5 ng/ml huIL-7 und huIL-15 geben. Wiederholen Sie dies alle 24 Stunden, bis die Wachstumskinetik und die Zellgröße zeigen, dass die Zellen von der Stimulation ausgeruht sind. HINWEIS: Ab diesem Zeitpunkt verdoppeln sich die T-Zellen etwa alle 24 Stunden. T-Zellen durchlaufen in der Regel 5-7 Populationsverdopplungen und haben ein Zellvolumen von etwa 300 ± 50 fL, wenn sie ausgeruht sind.</li>
	<li>Nach dem Ausruhen die CRISPR-entwickelten CAR-T-Zellen herunterfahren und in Gefriermedien (1:1 X-Vivo und FBS plus 10% DMSO) für die Kryokonservierung wieder aufwirbeln. Die verwendeten CAR-T-Zellen sollten aufgetaut und vor einem Experiment 16 Stunden lang bei 37 °C ruhen. HINWEIS: Halten Sie ca. 10x106 Zellen für die Messung der Aussparungseffizienz und der CAR-Integration reserviert. Erwartete Bevölkerungsverdopplungen und Volumenänderungen während der Expansion sind in Abbildung 2B,2C dargestellt. Darüber hinaus zeigt Abbildung 2D das Niveau der CAR-Expression sowohl auf Mock- als auch auf geneditierten CAR-T-Zellen.</li>
</ol>4. CRISPR-Effizienz
<ol><li>Genomische DNA-Extraktion und Zielgenamplifikation<ol>
<li>Von jeder Screening-Kultur 3-5 x 106 T-Zellen herunterspinnen. Zellen können entweder als trockenes Pellet eingefroren werden oder man kann mit der genomischen DNA-Extraktion fortfahren. Zum Zeitpunkt der DNA-Extraktion pellets in 200 μL Phosphatpuffersalzlösung (PBS) resuspendieren und genomische DNA aus elektropulverbeschämten Zellen mit einem Standard-DNA-Extraktionskit gemäß der Herstelleranweisung extrahieren.<ol>
<li>Kurz gesagt, lysieren Sie Zellen mit Proteinase K und laden Lysat auf eine DNA-Bindungssäule. Während der Zentrifugation bindet DNA an die Membran, während Verunreinigungen durchgehen. Nach zwei Waschschritten, um verbleibende Verunreinigungen und Enzyminhibitoren zu entfernen, eluieren Sie DNA in Wasser.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Amplifizieren Sie 200-300 ng genomische DNA mit Standard-PCR-Mischung, die DNA-Polymerase, akzessodem Proteine, Salze und dNTPs sowie 10 μM Vorwärts- und Rückwärtsprimer enthält, die den Bereich des beabsichtigten Doppelstrangbruchs flankieren. HINWEIS: Für das PCR-Primer-Design wird die Referenzgenomsequenz (die mit http://www.ensemble.org gefunden werden kann), die die gRNA-Schnittstelle flankiert, in das NCBI-Primer-Blast-Tool (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast) eingegeben. PCR-Primer sollten so ausgelegt sein, dass das Amplicon eine Zielgröße von 600-700bp hat. Diese Länge ermöglicht es, Sequenzierungsprimer zu entwerfen, die innerhalb des Amplicons mit ausreichendem Abstand von der gRNA-Schnittstelle (mindestens 150 bp) binden, um eine gute Sequenzierungsqualität um die Cas9-induzierten Indels zu gewährleisten (siehe 4.2.1). Jede gRNA benötigt ein einzigartiges Primerpaar, es sei denn, die gRNA-Schnittstellen befinden sich in unmittelbarer Nähe.</li>
		<li>Führen Sie das gesamte PCR-Produkt auf einem 1% igen Agarosegel aus und reinigen Sie das Amplicon mit einem Standard-Agarosegel-Reinigungskit. HINWEIS: Der Prozess der Bestimmung des optimalen Tm für PCR kann mehrere Runden der Fehlerbehebung in Anspruch nehmen. Dies liegt daran, dass die KO-Sequenz Indels hat und das Zielgen für die Sequenzierung vorbereitet werden sollte, bei der es normalerweise 100 bp vor oder nach der Schnittstelle keine Indels geben würde. Dies kann aufgrund von Indels, die aus nicht-homologen Endfügen resultieren, stark variieren. Das Entwerfen von verschachtelten Sequenzierungsprimern zu den PCR-Primern und die Erhöhung der Konzentration des sequenzierten Produkts kann Probleme mit der Sequenzierung beseitigen.</li>
	</ol></li>
	<li>Sequenzierung und Indel-Erkennung<ol>
<li>Entwerfen Sie Sequenzierungsprimer, die an das gelgereinigte Amplicon binden und Mock- und Knockout-Amplicons für die Sanger-Sequenzierung senden. Sobald die Sequenzierung abgeschlossen ist, laden Sie die Trace-Dateien zur TIDE-Analyse in die Desktop Genetics-Software (tide.deskgen.com, Desktop Genetics) hoch.<ol>
<li>Geben Sie für die Sequenzierung des Primerdesigns die Sequenz des PCR-Amplicons in eine Standard-Primer-Design-Software (NCBI, Eurofins oder andere öffentlich verfügbare Tools) ein. Die Design-Software schlägt mehrere Primer-Sequenzen vor, die für die Sanger-Sequenzierung geeignet sind.</li>
			<li>Wählen Sie Vorwärts- und Rückwärtsprimer, die innerhalb des Amplicons mindestens 150 bp vor oder nach der gRNA-Schnittstelle binden, um eine gute Sequenzierungsqualität um die Indels zu gewährleisten. Das Sequenzierungschromatogramm wird in 4.2 für die TIDE-Analyse verwendet, daher ist es wichtig, dass die Sequenzierungsqualität für eine genaue Indelzersetzung gut ist (siehe Hultquist et al.) ( 25) DER PRÄSIDENT. - Nach der 25</li>
		</ol>
</li>
		<li>Verwenden Sie die TIDE-Analyse (Tracking of Indels by DEcomposition), um die Knock-out-Effizienz (KO) auf genomischer Ebene26zu erkennen. Der Algorithmus rekonstruiert genau das Spektrum der Indels aus den Sequenzspuren und berechnetR2-Werte, die die Passgenauigkeit nach nicht-negativer linearer Modellierung durch die TIDE-Software widerspiegeln.</li>
	</ol></li>
	<li>Zielprotein-Nachweis<ol>
<li>Für Zielgene, deren Genprodukt auf der Oberfläche von T-Zellen exprimiert wird, färben Sie etwa 1 x10 5 Zellen aus jeder Screening-Kultur mit einem fluorochrom-markierten Antikörper, der für das Zielprotein spezifisch ist. Vergleichen Sie die Expressionsniveaus des Zielproteins zwischen der Simuliertkontroll- und der Knockout-Gruppe mittels Durchflusszytometrie, wie in Abbildung 3A,3Bdargestellt.</li>
		<li>Für Zielgene, deren Genprodukt intrazellulär exprimiert wird, lysieren Sie etwa 3 x 106 Millionen Zellen pro Screening-Gruppe in Lysepuffer und folgen Standardprotokollen für SDS-PAGE und Western Blotting. Alternativ kann die Oberflächen- oder intrazelluläre Durchflusszytometrie verwendet werden, um nach dem Zielprotein zu suchen.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Überwachung von Off-Target-Effekten mit iGUIDE - Bibliotheksvorbereitung, DNA-Sequenzierung und Analyse
HINWEIS: Die iGUIDE-Technik ermöglicht den Nachweis von Stellen der Cas9-geführten Spaltung und die Quantifizierung der Verteilungen dieser DNA-Doppelstrangbrüche.
<ol><li>Führen Sie iGUIDE wie von Nobles et al.21beschrieben durch. Die Off-Target-Effekte von sgRNA, die auf den TRAC-Locus mit der iGUIDE-Technik abzielen, wurden in Stadtmauer et al,202013gezeigt.</li>
</ol>

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<li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor+T+%28CAR-T%29+cells+expanded+with+IL-7%2FIL-15+mediate+superior+antitumor+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+%26+Cell%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor T (CAR-T) cells expanded with IL-7/IL-15 mediate superior antitumor effects.</a> Protein & Cell. 10 (10), 764-769 (2019).</li>
<li>Hultquist, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9+genome+engineering+of+primary+CD4%2B+T+cells+for+the+interrogation+of+HIV-host+factor+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9 genome engineering of primary CD4+ T cells for the interrogation of HIV-host factor interactions.</a> Nature Protocols. 14 (1), 1-27 (2019).</li>
<li>Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Easy+quantitative+assessment+of+genome+editing+by+sequence+trace+decomposition%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition.</a> Nucleic Acids Research. 42 (22), 168(2014).</li>
</ol>

Die Autoren haben keine Angaben.

Hier beschreiben wir Ansätze zur Genbearbeitung von CAR-T-Zellen mit crispR Cas9-Technologie und zur Herstellung von Produkten, um die Funktion und Wirksamkeit weiter zu testen. Das obige Protokoll wurde für die Durchführung von CRIPSR-Gen-Editing in primären menschlichen T-Zellen in Kombination mit engineering T-Zellen mit chimären Antigenrezeptoren optimiert. Dieses Protokoll ermöglicht eine hohe Knockout-Effizienz bei minimaler Variabilität von Spender zu Spender. Die Modifikation mit CRISPR kann sowohl die Wirksamkei...

Die chimäre Antigenrezeptor (CAR)-T-Zelltherapie hat das Gebiet der adoptiven Zelltherapien und der Krebsimmuntherapie revolutioniert. CAR-T-Zellen sind technisch hergestellte T-Zellen, die einen synthetischen Immunrezeptor exprimieren, der ein antigenspezifisches einkettiges Antikörperfragment mit Signaldomänen aus der TCRzeta-Kette und kostimulatorischen Domänenkombiniert,die für die T-Zellaktivierung und Co-Stimulation notwendig und ausreichend sind1,2,3,4 . Die Herstellung von CAR-T-Zellen beginnt mit der Extraktion der patienteneigenen T-Zellen, gefolgt von der ex vivo viralen Transduktion des CAR-Moduls und der Erweiterung des CAR-T-Zellprodukts mit magnetischen Perlen, die als künstliche Antigen-präsentierende Zellen fungieren5. Expandierte CAR-T-Zellen werden erneut in den Patienten infundiert, wo sie transplantieren, Zieltumorzellen eliminieren und sogar mehrere Jahre nach der Infusion bestehen können6,7,8. Obwohl die CAR-T-Zelltherapie zu bemerkenswerten Ansprechraten bei malignen B-Zell-Erkrankungen geführt hat, wurde der klinische Erfolg bei soliden Tumoren durch mehrere Faktoren in Frage gestellt, darunter eine schlechte T-Zell-Infiltration9, eine immunsuppressive Tumormikroumgebung10, Antigenabdeckung und -spezifität sowie CAR-T-Zelldysfunktion11,12 . Eine weitere Einschränkung der aktuellen CAR-T-Zelltherapie ist die Verwendung autologer T-Zellen. Nach mehreren Chemotherapierunden und hoher Tumorbelastung können CAR-T-Zellen im Vergleich zu allogenen CAR-T-Produkten von gesunden Spendern von schlechter Qualität sein, zusätzlich zu dem Zeit- und Kostenaufwand, der mit der Herstellung autologer CAR-T-Zellen verbunden ist. Die Gen-Editierung des CAR-T-Zellprodukts durch CRISPR/Cas9 stellt eine neue Strategie dar, um die derzeitigen Einschränkungen der CAR-T-Zellen zu überwinden13,14,15,16,17.
CRISPR/Cas9 ist ein Zweikomponentensystem, das für die gezielte Genombearbeitung in Säugetierzellen eingesetzt werden kann18,19. Die CRISPR-assoziierte Endonuklease Cas9 kann ortsspezifische Doppelstrangbrüche induzieren, die von kleinen RNAs durch Basenpaarung mit der Ziel-DNA-Sequenz20geleitet werden. In Ermangelung einer Reparaturschablone werden Doppelstrangbrüche durch den fehleranfälligen nichthomologen End joining (NHEJ) -Weg repariert, was zu Frameshift-Mutationen oder vorzeitigen Stop-Codons durch Insertions- und Deletionsmutationen (INDELs) führt19,20,21. Effizienz, Benutzerfreundlichkeit, Kosteneffizienz und die Fähigkeit zur Multiplex-Genom-Editierung machen CRISPR/Cas9 zu einem leistungsstarken Werkzeug, um die Wirksamkeit und Sicherheit autologer und allogener CAR-T-Zellen zu verbessern. Dieser Ansatz kann auch verwendet werden, um TCR-gerichtete T-Zellen zu bearbeiten, indem das CAR-Konstrukt durch ein TCR ersetzt wird. Darüber hinaus können allogene CAR-T-Zellen, die ein begrenztes Potenzial haben, eine Graft-versus-Host-Krankheit zu verursachen, auch durch Gen-Editing des TCR-, b2m- und HLA-Locus erzeugt werden.
In diesem Protokoll zeigen wir, wie CRISPR-Engineering von T-Zellen mit viraler vektorvermittelter Abgabe des CAR-Transgens kombiniert werden kann, um genomeditierte CAR-T-Zellprodukte mit erhöhter Wirksamkeit und Sicherheit zu erzeugen. Ein schematisches Diagramm des gesamten Prozesses ist in Abbildung 1 dargestellt. Mit diesem Ansatz haben wir einen hocheffizienten Gen-Knockout in primären menschlichen CAR-T-Zellen nachgewiesen. Abbildung 2A beschreibt detailliert den Zeitplan der einzelnen Schritte zum Bearbeiten und Herstellen von T-Zellen. Strategien für das RNA-Design und die Knockout-Validierung werden ebenfalls diskutiert, um diesen Ansatz auf verschiedene Zielgene anzuwenden.

<table><tbody><tr><td>4D-Nukleofaktor Core Unit</td><td>Lonza</td><td>AAF-1002B</td><td></td></tr><tr><td>4D-Nucleofactor X-Unit</td><td>Lonza</td><td>AAF-1002X</td><td></td></tr><tr><td>Accuprime Pfx Supermix</td><td>ThermoFisher</td><td>12344040</td><td></td></tr><tr><td>Beckman Optima XPN Ultrazentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Violet 605 Anti-Human CD3 Antikörper</td><td>Biolegend</td><td>317322</td><td>Klon OKT3</td></tr><tr><td>BV711 Anti-Human-PD1</td><td>Biolegend</td><td></td><td>Klon EH12.2H7</td></tr><tr><td>Cas9-Elektroporationsverstärker</td><td>IDT</td><td>1075915</td><td></td></tr><tr><td>CD3/CD28 Dynabeads</td><td>ThermoFisher</td><td>40203D</td><td></td></tr><tr><td>CD4+ T-Zell-Isolationskit</td><td>StemCell-Technologien</td><td>15062</td><td></td></tr><tr><td>CD8+ T-Zell-Isolationskit</td><td>StemCell-Technologien</td><td>15063</td><td></td></tr><tr><td>Corning 0,45 Mikron Vakuumfilter/Flasche</td><td>Corning</td><td>430768</td><td></td></tr><tr><td>Corning T150 Zellkulturflasche</td><td>Millipore Sigma</td><td>CLS430825</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Millipore Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DNAeasy Blut- und Gewebekit</td><td>Qiagen</td><td>69504</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag Magnet</td><td>ThermoFisher</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax Ergänzung</td><td>ThermoFisher</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>HEK293T Zellen</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>ThermoFisher</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>huIL-15</td><td>PeproTech</td><td>200-15</td><td></td></tr><tr><td>huIL-7</td><td>PeproTech</td><td>200-07</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>ThermoFisher</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>Nucleospin Gel und PCR-Aufreinigung</td><td>Takara</td><td>740609.25</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>ThermoFisher</td><td>31985062</td><td></td></tr><tr><td>P3 Primärzelle 4D-Nukleofaktor X Kit L</td><td>Lonza</td><td>V4XP-3024</td><td></td></tr><tr><td>Penicilin-Streptomycin-Glutamin</td><td>ThermoFisher</td><td>10378016</td><td></td></tr><tr><td>pTRPE-Expression Plasmid</td><td>im Haus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kaninchen Anti-Maus FMC63 scFv Monoklonaler Antikörper, (R19M), PE</td><td>CytoArt</td><td>200105</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640</td><td>ThermoFisher</td><td>12633012</td><td></td></tr><tr><td>sgRNA</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spy Fi Cas9</td><td>Aldevron</td><td>9214</td><td></td></tr><tr><td>Ultrazentrifugenröhrchen</td><td>Beckman Coulter</td><td>326823</td><td></td></tr><tr><td>Viral Packaging Mix</td><td>in house</td><td></td><td></td></tr><tr><td>X-Vivo-15 Media</td><td>Lonza</td><td>BE02-060F</td><td></td></tr></tbody></table>

herstellung von humanen crispr-engineered car-t zellen

Production of Human CRISPR-Engineered CAR-T Cells

Adoptive Zelltherapien mit chimären Antigenrezeptor-T-Zellen (CAR-T-Zellen) haben eine bemerkenswerte klinische Wirksamkeit bei Patienten mit hämatologischen Malignomen gezeigt und werden derzeit auf verschiedene solide Tumoren untersucht. CAR-T-Zellen werden erzeugt, indem T-Zellen aus dem Blut eines Patienten entfernt und so hergestellt werden, dass sie einen synthetischen Immunrezeptor exprimieren, der die T-Zellen umleitet, um Zieltumorzellen zu erkennen und zu eliminieren. Die Geneditierung von CAR-T-Zellen hat das Potenzial, die Sicherheit aktueller CAR-T-Zelltherapien zu verbessern und die Wirksamkeit von CAR-T-Zellen weiter zu erhöhen. Hier beschreiben wir Methoden zur Aktivierung, Expansion und Charakterisierung von humanen CRISPR-engineered CD19 gerichteten CAR-T-Zellen. Dies umfasst die Transduktion des car-lentiviralen Vektors und die Verwendung von Single-Guide-RNA (sgRNA) und Cas9-Endonuklease, um Gene von Interesse in T-Zellen anzusprechen. Die in diesem Protokoll beschriebenen Methoden können universell auf andere CAR-Konstrukte und Zielgene angewendet werden, die über die für diese Studie verwendeten hinausgehen. Darüber hinaus werden in diesem Protokoll Strategien für das gRNA-Design, die Lead-gRNA-Selektion und die Target-Gen-Knockout-Validierung diskutiert, um reproduzierbar ein hocheffizientes Multiplex-CRISPR-Cas9-Engineering von humanen T-Zellen in klinischer Qualität zu erreichen.

Wir beschreiben hier ein Protokoll zur gentechnischen Herstellung von T-Zellen, mit dem sowohl autologe als auch allogene CAR-T-Zellen sowie TCR-umgeleitete T-Zellen erzeugt werden können.
Abbildung 1 enthält eine detaillierte Beschreibung der Phasen, die an der Herstellung von CRISPR-bearbeiteten T-Zellen beteiligt sind. Der Prozess beginnt mit dem Design von sgRNA für das interessierende Gen. Sobald die sgRNA entworfen und synthetisiert ist, werden sie verwendet...

Hier stellen wir ein Protokoll für die Genbearbeitung in primären menschlichen T-Zellen vor, das die CRISPR Cas-Technologie verwendet, um CAR-T-Zellen zu modifizieren.

Herstellung von humanen CRISPR-engineered CAR-T Zellen

Adoptive cell therapies using chimeric antigen receptor T cells (CAR-T cells) have demonstrated remarkable clinical efficacy in patients with ...

Unser Laborprotokoll ermöglicht die Kombination von Humangenom-Editing mit CAR-T-Zelltherapie. Das Laborverfahren ist der Ansatz mit CRISPR-Cas9, bis zu drei Gene mit hoher Effizienz anzusprechen. Und schließlich kann unser Ansatz in klinische Studien am Menschen übersetzt werden.Die beschriebenen Methoden können auf andere CAR-Konstrukte und Zielgene angewendet werden. Die Grundlagen der Techniken sind robust genug, um in größerem Maßstab und an akademische und industriell tätige Mitarbeiter für die weitere Entwicklung übersetzt zu werden. Wenn Sie dieses Protokoll zum ersten Mal versuchen, begrenzen Sie die Anzahl der Gruppen im Guide-RNA-Bildschirm, um genaue Inkubationszeiten zu ermöglichen.Die Einhaltung der Kulturbedingungen und der beschriebenen Aussaatdichte haben sich nach unserer Erfahrung als entscheidend erwiesen. Zunächst erhalten Sie autologe periphere mononukleäre Blutzellen (PBMCs) von gesunden freiwilligen Spendern und isolieren CD4- und CD8-positive T-Zellen mit handelsüblichen CD4- und CD8-Selektionskits. Kombinieren Sie CD4-positive und CD8-positive T-Zellen in einem Verhältnis von eins zu eins und inkubieren Sie 3 Millionen Zellen pro Milliliter in R10, ergänzt mit 5 Nanogramm pro Milliliter jedes menschlichen IL7 und menschlichen IL15 über Nacht bei 37 Grad Celsius.Am nächsten Tag zählen Sie die T-Zellen und zentrifugieren 5 bis 10 Millionen Zellen bei 300 mal G für fünf Minuten. Entsorgen Sie alle Überstände und waschen Sie das Zellpellet in reduzierten seruminsen minimalen essentiellen Medien. Suspendieren Sie das Pellet in 100 Mikrolitern nuklearer Zuneigungslösung gemäß den Anweisungen des Herstellers.Bereiten Sie beim Waschen der Zellen ein Ribonukleoprotein oder RNP-Komplex vor, indem Sie 10 Mikrogramm Cas9-Nuklease mit 5 Mikrogramm Einzelleiter-RNA für 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Fügen Sie eine Simuliertkontrolle ohne Einzelleiter-RNA ein. Kombinieren Sie die re-suspendierten Zellen mit dem RNP-Komplex und fügen Sie 4,2 Mikroliter von vier mikromolaren Elektroporationsverstärkern hinzu.Gut mischen und in Elektroporationsküvetten überführen. Elektroporate der Zellen mit dem Pulscode EH111, dann inkubieren Sie 5 Millionen Zellen pro Milliliter in R10, ergänzt mit 5 Nanogramm pro Milliliter menschlichem IL7 und menschlichem IL15 bei 30 Grad Celsius für 48 Stunden in 12 Wellplatten. Fahren Sie nach der Inkubation mit der T-Zellaktivierung und -expansion fort.Entwerfen Sie die Sequenzierungsprimer, indem Sie die Sequenz des PCR-Amplicons in eine Standard-Primer-Design-Software eingeben. Die Design-Software schlägt mehrere Primersequenzen vor, die für die Sanger-Sequenzierung geeignet sind. Wählen Sie Vorwärts- und Rückwärtsprimer, die mindestens 150 Basenpaare vor oder nach der gRNA-Schnittstelle mit dem Amplicon binden, um eine gute Sequenzierungsqualität um die Indels zu gewährleisten.Verwenden Sie die TIDE-Analyse, um die Knockout-Effizienz auf genomischer Ebene zu erkennen. Der Algorithmus rekonstruiert genau das Spektrum der Indels aus den Sequenzspuren und berechnet R-Quadratwerte. Nach der Aktivierung werden T-Zellen in Kultur expandiert und für zukünftige Studien kryokonserviert.Während der Erweiterung werden die Verdopplung der Population und Volumenänderungen im gesamten Protokoll sowohl für Mock- als auch für bearbeitete CAR-T-Zellen verfolgt. Während der Expansion wurden keine signifikanten Veränderungen in der Proliferation und Aktivierung festgestellt. Sobald die Zellen kryokonserviert waren, wurden die Konzentrationen der CAR-Expression für weitere funktionelle Studien sowohl für die simulierten bearbeiteten als auch für die Knockout-CAR-T-Zellen bestimmt.Es wurden keine signifikanten Veränderungen beobachtet. Die Knockout-Effizienz kann mit mehreren Techniken bestimmt werden. In diesen repräsentativen Durchflusszytometrie-Diagrammen wurden die PDCD1- und TRAC-Loci mit Single-Guide-RNA anvisiert, was eine Effizienz von 90% für die PDCD1-Single-Guide-RNA und 98% für die TRAC-Single-Guide-RNA über mehrere gesunde Spender zeigte.Es ist wichtig sicherzustellen, dass die molaren Verhältnisse von Cas9 und Führungs-RNAs genau sind. Während des Eingriffs sollten die Zellen immer bei vier Grad Celsius gehalten und nicht über längere Zeit in der Elektroporationslösung belassen werden. Nach der CAR-Konservierung können die CRISPR-entwickelten CAR-T-Zellen für in-vitro- und in-vivo-funktionelle Assays wie Zytotoxizitätstests, Zytokinproduktion und syngenetische oder Xenograph-Tumormausmodelle verwendet werden.Unser Ansatz mit crispR Cas9-Technologie wird nun auch auf klinische Studien angewendet. Der Ansatz kann sowohl bei Krebs als auch bei nicht-malignen genetischen Störungen wie Hämoglobinophatien eingesetzt werden, von denen Millionen von Kindern und Erwachsenen weltweit betroffen sind.

production-of-human-crispr-engineered-car-t-cells

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Das Video beschreibt einen Prozess zur Herstellung genetisch veränderter CAR-T-Zellen durch das CRISPR-Cas9-System. Die Infektion von T-Zellen mit CRISPR- und CAR-Lentiviren führt zu Veränderungen des Zielgens und zur Synthese eines chimären Antigenrezeptors (CAR), was schließlich zur Bildung genetisch veränderter CAR-T-Zellen führt.

Genetisch veränderte CAR-T-Zellen mit einem CRISPR-Cas9-System

Dieses Video zeigt einen Assay zur Durchführung von Gen-Editierung in menschlichen T-Zellen mit der CRISPR-Cas9-Technologie. Eine Mischung aus primären CD4+- und CD8+-T-Zellen wird mit einem CRISPR-Cas9-Ribonukleoprotein-Komplex kombiniert, der auf spezifische Gene für den Knockout abzielt. Bei der Elektroporation leitet die sgRNA Cas9 zur Ziel-DNA-Sequenz und erzeugt so präzise Schnitte. Diese Schnitte werden dann durch den nicht-homologen Endverbindungsmechanismus der Zelle repariert, was zu...

Eine CRISPR-Cas9-Technik zur Gen-Editierung in T-Zellen

Dieses Video demonstriert eine Technik zur Erzeugung antigenspezifischer chimärer Antigenrezeptor (CAR) T-Zellen durch retrovirale Transduktion. Aktivierte murine CD8+ T-Zellen werden in eine Mikrotiterplatte gegeben, die mit rekombinanten Fibronektinfragmenten beschichtet ist. Retrovirale Vektoren, die transgene RNA enthalten, die für einen antigenspezifischen chimären Antigenrezeptor (CAR) kodieren, werden dann eingeführt, und die Platte wird zentrifugiert, um die Transduktion zu erleichtern.

Eine Technik zur Erzeugung antigenspezifischer CAR-T-Zellen

T-Zellen, die einen CD19-spezifischen, chimären Antigen-Rezeptor (CAR) als Entwicklung für die Behandlung von B-Zell-Malignomen im First-in-human Gentherapieprüfungen infundiert. Wir beschreiben genetische Modifikation von T-Zellen mit Hilfe...

Klinische Anwendung der<em&gt; Dornröschen</em&gt; Und künstliche Antigen präsentierenden Zellen genetisch zu verändern T Zellen aus dem peripheren und Nabelschnurblut

Die lymphodepletiven und immunmodulatorischen Effekte von Chemotherapie und Bestrahlungsstandard können genutzt werden, um die Antitumorwirksamkeit der T-Zell-Immuntherapie zu verbessern. Wir skizzieren eine Methode zur Erzeugung von EGFRvIII-spezifischen chimären Antigenrezeptor (CAR) T-Zellen und deren Verabreichung im Rahmen der Glioblastom-Standardtherapie.

Generierung von CAR T-Zellen für die adoptive Therapie im Kontext von Glioblastoma Standardtherapie

Hier stellen wir ein Protokoll zur genetischen Bearbeitung von CAR-T-Zellen über ein CRISPR/Cas9-System vor.

Verwenden von CRISPR/Cas9 zum Knock Out von GM-CSF in CAR-T-Zellen

Dieses Protokoll rationalisiert die retrovirale Vektorproduktion und die murine T-Zelltransduktion und erleichtert die effiziente Generierung von CAR-T-Zellen der Maus.

Effiziente Generierung von murinen chimären Antigenrezeptor (CAR)-T-Zellen

Dieses Protokoll bietet einen optimierten Arbeitsablauf zur Generierung und zum Testen von humanen chimären Antigenrezeptor-regulatorischen T-Zellen (CAR-Tregs).

Erzeugung humaner chimärer Antigenrezeptor-regulatorischer T-Zellen

Es wird ein detailliertes Protokoll für die Verwendung der CRISPR/Cas9-Technologie zur Erzielung eines hocheffizienten gezielten Knock-ins von großen, multicistronischen Konstrukten in primären humanen T-Zellen über den Homologie-vermittelten Endverbindungsweg (HMEJ) zur Verfügung gestellt. T-Zellen, die mit diesem cGMP-adaptierbaren Protokoll hergestellt wurden, behalten eine hervorragende Zellexpansion, Zytotoxizität und Zytokinproduktion bei.

Nicht-virales Engineering von primären humanen T-Zellen durch Homologie-vermittelte Endverknüpfung und gezielte Integration großer DNA-Templates

Dieses Protokoll beschreibt die wesentlichen Schritte zur Kultivierung primärer T-Zellen, einschließlich ihrer Isolierung, Aktivierung, Expansion und transienten Transfektion durch mRNA-Elektroporation. Zusätzlich werden ein Workflow und ein Antikörperpanel für die Durchflusszytometrie von Phänotyp, Aktivierungsmarkern, Viabilität und der Expression des chimerischen Antigenrezeptors (CAR) vorgeschlagen.

Isolierung, Kultivierung und vorübergehende Transfektion primärer menschlicher T-Zellen zur Bildung von chimerischen Antigenrezeptoren (CAR) T-Zellen

Erfahren Sie die Herstellung von CRISPR-engineered CAR-T-Zellen für Immuntherapie und Krebsforschung. Diese Methode ermöglicht effizientes multiplexes Gen-Editing und klinische Translation.

Herstellung von humanen CRISPR-engineered CAR-T Zellen

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