Name: Neutronenspin-Echospektroskopie als einzigartige Sonde für Lipidmembrandynamik und Membran-Protein-Wechselwirkungen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-27T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 2 s
Description: Lernen Sie Neutronenspin-Echospektroskopie zur Untersuchung von Lipidmembrandynamik und Membran-Protein-Wechselwirkungen. Diese Methode ermöglicht präzise Messungen kollektiver Membranfluktuationen.

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R. Ashkar dankt M. Nagao, L.-R. Stingaciu und P. Zolnierczuk für viele nützliche Diskussionen und für ihre häufige Unterstützung bei NSE-Experimenten auf ihren jeweiligen Beamlines. Die Autoren erkennen den Einsatz von Neutronenspin-Echospektrometern am NIST und ORNL an. Das NSE-Spektrometer am NIST wird vom Center for High Resolution Neutron Scattering unterstützt, einer Partnerschaft zwischen dem National Institute of Standards and Technology und der National Science Foundation unter der Vereinbarung Nr. DMR-1508249. Das NSE-Spektrometer an der Spallations-Neutronenquelle des ORNL wird von der Scientific User Facilities Division, Office of Basic Energy Sciences, US Department of Energy, unterstützt. Das Oak Ridge National Laboratory wird von UT-Battelle, LLC unter der US DOE Contract No. DE-AC05-00OR22725.

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte und haben nichts offenzulegen.

NSE ist eine leistungsstarke und einzigartige Technik zur Messung der mesoskopischen Dynamik von Lipidmembranen unter verschiedenen Bedingungen. Die effektive Nutzung von NSE hängt von der Probenqualität, dem Neutronenkontrast und dem Bereich der zugänglichen Dynamik ab, die für eine bestimmte Probe untersucht werden kann. Daher sind mehrere kritische Schritte erforderlich, um erfolgreiche NSE-Experimente durchzuführen und qualitativ hochwertige Daten zu sammeln. Ein wichtiger Schritt, um die effektive Nutzung der Neutro...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/t/62396">Neutron Spin Echo Spectroscopy as a Unique Probe for Lipid Membrane Dynamics and Membrane-Protein Interactions</a>. The Introduction, Protocol, and Representative Results sections have been updated.
In the Introduction, the fith pargraph was updated from:
Besides direct access to the length and time scale of membrane dynamics, NSE has the inherent capabilities of neutron isotope sensitivity52. Specifically, the ability of neutrons to interact differently with the isotopes of hydrogen, the most abundant element in biological systems, results in a different neutron scattering length density,34 or NSLD (the equivalent of the optical index of refraction50), when protium is substituted by deuterium. This enables an approach known as contrast variation, which is commonly used to highlight specific membrane features or conceal others — the latter scenario is referred to as contrast matching. A frequent application of contrast variation/matching is the substitution of water (NSLD = -0.56 × 10-6 Å-2) by heavy water or D2O (NSLD = 6.4 × 10-6 Å-2) to amplify the neutron signal from protiated lipid membranes (NSLD ~ 2 × 10-6 Å-2). This approach is highly effective in studies of membrane structure because the penetration of D2O into the headgroup region of the membrane allows accurate determination of the membrane thicknesses (see Figure 2A, left panel) and of the location of different lipid subgroups when more sophisticated models are applied53,54. This paper highlights some examples on the use of contrast variation for studies of collective dynamics in biomimetic membranes and select membrane features.
to:
Besides direct access to the length and time scale of membrane dynamics, NSE has the inherent capabilities of neutron isotope sensitivity52. Specifically, the ability of neutrons to interact differently with the isotopes of hydrogen, the most abundant element in biological systems, results in a different neutron scattering length density,34 or NSLD (the equivalent of the optical index of refraction50), when protium is substituted by deuterium. This enables an approach known as contrast variation, which is commonly used to highlight specific membrane features or conceal others — the latter scenario is referred to as contrast matching. A frequent application of contrast variation/matching is the substitution of water (NSLD = -0.56 × 10-6 Å-2) by heavy water or D2O (NSLD = 6.4 × 10-6 Å-2) to amplify the neutron signal from protiated lipid membranes (NSLD ~ 0 × 10-6 Å-2). This approach is highly effective in studies of membrane structure because the penetration of D2O into the headgroup region of the membrane allows accurate determination of the membrane thicknesses (see Figure 2A, left panel) and of the location of different lipid subgroups when more sophisticated models are applied53,54. This paper highlights some examples on the use of contrast variation for studies of collective dynamics in biomimetic membranes and select membrane features.
In the Protocol, step 1.1 was updated from:
For bending fluctuation measurements, make fully protiated liposomes in D2O (D 99.9%) or D2O-buffer (e.g., phosphate buffer prepared with D2O instead of H2O). Use fully protiated DMPC (C36H72NO8P) and DSPC (C44H88NO8P) with <img alt="Static equilibrium equation, formula involving mass calculation, relevant to educational research." src="/files/ftp_upload/62396/62396eq01v2.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Equation 1"> 133.4 mg, where XDMPC and XDSPC are the mole fractions of DMPC and DSPC, here set to 0.7 and 0.3, respectively, and MwDMPC and MwDSPC are the molar weights given by 677.9 g/mol and 790.1 g/mol, respectively. Similarly, mDSPC = 66.6 mg. This deuteration scheme increases the scattering contrast between the membrane (NSLD ~ 2 × 10-6 Å-2) and the deuterated buffer (NSLD ~ 6.4 × 10-6 Å-2) and amplifies the signal from membrane undulations (see Figure 2A left panel).
to:
For bending fluctuation measurements, make fully protiated liposomes in D2O (D 99.9%) or D2O-buffer (e.g., phosphate buffer prepared with D2O instead of H2O). Use fully protiated DMPC (C36H72NO8P) and DSPC (C44H88NO8P) with <img alt="Static equilibrium equation, formula involving mass calculation, relevant to educational research." src="/files/ftp_upload/62396/62396eq01v2.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Equation 1"> 133.4 mg, where XDMPC and XDSPC are the mole fractions of DMPC and DSPC, here set to 0.7 and 0.3, respectively, and MwDMPC and MwDSPC are the molar weights given by 677.9 g/mol and 790.1 g/mol, respectively. Similarly, mDSPC = 66.6 mg. This deuteration scheme increases the scattering contrast between the membrane (NSLD ~ 0 × 10-6 Å-2) and the deuterated buffer (NSLD ~ 6.4 × 10-6 Å-2) and amplifies the signal from membrane undulations (see Figure 2A left panel).
In the Representative Results, the fist pagargaph was updted from:
NSE studies accessing bending fluctuations are typically performed over a Q-range of ~ (0.04 - 0.2) Å-1. This Q-range corresponds to intermediate length scales between the membrane thickness and the liposomal radius, where bending dynamics dominate. Measurement over an extended Q-range can give access to additional dynamic modes, including liposomal diffusion and intramembrane dynamics. For more details on the cross-over in membrane dynamics accessed by NSE, check these relevant publications25,71. It is important to emphasize that NSE signals are proportional to: <img alt="Coherent scattering equation I_coh(Q,t) - 1/3 I_inc(Q,t) for neutron scattering analysis." src="/files/ftp_upload/62396/62396eq05v2.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Equation 5">, where Icoh and Iinc are, respectively, the coherent and incoherent scattering intensity from the sample. Therefore, it is advisable to prepare NSE liposomal samples in deuterated buffers (i.e., buffers prepared with D2O instead of H2O) to minimize the incoherent scattering signal, mainly contributed by the hydrogen content of the sample. However, in some cases intermediate deuteration schemes (i.e., using mixtures of D2O and H2O) might be necessary to obtain optimal contrast conditions. Typically, NSE measurements of membrane bending fluctuations are performed on fully protiated liposomes in deuterated buffer, referred to as fully contrasted liposomes in Figure 5. This deuteration scheme results in a large NSLD difference between the membrane core (~2 × 10-6 Å-2) and its deuterated fluid environment (~6.4 × 10-6 Å-2), which significantly enhances the scattering signal from the liposomal membranes and improves the measurement statistics of bending dynamics. This contrast scheme (Figure 2A left panel) is frequently utilized in studies of bending rigidity of lipid membranes with single38,72 and multiple39,66 lipid components and in studies of membrane softening/stiffening by biological inclusions (e.g., cholesterol, drug molecules, peptides/proteins)36,37,73,74,75, and synthetic additives (e.g., nanoparticles)76,77.
to:
NSE studies accessing bending fluctuations are typically performed over a Q-range of ~ (0.04 - 0.2) Å-1. This Q-range corresponds to intermediate length scales between the membrane thickness and the liposomal radius, where bending dynamics dominate. Measurement over an extended Q-range can give access to additional dynamic modes, including liposomal diffusion and intramembrane dynamics. For more details on the cross-over in membrane dynamics accessed by NSE, check these relevant publications25,71. It is important to emphasize that NSE signals are proportional to: <img alt="Coherent scattering equation I_coh(Q,t) - 1/3 I_inc(Q,t) for neutron scattering analysis." src="/files/ftp_upload/62396/62396eq05v2.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Equation 5">, where Icoh and Iinc are, respectively, the coherent and incoherent scattering intensity from the sample. Therefore, it is advisable to prepare NSE liposomal samples in deuterated buffers (i.e., buffers prepared with D2O instead of H2O) to minimize the incoherent scattering signal, mainly contributed by the hydrogen content of the sample. However, in some cases intermediate deuteration schemes (i.e., using mixtures of D2O and H2O) might be necessary to obtain optimal contrast conditions. Typically, NSE measurements of membrane bending fluctuations are performed on fully protiated liposomes in deuterated buffer, referred to as fully contrasted liposomes in Figure 5. This deuteration scheme results in a large NSLD difference between the membrane core (~0 × 10-6 Å-2) and its deuterated fluid environment (~6.4 × 10-6 Å-2), which significantly enhances the scattering signal from the liposomal membranes and improves the measurement statistics of bending dynamics. This contrast scheme (Figure 2A left panel) is frequently utilized in studies of bending rigidity of lipid membranes with single38,72 and multiple39,66 lipid components and in studies of membrane softening/stiffening by biological inclusions (e.g., cholesterol, drug molecules, peptides/proteins)36,37,73,74,75, and synthetic additives (e.g., nanoparticles)76,77.
In the Representative Reults, Figure 2 was updated from:
<img alt="Lipid bilayer structures; neutron scattering analysis; molecular arrangement diagram; lipid vesicles." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62396/62396fig2v4.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Figure 2"> 
Figure 2: Examples of possible deuteration schemes in NSE experiments on lipid membranes. (A) Left: Fully contrasted membranes, e.g., protiated membranes in deuterated buffer, showing the NSLD profile along the normal to the membrane surface. The difference in the NSLD between the headgroup (~2 × 10-2 Å-2) and tail region (~4.5 × 10-6 Å-2) of the membrane is due to the headgroup hydration with deuterated buffer. Right: Tail-contrast matched membranes such that the hydrocarbon tail region of the membrane has the same NSLD as the buffer, as shown in the corresponding NSLD profile along the membrane normal. (B) Domain-forming membranes with two neutron contrast schemes where the domains (center) or the matrix (left) are contrast-matched to the buffer, enabling selective studies of matrix or domain dynamics, respectively. This figure has been modified from Nickels et al., JACS 201541. (C) Asymmetric membranes prepared by cyclodextrin exchange between protiated and deuterated lipid vesicles, resulting in the deuteration of one membrane leaflet while keeping the other leaflet protiated. This allows studies of the bending dynamics of the protiated leaflet and provides insights into the mechanical coupling between opposing leaflets in asymmetric membranes. This figure has been modified from Rickeard et al., Nanoscale 202040. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62396/62396fig2v4large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
to:
<img alt="Lipid bilayer diagrams with charts, nanostructure spheres, and membrane model in research context." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62396/62396fig2v5.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Figure 2"> 
Figure 2: Examples of possible deuteration schemes in NSE experiments on lipid membranes. (A) Left: Fully contrasted membranes, e.g., protiated membranes in deuterated buffer, showing the NSLD profile along the normal to the membrane surface. The difference in the NSLD between the tail region (~0 × 10-2 Å-2) and headgroup region (~4.5 × 10-6 Å-2) of the membrane is due to the headgroup hydration with deuterated buffer. Right: Tail-contrast matched membranes such that the hydrocarbon tail region of the membrane has the same NSLD as the buffer, as shown in the corresponding NSLD profile along the membrane normal. (B) Domain-forming membranes with two neutron contrast schemes where the domains (center) or the matrix (left) are contrast-matched to the buffer, enabling selective studies of matrix or domain dynamics, respectively. This figure has been modified from Nickels et al., JACS 201541. (C) Asymmetric membranes prepared by cyclodextrin exchange between protiated and deuterated lipid vesicles, resulting in the deuteration of one membrane leaflet while keeping the other leaflet protiated. This allows studies of the bending dynamics of the protiated leaflet and provides insights into the mechanical coupling between opposing leaflets in asymmetric membranes. This figure has been modified from Rickeard et al., Nanoscale 202040. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62396/62396fig2v5large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62396">Neutron Spin Echo Spectroscopy as a Unique Probe for Lipid Membrane Dynamics and Membrane-Protein Interactions</a>. The Introduction, Protocol, and Representative Results sections have been updated.

Erratum: Neutron Spin Echo Spectroscopy as a Unique Probe for Lipid Membrane Dynamics and Membrane-Protein Interactions

Das Verständnis von Zellmembranen und ihrer Funktion hat sich in den letzten Jahrzehnten bemerkenswert weiterentwickelt. Die frühere Sichtweise von Zellmembranen als passive Lipiddoppelschichten, die Zellgrenzen definieren und Membranproteine1 beherbergen, hat sich allmählich in ein dynamisches Modell verwandelt, in dem Lipiddoppelschichten eine wichtige Rolle bei der Regulierung lebenswichtiger biologischer Prozesse spielen, einschließlich zellulärer Signalgebung, molekularer Austausch und Proteinfunktion - um nur einige zu nennen2,3,4,5,6. Diese Erkenntnis, dass Zellmembranen hochdynamisch sind und ständig umgestaltet und molekular umverteilt werden, hat wissenschaftliche Erkundungen jenseits der Gleichgewichtsstrukturen der Membranen7,8,9vorgeben. Dementsprechend wurden mehrere Ansätze entwickelt, um die verschiedenen dynamischen Modi in biologischen und bioinspirierten Lipidmembranen zu untersuchen. Bisher konzentrierte sich die Mehrheit dieser Studien hauptsächlich auf diffusive molekulare Bewegungen10 , 11,12,13 und makroskopische Formfluktuationen14,15,16, die eine signifikante Lücke im Verständnis der mittleren Membrandynamik hinterlassen, d.h. kollektive Fluktuationen von Lipidanordnungen, die aus wenigen 10-100s Lipidmolekülen bestehen. Diese Dynamik tritt über Längenskalen von wenigen zehn bis wenigen 100 Å und über Zeitskalen von Sub-ns bis zu einigen hundert ns auf (siehe Abbildung 1),hier als mesoskopische Skalen bezeichnet. Auf diesen Skalen findet die biologische Schlüsselaktivität auf derMembranebene 17statt. Dazu gehören virale Knospen18, Kanal-Gating19und Membran-Protein-Interaktionen20. Es ist auch wichtig darauf hinzuweisen, dass die Energielandschaft der Membranproteine21,22 zeigt, dass Konformationsänderungen in Proteinen - notwendig für ihre regulatorische Rolle - über die ns-Zeitskalen23 kollektiver Membranfluktuationen stattfinden, was die Bedeutung der mesoskopischen Dynamik in der biologischen Funktion von Zellmembranen und ihren bioinspirierten Analoga weiter unterstreicht20. Dieser Beitrag konzentriert sich auf die beiden primären mesoskopischen dynamischen Modi in Lipidmembranen, nämlich Biegeschwankungen und Dickenschwankungen.
Die größte Herausforderung bei der direkten Untersuchung dieser Fluktuationsmodi ist die Schwierigkeit, gleichzeitig auf ihre räumlichen und zeitlichen Skalen mit Standardspektroskopiemethoden zuzugreifen. Die andere Herausforderung besteht darin, dass direkte Kontakttechniken die gleichen Schwankungen beeinflussen könnten, die sie messen sollen16. Dies wird durch die kompositorische und strukturelle Komplexität der biologischen Membranen24,25nochverschärft,was zu inhomogenen Membranmerkmalen führt, einschließlich der Lipiddomänenbildung26,27,28,29,30 und Membranasymmetrie31,32,33- die selektive Sonden erfordern, um die Dynamik verschiedener Membranmerkmale zu verstehen. Glücklicherweise können diese Herausforderungen mit nicht-invasiven Neutronenspektroskopiemethoden wie Neutronenspinecho (NSE) überwunden werden, die von Natur aus auf die erforderlichen Längen- und Zeitskalen zugreifen und weitere Untersuchungen selektiver Membranmerkmale ermöglichen, ohne ihre physikalisch-chemische Umgebung zu verändern34. Tatsächlich hat sich die NSE-Spektroskopie in den letzten Jahren zu einer einzigartigen und leistungsstarken Sonde der kollektiven Membrandynamik entwickelt35. Ergebnisse aus NSE-Studien an Lipidmembranen haben neue Erkenntnisse über mechanische36,37 und viskoelastische38,39 Eigenschaften von Lipidmembranen geliefert und ein neues Licht auf ihre mögliche Rolle in der biologischen Funktion geworfen40,41.
Die NSE-Spektroskopietechnik basiert auf einem interferometrischen Instrumentendesign, das erstmals von Mezei42vorgeschlagen wurde und eine Reihe von Spin-Flippern und Magnetspulen verwendet, um die Präzession des Neutronenspins zu steuern, während Neutronen das Instrument durchqueren. Das Design beruht auf der magnetischen Spiegelung der Magnetfeldelemente in Bezug auf die Probenposition (Abbildung 1A). Dies bedeutet, dass das Neutron in Abwesenheit eines Energieaustauschs zwischen dem Neutron und der Probe in der ersten und zweiten Hälfte des Instruments die gleiche Anzahl von Spin-Präzessionen in entgegengesetzte Richtungen durchführt (beachten Sie den π-Flipper zwischen den beiden Präzessionsspulen). Infolgedessen bleibt der endgültige Spinzustand des Neutrons relativ zum Ausgangszustand unverändert - ein Phänomen, das als Spin-Echo bezeichnet wird (siehe transparentes Neutron in Abbildung 1A). Wenn das Neutron jedoch energetisch mit der Probe wechselwechselt, verändert der Energieaustausch die Anzahl der Spin-Präzessionen in der zweiten Hälfte des Instruments, was zu einem anderen endgültigen Spin-Zustand führt (siehe Abbildung 1A). Dies wird experimentell als Polarisationsverlust nachgewiesen, wie später in diesem Artikel gezeigt wird. Für weitere Einzelheiten zur NSE-Technik wird der Leser auf die speziellen technischen Papiere42,43,44,45verwiesen.
Hier wird eine vereinfachte Beschreibung präsentiert, um eine grobe Schätzung der Längen- und Zeitskalen zu liefern, die mit NSE zugänglich sind. Die Längenskalen werden durch den Bereich der erreichbaren Wellenvektortransfers bestimmt, Q = 4π sin θ/λ, wobei 2θ der Streuwinkel und λ die Neutronenwellenlänge ist. Man kann sehen, dass Q durch den Wellenlängenbereich und das Ausmaß der Rotation des zweiten Arms des Spektrometers eingestellt wird (siehe Abbildung 1A). Ein typischer Q-Bereichauf NSE-Spektrometern ist ~0,02-2 Å-146,47und bis zu 0,01-4 Å-1 mit den jüngsten Upgrades48,49, entsprechend räumlichen Skalen von ~ 1-600 Å. Auf der anderen Seite wird die zugängliche Zeitskala aus dem gesamten Präzessionswinkel (oder der Phase) berechnet, der vom Neutron innerhalb der magnetischen Präzessionsspulen erfasst wird, und es wird festgestellt, dasses 50: <img alt="Equation 12" src="/files/ftp_upload/62396/62396eq12v5.jpg"> . In diesem Ausdruck ist t die Fourierzeit, definiert als <img alt="Equation 13" src="/files/ftp_upload/62396/62396eq13v2.jpg"> , wobei das <img alt="Equation 50" src="/files/ftp_upload/62396/62396eq50v2.jpg"> Neutronen-Gyromagnet-Verhältnis, <img alt="Equation 51" src="/files/ftp_upload/62396/62396eq51v6.jpg"> die Spulenlänge und <img alt="Equation 52" src="/files/ftp_upload/62396/62396eq52v6.jpg"> die Stärke des Magnetfeldes der Spule ist. Es ist erwähnenswert, dass die Fourierzeit eine Größe ist, die streng von der Instrumentengeometrie, der Magnetfeldstärke und der Neutronenwellenlänge abhängt. Zum Beispiel wird die Fourierzeit unter Verwendung von Neutronen mit einer Wellenlänge <img alt="Equation 70" src="/files/ftp_upload/62396/62396eq70v6.jpg"> = 8 Å und Instrumenteneinstellungen von <img alt="Equation 51" src="/files/ftp_upload/62396/62396eq51v6.jpg">   = <img alt="Equation 52" src="/files/ftp_upload/62396/62396eq52v6.jpg"> 1,2 m und = 0,4 T als t ~ 50 ns berechnet. Experimentell wird die Fourierzeit durch Änderung des Stroms in den Präzessionsspulen (d. H. Magnetfeldstärke) oder unter Verwendung verschiedener Neutronenwellenlängen abgestimmt, was zu typischen NSE-Zeitskalen von ~ 1 ps bis 100 ns führt. Jüngste Upgrades bei NSE-Spektrometern haben jedoch den Zugriff auf längere Fourier-Zeiten ermöglicht, bis zu ~ 400 ns auf dem J-NSE-Phoenix-Spektrometer am Heinz Maier-Leibnitz Zentrum51 und dem SNS-NSE-Spektrometer am Oak Ridge National Lab48und bis zu ~ 1.000 ns am IN15 NSE-Spektrometer am Institut Laue-Langevin (ILL)49. 
Neben dem direkten Zugriff auf die Längen- und Zeitskala der Membrandynamik verfügt NSE über die inhärenten Fähigkeiten der Neutronenisotopenempfindlichkeit52. Insbesondere die Fähigkeit von Neutronen, unterschiedlich mit den Isotopen von Wasserstoff, dem am häufigsten vorkommenden Element in biologischen Systemen, zu interagieren, führt zu einer anderen Neutronenstreulängendichte,34 oder NSLD (das Äquivalent des optischen Brechungsindex50),wenn Protium durch Deuterium ersetzt wird. Dies ermöglicht einen Ansatz, der als Kontrastvariation bekannt ist und häufig verwendet wird, um bestimmte Membranmerkmale hervorzuheben oder andere zu verbergen - das letztere Szenario wird als Kontrastabgleich bezeichnet. Eine häufige Anwendung von Kontrastvariation/Matching ist die Substitution von Wasser (NSLD = -0,56 × 10-6 Å-2) durch schweres Wasser oderD2O (NSLD = 6,4 × 10-6 Å-2), um das Neutronensignal von protiierten Lipidmembranen (NSLD ~ 0 × 10-6 Å-2) zu verstärken. Dieser Ansatz ist bei Untersuchungen der Membranstruktur sehr effektiv, da das Eindringen vonD2Oin den Kopfgruppenbereich der Membran eine genaue Bestimmung der Membrandicken (siehe Abbildung 2A, linkes Feld) und der Lage verschiedener Lipiduntergruppen ermöglicht, wenn anspruchsvollere Modelle angewendet werden53,54. Dieser Artikel hebt einige Beispiele für die Verwendung von Kontrastvariationen für Studien der kollektiven Dynamik in biomimetischen Membranen und ausgewählten Membranmerkmalen hervor.
Hier wird die Wirksamkeit von NSE bei der Bereitstellung einzigartiger Einblicke in dynamische und funktionelle Membraneigenschaften anhand konkreter Beispiele von NSE-Studien zu Modell- und biologisch relevanten Lipidmembransystemen mit Schwerpunkt auf mesoskaliger Dynamik in freistehenden Membranen in Form von liposomalen Suspensionen veranschaulicht. Für NSE-Messungen der In-Plane-Membrandynamik wird der Leser auf spezielle Publikationen zur Grazing-Incidence-Neutronen-Spin-Echo-Spektroskopie (GINSES)55,56 und andere Studien von ausgerichteten multilamellaren Membranstapeln57,58,59,60verwiesen.
Der Einfachheit halber hebt dieser Artikel drei verschiedene Schemata der Membrandeuteration hervor, die auf einem gut untersuchten domänenbildenden oder phasenabtrennenden Lipiddoppelschichtsystem aus 1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DMPC) und 1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DSPC) -Mischungen61,62dargestellt werden. Die beiden Lipide zeichnen sich durch eine Diskrepanz in ihrer Kohlenwasserstoffkettenlänge (14 Kohlenstoffe / Schwanz in DMPC vs. 18 Kohlenstoffe / Schwanz in DSPC) und ihrer Gel-Fluid-Übergangstemperatur (Tm, DMPC = 23 ° C vs Tm, DSPC = 55 ° C) aus. Dies führt zu einer lateralen Phasentrennung in DMPC:DSPC-Membranen bei Temperaturen zwischen der oberen und unteren Übergangstemperatur des Gemisches63. Die hier betrachteten Deuterationsschemata werden ausgewählt, um die verschiedenen dynamischen Modi zu demonstrieren, die bei NSE-Messungen auf liposomalen Membranen verfügbar sind, nämlich Biegefluktuationen, Dickenschwankungen und selektive Biege-/Dickenschwankungen von lateralen Domänen. Alle Lipidzusammensetzungen werden für DMPC:DSPC-Doppelschichten berichtet, die mit einem Molanteil von 70:30 unter Verwendung handelsüblich erhältlicher protiated und perdeuterated Varianten von DMPC und DSPC hergestellt wurden. Alle Probenvorbereitungsschritte basieren auf 4 ml liposomaler Suspension inD2O mit einer Lipidkonzentration von 50 mg/ml für eine Gesamtlipidmasse von Mtot = 200 mg pro Probe.

<table><tbody><tr><td>Chloroform (Biotech-Qualität)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>496189</td><td>Biotech.-Qualität, &ge; 99,8%, enthält 0,5-1,0% Ethanol als Stabilisator</td></tr><tr><td>Umlaufwasserbad</td><td>Julabo</td><td>SE-12</td><td>Heizungsumwälzpumpe mit intelligenter Pumpe, programmierbaren Temperatureinstellungen und externem Sensoranschluss zur Messung und Steuerung</td></tr><tr><td>Deuteriumoxid</td><td>Cambridge Isotopes Laboratories</td><td>DLM-4</td><td>Deuteriertes Wasser; Schweres Wasser (D2O) (D, 99,9 %)</td></tr><tr><td>Digitale Halbmikrowaage</td><td>Mettler Toledo</td><td>MS105</td><td>Semi-Mikrowaage mit 120 g Fassungsvermögen, 0,01 mg Ablesbarkeit, hochauflösender Wägezelle, ergonomischen Türen und Pipettenkontrollanwendung</td></tr><tr><td>Ethanol (molekularbiologisch</td>)<td>Sigma Aldrich</td><td>E7023</td><td>200 proof Ethanol für molekularbiologische Anwendungen</td></tr><tr><td>Glaspipetten</td><td>VWR</td><td>36360-536</td><td>Einweg-Kalknatronglas Pasteurpipetten</td></tr><tr><td>Glasfläschchen</td><td>Thermo Scientific</td><td>B7990-1</td><td>Fläschchen aus Borosilikatglas mit PTFE/Silikon-Septumkappen</td></tr><tr><td>Gefrierschrank in Laborqualität Fisher</td><td>Scientific</td><td>IU2886D</td><td>Ultra-Tiefkühlschrank (-86 bis -50 °C) für die Langzeitlagerung von Lipiden und</td></tr><tr><td>Proteinen Lipide (protaitiert oder perdeuteriert)</td><td>Avanti Polare Lipide</td><td>variieren je nach Lipid</td><td>Lipide können bei Avanti in Pulverform oder in einer Chloroformlösung mit den erforderlichen Mengen und Deuterierungsschemata erworben werden.</td></tr><tr><td>Millipore Wasseraufbereiter</td><td>Millipore Sigma</td><td>ZRQSVP3US</td><td>Direct-Q&reg; &nbsp; 3 UV-Wasseraufbereitungssystem, das sowohl reines als auch ultrareines Wasser mit einer eingebauten UV-Lampe liefert, um den Gehalt an organischen Stoffen für biologische&nbsp; Anwendungen</td></tr><tr><td>Mini-Extruder-Set</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610020</td><td>Das Mini-Extruder-Set enthält einen Mini-Extruder, einen Heizblock, 2 GasTight-Spritzen und 2 O-Ringe, Polycarbonat-Membranen und Filterhalterungen</td></tr><tr><td>Schnellkupplungen</td><td>Grainger</td><td>2YDA1 und 2YDA7</td><td>Druckknopf-Schlauchverschraubungen für QuickConnect-Wasserzirkulationsanwendungen, z. B. Hochtemperatur-Vesikelextrusion</td></tr><tr><td>Spritzenpumpe</td><td>SyringePump.com</td><td>Neue Era-1000</td><td>Voll programmierbare Spritzenpumpe für Infusion und Entnahme; programmiert bis zu 41 Pumpphasen mit einstellbaren Pumpraten, abgegebenen Volumina und Extrusionszyklen</td></tr><tr><td>Ultraschallbad</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>CPX2800 Temperaturgesteuertes Ultraschallbad mit programmierbarer Funktionalität für Entgasungs- und Ultraschallanwendungen</td></tr><tr><td>Vakuumschrank</td><td>Thermo Scientific</td><td>3608</td><td>0,7 Kubikfuß Vakuumofen mit eingebautem High-Limit-Thermostat schützt vor Überhitzung</td></tr><tr><td>Vortex-Mischer</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-215-414</td><td>Analoge Steuerung mit variabler Geschwindigkeit, die einen Start bei niedrigen Drehzahlen für sanftes Schütteln oder Hochgeschwindigkeitsmischen für ein kräftiges Vortexen der Proben ermöglicht</td></tr></tbody></table>

neutronenspin-echospektroskopie als einzigartige sonde für lipidmembrandynamik und membran-protein-wechselwirkungen

Neutron Spin Echo Spectroscopy as a Unique Probe for Lipid Membrane Dynamics and Membrane-Protein Interactions

Lipiddoppelschichten bilden die Hauptmatrix der Zellmembranen und sind die primäre Plattform für Nährstoffaustausch, Protein-Membran-Interaktionen und virale Knospung, neben anderen lebenswichtigen zellulären Prozessen. Für eine effiziente biologische Aktivität sollten Zellmembranen starr genug sein, um die Integrität der Zelle und ihrer Kompartimente aufrechtzuerhalten, aber flüssig genug, um Membrankomponenten wie Proteine und funktionelle Domänen zu zerstreuen und interagieren zu lassen. Dieses empfindliche Gleichgewicht zwischen elastischen und flüssigen Membraneigenschaften und deren Einfluss auf die biologische Funktion erfordern ein besseres Verständnis der kollektiven Membrandynamik über mesoskopische Längen- und Zeitskalen wichtiger biologischer Prozesse, z. B. Membranverformungen und Proteinbindungsereignisse. Zu den Techniken, die diesen Dynamikbereich effektiv untersuchen können, gehört die Neutronenspinechospektroskopie (NSE). In Kombination mit der Deuterium-Markierung kann NSE verwendet werden, um direkt auf Biege- und Dickenschwankungen sowie auf die mesoskopische Dynamik ausgewählter Membranmerkmale zuzugreifen. Dieses Papier bietet eine kurze Beschreibung der NSE-Technik und beschreibt die Verfahren zur Durchführung von NSE-Experimenten an liposomalen Membranen, einschließlich Details zur Probenvorbereitung und Deuteration von Schemata sowie Anweisungen zur Datenerhebung und -reduktion. Das Papier stellt auch Datenanalysemethoden vor, die verwendet werden, um wichtige Membranparameter wie den Biegesteifigkeitsmodul, den Flächenkompressibilitätsmodul und die Viskosität in der Ebene zu extrahieren. Um die biologische Bedeutung von NSE-Studien zu veranschaulichen, werden ausgewählte Beispiele für Membranphänomene diskutiert, die von NSE untersucht wurden, nämlich die Wirkung von Additiven auf die Membranbiegesteifigkeit, den Einfluss der Domänenbildung auf Membranfluktuationen und die dynamische Signatur von Membran-Protein-Interaktionen.

NSE-Studien, die auf Biegeschwankungen zugreifen, werden typischerweise über einen Q-Bereich von ~ (0,04 - 0,2) Å-1durchgeführt. Dieser Q-Bereich entspricht mittleren Längenskalen zwischen der Membrandicke und dem liposomalen Radius, wobei die Biegedynamik dominiert. Die Messung über einen erweiterten Q-Bereich kann den Zugang zu zusätzlichen dynamischen Modi ermöglichen, einschließlich liposomaler Diffusion und Intramembrandynamik. Weitere Einzelheiten zum Crossover in der Membrandynamik, auf das NSE zugreift...

Dieser Artikel beschreibt die Protokolle für die Probenvorbereitung, Datenreduktion und Datenanalyse in Neutronenspinechostudien (NSE) von Lipidmembranen. Eine umsichtige Deuteriummarkierung von Lipiden ermöglicht den Zugang zu unterschiedlichen Membrandynamiken auf mesoskopischen Längen- und Zeitskalen, über die lebenswichtige biologische Prozesse ablaufen.

Neutronenspin-Echospektroskopie als einzigartige Sonde für Lipidmembrandynamik und Membran-Protein-Wechselwirkungen

Lipid bilayers form the main matrix of cell membranes and are the primary platform for nutrient exchange, protein-membrane&#160;interactions, and viral ...

Dieses Protokoll beschreibt die Probenvorbereitung und Datenreduktion, die für erfolgreiche Neutronenspin-Echo-Studien von kollektiven Membranfluktuationen erforderlich sind, die für biologische Funktionen und praktische Anwendungen von Lipidmembranen relevant sind. NSE greift direkt auf die Membrandynamik auf den Nanosekunden-Zeitskalen wichtiger Membranfunktionen zu, mit dem einzigartigen Vorteil der Isotopenempfindlichkeit für die Untersuchung selektiver Membranmerkmale, die mit anderen Techniken nicht zugänglich sind. Untersuchungen der Membrandynamik auf der Nanoskala sind unerlässlich, um die zugrunde liegenden Membraneigenschaften des molekularen Mechanismus und die Membran-Protein-Interaktionen zu verstehen, die an verschiedenen Zellpathologien beteiligt sind.Die Methode bietet Forschern, die neu bei NSE sind, detaillierte Richtlinien zum Entwerfen, Vorbereiten und Charakterisieren von Lipidvesikeln für erfolgreiche Experimente und die anschließende Datenanalyse und -interpretation. Teshani Kumarage und Julie Nguyen, eine Doktorandin und studentin aus dem Labor, demonstrieren das Verfahren. Bereiten Sie die Lipidsuspension in einer Haube vor, indem Sie genau gewogene Lipide

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieser Artikel beschreibt Methoden zur ortsgerichteten Spinmarkierung und Rekonstitution von pentameren ligandengesteuerten Kanälen für Elektronen-Paramagnetische Resonanzstudien. Dieses Protokoll kann für jedes Membranprotein angepasst werden. Die hier beschriebene Rekonstitutionsmethode kann auch für Patch-Clamp-Messungen von makroskopischen und einkanaligen Strömen in einem definierten Lipidsystem verwendet werden.

Site-Directed Spin Labeling und EPR-spektroskopischen Untersuchungen von pentamerem liganden-gesteuerten Ionenkanäle

Viele Proteine erfüllen ihre Funktion, wenn sie an Membranoberflächen gebunden sind. Die Bindung von extrinsischen Proteinen an Nanodisc-Membranen kann indirekt durch Transmissionselektronenmikroskopie abgebildet werden. Wir zeigen, dass das charakteristische Stapeln (Rouleau) von Nanodiscs, das durch die Negativfärbung Natriumphosphotungat induziert wird, durch die Bindung von extrinsischem Protein verhindert wird.

Verfahren zum Visualisieren und Analysieren Membran interagierender Proteine ​​durch Transmissionselektronenmikroskopie

Dieses Protokoll wird veranschaulicht, wie ein Modell mit niedriger Auflösung ab-initio und Strukturdetails Waschmittel solubilisiert Membranprotein in Lösung mit kleinen Winkel Neutronenstreuung mit Kontrast-matching des Waschmittels zu erhalten.

Kontrast-passende Reinigungsmittel im Small-Angle Neutron Streuexperimente für Membrane Protein strukturelle Analyse und Modellierung von Ab Initio

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um den molekularen Mechanismus der Protonen-Translokation über Lipidmembranen der einzelnen Liposomen, studieren mit Cytochrom Bo3  als Beispiel. Kombination von Elektrochemie und Fluoreszenz-Mikroskopie, pH-Änderungen in das Lumen der einzelne Vesikel, mit einzelnen oder mehreren Enzym können individuell erkannt und analysiert werden.

Einzelne Liposomen Messungen für das Studium der Protonen-Pumpen Membran Enzyme mit Elektrochemie und Fluoreszenz-Mikroskopie

Das vorliegende Protokoll beschreibt Methoden zur Untersuchung der Struktur und Dynamik von zwei Modellproteinen, die eine wichtige Rolle für die menschliche Gesundheit spielen. Die Technik kombiniert die biophysikalische Charakterisierung auf dem Labortisch mit der Neutronen-Spin-Echo-Spektroskopie, um auf die Dynamik auf Zeit- und Längenskalen zuzugreifen, die für Proteininterdomänenbewegungen relevant sind.

Untersuchung der Proteindynamik mittels Neutronen-Spin-Echo-Spektroskopie

Dieses Protokoll stellt die Verwendung einer Probenumgebung mit gestopptem Durchfluss dar, um während einer Neutronenstreumessung mit kleinem Winkel schnell mehrere flüssige Lösungen in situ zu mischen und kinetische Prozesse auf Nanometer-Längenskalen und Zweitzeitskalen zu untersuchen.

Messung der zeitlichen Entwicklung von nanoskaligen Materialien mit gestopptem Fluss und Kleinwinkel-Neutronenstreuung

Dieses Protokoll beschreibt einen iSCAT-basierten Bildverarbeitungs- und Einzelpartikel-Tracking-Ansatz, der die gleichzeitige Untersuchung der Molekülmasse und des diffusiven Verhaltens von Makromolekülen ermöglicht, die mit Lipidmembranen interagieren. Schritt-für-Schritt-Anleitungen für die Probenvorbereitung, die Konvertierung von Masse in Kontrast, die Filmaufnahme und die Nachbearbeitung werden zusammen mit Anweisungen bereitgestellt, um mögliche Fallstricke zu vermeiden.

Massensensitive Partikelverfolgung zur Charakterisierung der membranassoziierten Makromoleküldynamik

Die Neutronenrückstreuspektroskopie bietet einen zerstörungsfreien und markierungsfreien Zugang zur ps-ns-Dynamik von Proteinen und deren Hydratationswasser. Der Workflow wird anhand von zwei Studien zu Amyloid-Proteinen vorgestellt: zur zeitaufgelösten Dynamik von Lysozym während der Aggregation und zur Hydratationswasserdynamik von Tau bei der Faserbildung.

Hochauflösende Neutronenspektroskopie zur Untersuchung der Pikosekunden-Nanosekunden-Dynamik von Proteinen und Hydratationswasser

Dieser Artikel bietet eine detaillierte Beschreibung, wie Proben für die Tracking von Einzelproteinen in festgestützten Lipiddoppelschichten erstellt werden können. Es erklärt außerdem ein einfaches Fluoreszenzmikroskop mit Einzelmolekülempfindlichkeit und hoher Bildrate. Abschließend skizzieren wir das Verfahren zur Extraktion von Einzelprotein-Trajektorien.

Verfolgung einzelner Proteine in Lipid-Doppelschichten mittels Fluoreszenzmikroskopie

Ein experimentelles Protokoll wird vorgestellt, um Gramicidin-A-dotierte Tröpfchen-Interface-Doppelschichten zusammenzusetzen, elektrisch zu stimulieren und zu analysieren. Lipid-Protein-Struktur-Funktion-Beziehungen werden quantifiziert, indem Veränderungen der Membranfläche, des Ionenflusses und der Einkanal-Leitfähigkeit gemessen und diese Reaktionen auf plastizitätsähnliche Veränderungen der ionischen Leitung in einem von elektrischen Synapsen inspirierten Membranmodell in Beziehung gesetzt...

Lipid-Protein-Membranstruktur-Funktions-Charakterisierung mittels Tropfen-Interface-Doppelschichten

Lernen Sie Neutronenspin-Echospektroskopie zur Untersuchung von Lipidmembrandynamik und Membran-Protein-Wechselwirkungen. Diese Methode ermöglicht präzise Messungen kollektiver Membranfluktuationen.

Neutronenspin-Echospektroskopie als einzigartige Sonde für Lipidmembrandynamik und Membran-Protein-Wechselwirkungen

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