Name: Automatisierte Erkennung und Analyse von Exozytose (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-11T14:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 28 s
Description: Erfahren Sie die automatisierte Erkennung und Analyse von Exozytoseereignissen in Zellkulturen mittels TIRF-Mikroskopie und MATLAB-basierter Bildverarbeitung. Diese Methode ermöglicht die Klassifizierung von vier Fusionsmodi und die Bewertung räumlich-zeitlicher Cluster in Neuronen.

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Wir danken Dustin Revell und Reginald Edwards für das Testen von Code und GUI. Die Finanzierung wurde von den National Institutes of Health zur Verfügung gestellt, die diese Forschung unterstützten: einschließlich R01NS112326 (SLG), R35GM135160 (SLG) und F31NS103586 (FLU).

1. Wählen Sie Datensätze und Verzeichnis
<ol><li>Um Datensätze für die Analyse auszuwählen, klicken Sie auf die Schaltfläche Datensätze suchen (Abbildung 2A, rotes Feld 1), um zu dem Ordner zu navigieren, in dem Daten abgelegt werden (z. B. RawData-Ordner). Datendateien füllen die Datendateien automatisch als Liste auf. Der Ordner kann sich über mehr als ein Dataset befinden.</li>
	<li>Klicken Sie auf die Schaltfläche Verzeichnis auswählen und wählen Sie das Verzeichnis (z. B. Test) aus, in dem die analysierten Dateien abgelegt werden sollen (Abbildung 2A, rotes Feld 2). Eine Reihe von Ordnern und fertigen Analysedateien sowie temporäre Zwischenbilder werden in diesem Verzeichnis erstellt, wenn die Schaltfläche Analyse gedrückt wird. Wenn kein Verzeichnis ausgewählt wird, werden Fehler erzeugt.</li>
</ol>2. Pixelgröße und Framerate einstellen
<ol><li>Geben Sie die entsprechende Bildrate und Pixelgröße der Bilder in das entsprechende Feld "Framerate" oder "Pixelgröße" ein (Abbildung 2A, grünes Feld). Wenn keine Werte angegeben werden (sie sind auf die Standardeinstellung "0" gesetzt), durchsucht das Programm die mit der Datei verknüpften Metadaten nach Framerate und Pixelgröße. Wenn diese Werte nicht gefunden werden können, verwendet das Programm standardmäßig pro Pixel für die Messung und pro Bild für Zeitpunkte. HINWEIS: Im angegebenen Beispiel beträgt die Framerate 100 und die Pixelgröße 0,08.</li>
</ol>3. Masken auswählen oder erstellen
<ol><li>Verwenden Sie die Schaltfläche Masken-Maker, um automatisch Zellenmasken für die Daten in der Datei-Dataset-Liste zu erstellen (Abbildung 2A, blaues Feld). Wenn Sie die Schaltfläche Mask Maker verwenden, wird ein neuer Ordner im ausgewählten Verzeichnis mit dem Namen MaskFiles erstellt. Die "Run-Anzeige" wird während des Laufens gelb und kehrt nach Abschluss zu Grün zurück. HINWEIS: Eine Maske für jede Datei in der Liste Datendateien wird aus den ersten 10 Frames der Bilddatei (oder aus allen Frames, wenn sich weniger als 10 in der Bilddatei befinden) erstellt und im Ordner MaskFiles mit dem richtigen Benennungsschema (siehe unten) abgelegt.</li>
	<li>Stellen Sie sicher, dass die Maskendateien automatisch die Liste Maskendateien füllen. Der Benutzer kann direkt mit der Analyse fortfahren. HINWEIS: Überprüfen Sie Maskendateien immer visuell und bestätigen Sie, dass sie den gesamten interessierenden Bereich erfassen. Der erste Frame der Datendatei und die Maskendatei werden auf der Benutzeroberfläche angezeigt, wenn diese Option ausgewählt ist. (Abbildung 2B). Der Mask Maker kann bei geringem Signal-zu-Rauschen Fehler verursachen, daher ist die Validierung der Eignung von Maskendateien für die Qualitätskontrolle von entscheidender Bedeutung.</li>
	<li>Als Alternative zur Verwendung von Mask Maker, wenn das Signal zum Rauschen von Bildern nicht ausreicht, erstellen Sie Masken manuell in ImageJ.<ol>
<li>Öffnen Sie zunächst die RAW-Bilddatei in ImageJ (Abbildung 3A).</li>
		<li>Klicken Sie auf die Schaltfläche Polygonauswahl, und klicken Sie auf , um eine Maske um die Zelle zu zeichnen. Wenn Sie fertig sind, doppelklicken Sie auf den letzten Punkt, um das Polygon zu vervollständigen.</li>
		<li>Wenn Sie fertig sind, navigieren Sie zu bearbeiten | Auswahl | Maske erstellen (Abbildung 3B). Basierend auf der Polygonzeichnung wird eine neue invertierte Maske erstellt. Speichern Sie Masken in einem bestimmten MaskFiles-Ordner im ausgewählten Verzeichnis. Das Benennungsschema der Maskendatei muss mit den entsprechenden einzelnen Datendateien übereinstimmen, gefolgt von "_mask_file". Wenn eine Datendatei beispielsweise den Namen "VAMP2_488_WT_1.tif" hat, muss die entsprechende Maskendatei den Namen "VAMP2_488_WT_1_mask_file.tif" tragen.</li>
		<li>Verwenden Sie die Schaltfläche Maskendateien suchen, um zum ausgewählten Ordner mit hinterlegten benutzerdefinierten Maskendateien zu navigieren. Die Masken füllen die Maskendateien als Liste. HINWEIS: Es ist wichtig, dass Sie für jede Datendatei eine Maske haben, bevor Sie die Analyse ausführen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Analyse und Merkmalsextraktion
<ol><li>Nachdem das Verzeichnis ausgewählt und die Listen Datendateien und Maskendateien aufgefüllt wurden, klicken Sie auf die Schaltfläche Analyse (Abbildung 4A). Wenn die Klassifizierung exozytischer Ereignisse erforderlich ist, fahren Sie mit Schritt 5 fort. HINWEIS: Mit dem Klick auf die Schaltfläche Analyse wird eine Reihe automatisierter Aufgaben ausgeführt, um die Daten zu analysieren. Es werden einzelne Ordner im ausgewählten Verzeichnis erstellt, um die analysierten Daten zu hinterlegen. Während des Betriebs wechselt die "Laufanzeige" von grün nach gelb (Abbildung 4A, rotes Feld). Nachdem die Analyse abgeschlossen ist, ändert sich diese wieder auf Grün.</li>
	<li>Suchen Sie einen DataFiles-Ordner (Abbildung 4B) mit dem vollständigen Satz von Analysedateien (sowie Feature-Extraktionsdateien, die später in der Klassifizierung verwendet werden sollen), die nach jeder Datendatei benannt sind (Abbildung 4C). HINWEIS: Eine Beschreibung dieser Analysedateien finden Sie unten im Abschnitt Repräsentative Ergebnisse.</li>
</ol>5. Klassifizierung exozytischer Ereignisse
<ol><li>Um die gleichzeitige Klassifizierung exozytischer Ereignisse mit automatischer Erkennung durchzuführen, aktivieren Sie das Kontrollkästchen Klassifizierung, bevor Sie auf die Schaltfläche Analyse klicken. Weisen Sie für jedes exozytäre Ereignis für jede Klasse einen Wahrscheinlichkeitswert zwischen 0-1 zu. Ein exozytäres Ereignis gilt als eine der vier Klassen, wenn die Wahrscheinlichkeitsbewertung für diese Klasse > 0,5 beträgt. HINWEIS: Sobald die Analyse abgeschlossen ist, wird ein neuer Datendateiordner im ausgewählten Verzeichnis angezeigt. Der Ordner enthält Analysedateien, die jeder Bilddatei entsprechen.</li>
</ol>6. Raumzeitliche Analyse der Exozytose mit Ripleys K-Werten
<ol></ol>7. RStudio einrichten
<ol><li>Öffnen Sie Rstudio und öffnen Sie ripleys_k_analysis. R-Datei.</li>
	<li>Installieren Sie das Paket "spatstat" in RStudio, indem Sie zu Tools | Installieren Sie Pakete und geben Sie "spatstat" ein, gefolgt von einem Klick auf Installieren. HINWEIS: Dies muss nur einmal pro Rstudio-Installation durchgeführt werden.</li>
	<li>Führen Sie die Bibliothek spatstat zu Beginn jeder Sitzung aus.</li>
	<li>Achten Sie in diesem Fall auf zwei Hauptvariablen: "neuron_mask" und "neuron_datapoints". Neuron Mask verweist auf den Satz von Maskendateien, die ausgeführt werden sollen, d. H. Soma-Maskendateien." HINWEIS: Führen Sie alle Soma-Maskendateien zusammen aus, getrennt von Neurite-Maskendateien und umgekehrt.</li>
	<li>Lesen Sie in der .csv der Maskendateien für jedes der zu analysierenden Neuronen.</li>
	<li>Führen Sie mehrere Dateien gleichzeitig aus, indem Sie zusätzliche neuron_mask_n+1 kopieren. Auf diese Weise kann Ripleys Analyse mithilfe des in Abschnitt 8 beschriebenen Skripts aggregiert werden.</li>
	<li>Überprüfen Sie nun die zweite Variable, "neuron_datapoints".</li>
	<li>Lesen Sie in der." X_fluorescent_traces.csv" Datei, die vom Analyseprogramm generiert wird (von enthält alle extracted_R Datei) mit den x,y,t-Positionen der exozyten Ereignisse sowie die neuritenspezifische Datei der x,y-Positionen für das 2D-Netzwerk. Dies geht in die Position "neuron_datapoints".</li>
	<li>Wählen Sie in RStudio Code | aus | ausführen Führen Sie alle aus. Dadurch werden mehrere Diagramme generiert, darunter die gruppierten Ripley-K-Werte sowie Dichtediagramme.</li>
	<li>Speichern Von Plots unter Exportieren von | Bild speichern unter | Wählen Sie das entsprechende Bildformat und Verzeichnis aus, geben Sie den entsprechenden Dateinamen ein, und klicken Sie dann auf Speichern. HINWEIS: Die Plotfunktion für die Heatmaps wird im Skript mit "plot(density(soma_data,0.4))" aufgerufen. Die Zahl "0,4" steht hier für die Glättung der Dichtefunktion. Es kann geändert werden, um Benutzerdaten auf sinnvolle Weise anzupassen, aber wenn Vergleiche zwischen verschiedenen Heatmaps durchgeführt werden sollen, muss die Anzahl zwischen ihnen gleich sein.</li>
	<li>
Exportieren oder Speichern von Bildern aus Rstudio. Wenn eine Heatmap weiter bearbeitet werden muss, wählen Sie einen geeigneten Dateityp (SVG oder EPS).</li>
</ol>8. Ripleys Analyse
HINWEIS: Die Ripleys_k_analysis. R-Datei generierte auch automatisch Ripleys k-Wert-Plots. Durch das Ausführen des gesamten Skripts werden automatisch die unten genannten Funktionen ausgeführt, aber es ist im Detail enthalten, wenn man jeden Teil des Skripts einzeln ausführen oder Änderungen an der Analyse vornehmen möchte.
<ol><li>Führen Sie zunächst die Hüllkurvenfunktion für jede Zelle aus. Diese Funktion simulierte die vollständige räumliche Zufälligkeit (CSR), um den Ripley-K-Wert des exozyten Ereignispunktmusters zu testen. Data_envelope_1 = Umschlag(soma_data_1, Kest, nsim = 19, savefuns = TRUE) Data_envelope_2 = Umschlag(soma_data_2, Kest, nsim = 19, savefuns = TRUE)</li>
	<li>Als Nächstes bündeln Sie diese Umschläge und erstellen eine Schätzung der CSR für die Gruppe: Pool_csr = pool(Data_envelope_1, Data_envelop_2,...) Führen Sie als Nächstes die Ripley's K-Funktion für alle Datenpunkte aus. Data_ripleys_k_1 = Kest(soma_data_1, Verhältnis = TRUE) Data_ripleys_k_2 = Turm(soma_data_2, Verhältnis = TRUE)</li>
	<li>Wenn Sie fertig sind, bündeln Sie die Ripley's K-Werte und bootstrappen Sie ihre Konfidenzintervalle mit dem folgenden Befehl: Datenpool = Pool(Data_ripleys_k_1, Data_ripleys_k_2,...)</li>
	<li>Bootstrappen mit dem folgenden Befehl: Final_Ripleys_K = varblock(fun = Kest, Data_pool)</li>
	<li>Zeichnen Sie die Daten auf.</li>
	<li>Wenn ein hartstatischer Unterschied erforderlich ist, ist der Studentisierte Permutationstest im spatstat-Paket enthalten, um auf einen Unterschied zwischen Gruppen von Punktmustern zu testen: Test_difference = studpermu.test(all_points_to_test, exocytic_events ~ Gruppe, nperm = np).</li>
</ol>

<ol><li>Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).</li>
<li>Urbina, F. L., Gomez, S. M., Gupton, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+organization+of+exocytosis+emerges+during+neuronal+shape+change%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal organization of exocytosis emerges during neuronal shape change.</a> Journal of Cell Biology. 217 (3), 1113-1128 (2018).</li>
<li>Urbina, F. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRIM67+regulates+exocytic+mode+and+neuronal+morphogenesis+via+SNAP47%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">TRIM67 regulates exocytic mode and neuronal morphogenesis via SNAP47.</a> Cell Reports. 34 (6), 108743(2021).</li>
<li>Alabi, A. A., Tsien, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perspectives+on+kiss-and-run%3A+Role+in+exocytosis%2C+endocytosis%2C+and+neurotransmission%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Perspectives on kiss-and-run: Role in exocytosis, endocytosis, and neurotransmission.</a> Annual Review of Physiology. 75, 393-422 (2013).</li>
<li>Albillos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+exocytotic+event+in+chromaffin+cells+revealed+by+patch+amperometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The exocytotic event in chromaffin cells revealed by patch amperometry.</a> Nature. 389 (6650), 509-512 (1997).</li>
<li>He, L., Wu, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+debate+on+the+kiss-and-run+fusion+at+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The debate on the kiss-and-run fusion at synapses.</a> Trends in Neuroscience. 30 (9), 447-455 (2007).</li>
<li>Elhamdani, A., Azizi, F., Artalejo, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double+patch+clamp+reveals+that+transient+fusion+%28kiss-and-run%29+is+a+major+mechanism+of+secretion+in+calf+adrenal+chromaffin+cells%3A+high+calcium+shifts+the+mechanism+from+kiss-and-run+to+complete+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Double patch clamp reveals that transient fusion (kiss-and-run) is a major mechanism of secretion in calf adrenal chromaffin cells: high calcium shifts the mechanism from kiss-and-run to complete fusion.</a> Journal of Neuroscience. 26 (11), 3030(2006).</li>
<li>Bowser, D. N., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+forms+of+single-vesicle+astrocyte+exocytosis+imaged+with+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Two forms of single-vesicle astrocyte exocytosis imaged with total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (10), 4212-4217 (2007).</li>
<li>Holroyd, P., Lang, T., Wenzel, D., De Camilli, P., Jahn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+direct%2C+dynamin-dependent+recapture+of+fusing+secretory+granules+on+plasma+membrane+lawns+from+PC12+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Imaging direct, dynamin-dependent recapture of fusing secretory granules on plasma membrane lawns from PC12 cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (26), 16806-16811 (2002).</li>
<li>Wang, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+domains+of+synaptotagmin+control+the+choice+between+kiss-and-run+and+full+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Different domains of synaptotagmin control the choice between kiss-and-run and full fusion.</a> Nature. 424 (6951), 943-947 (2003).</li>
<li>Winkle, C. C., Hanlin, C. C., Gupton, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilizing+combined+methodologies+to+define+the+role+of+plasma+membrane+delivery+during+axon+branching+and+neuronal+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Utilizing combined methodologies to define the role of plasma membrane delivery during axon branching and neuronal morphogenesis.</a> Journal of Visualized Experiments. (109), e53743(2016).</li>
<li>Viesselmann, C., Ballweg, J., Lumbard, D., Dent, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleofection+and+primary+culture+of+embryonic+mouse+hippocampal+and+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Nucleofection and primary culture of embryonic mouse hippocampal and cortical neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (47), e2373(2011).</li>
<li>Plooster, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRIM9-dependent+ubiquitination+of+DCC+constrains+kinase+signaling%2C+exocytosis%2C+and+axon+branching%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">TRIM9-dependent ubiquitination of DCC constrains kinase signaling, exocytosis, and axon branching.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (18), 2374-2385 (2017).</li>
<li>Urbina, F. L., Gupton, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNARE-mediated+exocytosis+in+neuronal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">SNARE-mediated exocytosis in neuronal development.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 133(2020).</li>
<li>Ripley, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+second-order+analysis+of+stationary+point+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Probability%22%5BJournal%5D)">The second-order analysis of stationary point processes.</a> Journal of Applied Probability. 13 (2), 255-266 (1976).</li>
<li>Liu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pHmScarlet+is+a+pH-sensitive+red+fluorescent+protein+to+monitor+exocytosis+docking+and+fusion+steps%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">pHmScarlet is a pH-sensitive red fluorescent protein to monitor exocytosis docking and fusion steps.</a> Nature Communication. 12 (1), 1413(2021).</li>
</ol>

Die Autoren erklären nichts zu enthüllen.

Bitte beachten Sie bei der Verwendung der exozytischen Erkennungs- und Analysesoftware, dass das Programm nur verlustfreie Komprimierung .tif Dateien als Eingabe akzeptiert. Die .tif Bilddateien können 8-Bit-, 16-Bit- oder 32-Bit-Graustufenbilder (Einzelkanal) sein. Andere Bildformate müssen vor der Eingabe in einen dieser Typen konvertiert werden. Als Referenz werden hier Beispiele als 16-Bit-Graustufenbilder verwendet.
Im Rahmen des automatisierten Erkennungsprozesses werden die Zeitraffer-B...

VAMP-pHluorin-Konstrukte oder Transferrinrezeptor (TfR)-pHuji-Konstrukte sind ausgezeichnete Marker für exozytäre Ereignisse, da diese pH-sensitiven Fluorophore im sauren Vesikellumen abgeschreckt werden und unmittelbar nach der Fusionsporenöffnung zwischen Vesikel und Plasmamembran fluoreszieren1. Nach der Öffnung der Fusionsporen zerfällt die Fluoreszenz exponentiell, mit einer gewissen Heterogenität, die Informationen über das Fusionsereignis preisgibt. Hier wird eine grafische Benutzeroberfläche (GUI) beschrieben, die exozytäre Ereignisse automatisch erkennt und analysiert. Diese Anwendung ermöglicht es dem Benutzer, exozytäre Ereignisse, die durch pH-empfindliche Marker2 aufgedeckt werden, automatisch zu erkennen und aus jedem Ereignis Merkmale zu generieren, die für Klassifizierungszwecke verwendet werden können3 (Abbildung 1A). Zusätzlich wird die Analyse des exozyttischen Ereignisclusterings mit Ripleys K-Funktion beschrieben.
Die automatisierte Klassifizierung exozytischer Ereignisse in verschiedene exozytäre Modi wurde kürzlich berichtet3. Zwei Modi der Exozytose, die Vollvesikelfusion (FVF) und die Kiss-and-Run-Fusion (KNR) Exozytose, wurden zuvor beschrieben4,5,6,7. Während der FVF erweitert sich die Fusionspore und das Vesikel wird in die Plasmamembran eingebaut. Während des KNR öffnet sich die Fusionspore vorübergehend und verschließt dann4, 5,8,9,10. Vier Modi der Exozytose wurden in sich entwickelnden Neuronen identifiziert, zwei verwandt mit FVF und zwei mit KNR. Diese Arbeit zeigt, dass sowohl FVF als auch KNR weiter unterteilt werden können in Fusionsereignisse, die unmittelbar zum Fluoreszenzzerfall (FVFi und KNRi) nach Fusionsporenöffnung übergehen, oder exozytäre Ereignisse, die eine Verzögerung nach der Fusionsporenöffnung aufweisen, bevor der Fluoreszenzzerfall beginnt (FVFd und KNRd) (Abbildung 1B). Der Klassifikator identifiziert den Modus der Exozytose für jedes Fusionsereignis. Hier wurde diese Analyse in eine GUI integriert, die in MATLAB in Windows- und Mac-basierten Betriebssystemen installiert werden kann. Alle Analysedateien finden Sie unter https://drive.google.com/drive/folders/1VCiO-thMEd4jz-tYEL8I4N1Rf_zjnOgB?usp=sharing oder https://github.com/GuptonLab.

<table><tbody><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td></td><td>https://www.mathworks.com/products/matlab.html</td></tr><tr><td>R</td><td>R Core Team</td><td></td><td>https://www.r-project.org/</td></tr> <tr><td>Rstudio</td><td>Rstudio, PBC</td><td></td><td>https://rstudio.com/</td></tr></tbody></table>

automatisierte erkennung und analyse von exozytose

Automated Detection and Analysis of Exocytosis

Die Zeitraffer-TIRF-Mikroskopie von pH-sensitivem GFP (pHluorin), das an Vesikel-SNARE-Proteine gebunden ist, ist eine effektive Methode, um exozytäre Ereignisse einzelner Vesikel in Zellkulturen sichtbar zu machen. Um eine unvoreingenommene, effiziente Identifizierung und Analyse solcher Ereignisse durchzuführen, wurde ein Computer-Vision-basierter Ansatz entwickelt und in MATLAB implementiert. Die Analysepipeline besteht aus einem Zellsegmentierungs- und exozyttischen Ereignisidentifikationsalgorithmus. Der Computer-Vision-Ansatz umfasst Werkzeuge zur Untersuchung mehrerer Parameter einzelner Ereignisse, einschließlich der Halbwertszeit des Fluoreszenzzerfalls und des Peak-ΔF / F sowie der Ganzzellanalyse der Häufigkeit der Exozytose. Diese und andere Parameter der Fusion werden in einem Klassifikationsansatz verwendet, um verschiedene Fusionsmodi zu unterscheiden. Hier führt eine neu erstellte GUI die Analysepipeline von Anfang bis Ende durch. Eine weitere Anpassung von Ripleys K-Funktion in R Studio wird verwendet, um zwischen geclusterten, dispergierten oder zufälligen Auftreten von Fusionsereignissen in Raum und Zeit zu unterscheiden.

Hier wurde die GUI (Abbildung 2A) verwendet, um exozytäre Ereignisse von drei VAMP2-pHluorin exprimierenden Neuronen bei 3 DIV mittels TIRF-Mikroskopie (Total Internal Reflection Fluorescence) zu analysieren. E15.5 kortikale Neuronen wurden isoliert, gefolgt von einer Transfektion mit VAMP2-pHluorin und einer Beschichtung unter Verwendung der Protokolle, wie in Winkle et al., 2016 und Viesselmann et al., 201111,12beschrieben. Die Met...

Wir haben eine automatisierte Computer-Vision-Software entwickelt, um exozytäre Ereignisse zu erkennen, die durch pH-sensitive Fluoreszenzsonden gekennzeichnet sind. Hier demonstrieren wir die Verwendung einer grafischen Benutzeroberfläche und RStudio, um Fusionsereignisse zu erkennen, räumlich-zeitliche Parameter der Fusion zu analysieren und anzuzeigen und Ereignisse in verschiedene Fusionsmodi zu klassifizieren.

Automatisierte Erkennung und Analyse von Exozytose

Timelapse TIRF microscopy of pH-sensitive GFP (pHluorin) attached to vesicle SNARE proteins is an effective method to visualize single vesicle exocytic ...

Die Software zur automatisierten Erkennung und Analyse von Exozytose ermöglicht es dem Benutzer, exozytäre Ereignisse und TIRF-Bildsequenzen von pH-sensitiven Fluorophoren automatisch zu erkennen. Es gibt auch automatisch Merkmale der Exozytose wie die räumliche Verteilung oder die Frequenz sowie individuelle Eigenschaften exozytischer Ereignisse wie die Halbwertszeit oder die Veränderung der Fluoreszenz über dem Hintergrund aus. Darüber hinaus ist eine Option enthalten, um exozytäre Ereignisse in vier Modi der Exozytose zu klassifizieren, die zuvor in der Literatur beschrieben wurden.Um die Software zur automatisierten Erkennung und Analyse von Exozytose zu verwenden, klicken Sie zuerst auf die Schaltfläche Datensatz suchen, und Sie navigieren zu dem Ort, an dem Ihre Daten abgelegt sind, und Sie sollten in einen Ordner namens Rohdaten gelangen. Ihre Datendateien füllen die Liste hier automatisch aus, und Sie können eine beliebige Anzahl von Datendateien in diesem Ordner haben. Als Nächstes sollten Sie ein Verzeichnis auswählen, für das Ihre Analysedateien abgelegt werden.Hier habe ich ein Verzeichnis namens test ausgewählt. Sie sollten auch die Bildrate Ihrer Bilder sowie die Pixelgröße ausfüllen. Hier liegen meine Bildraten bei hundert Millisekunden pro Bild, meine Pixelgröße bei acht Nanometern.Schließlich benötigen Sie Maskendateien, um die Software Zur automatischen Erkennung und Analyse von Exozytose auszuführen. Sie können die mitgelieferte Masken-Maker-Schaltfläche verwenden, um automatisch Maskendateien aus Ihren Datendateien zu generieren. Die Laufanzeige wird gelb und dann wieder grün, wenn der Maskenmacher mit dem Laufen fertig ist.Ihre Maske wird in einem neuen Ordner namens Maskendateien in dem von Ihnen gewählten Verzeichnis abgelegt. Und beachten Sie, dass Maskendateien die Liste hier automatisch füllen. Sie sollten überprüfen, ob Ihre Maskendateien für Ihre Datendateien geeignet sind, und Sie können dies tun, indem Sie eine der Datendateien in der Liste sowie die entsprechende Maskendatei hervorheben.Der erste Frame Ihrer Datendatei wird angezeigt und die ausgewählte Maskendatei wird ebenso angezeigt. Hier. Wir können sehen, dass unsere Maskendateien für die vorliegende Analyse geeignet sind. Maskendateien können vom Benutzer auch separat zur Verfügung gestellt werden.Wenn Sie eine Maskendatei aus einer aktuellen Datendatei erstellen möchten, empfehlen wir die Verwendung von Image J.In öffnen Sie dazu zuerst das Bild in Image J, aus dem Sie eine Maskendatei erstellen möchten. Sie können dann das Polygonauswahlwerkzeug verwenden, um mit dem Erstellen einer Maskendatei zu beginnen, indem Sie auf den Rand der Zelle klicken. Wenn Sie Ihre Maske abgeschlossen haben, doppelklicken Sie, um eine Verbindung zum gesamten Polygon herzustellen.Sobald dies abgeschlossen ist, gehen Sie zum Bearbeiten, Auswahlen und Erstellen der Maske. Eine invertierte Maske wird erstellt. Sie sollten diese Maskendatei unter demselben Namen wie die Datendatei speichern, gefolgt von _mask_file.Wenn Sie nun Ihre eigenen benutzerdefinierten Maskendateien bereitstellen, ist es wichtig, die automatisierte Erkennungssoftware wissen zu lassen, wo sich diese Maskendateien befinden. Dazu klicken Sie auf die Schaltfläche Maskendateien suchen und navigieren zu dem Verzeichnis mit Ihren Maskendateien. Die neuen Maskendateien füllen dann die Liste hier.Es ist wichtig, dass Sie für jede einzelne Datendatei eine Maske haben, bevor die Analyse ausgeführt werden kann. Sobald Sie Ihren Datensatz geladen, Ihre Maskendateien, Ihre Bildrate und Pixelgröße korrekt angepasst und ein ausgewähltes Verzeichnis ausgewählt haben, können Sie endlich entscheiden, ob Sie die Klassifizierung als Teil Ihrer Analyse einbeziehen möchten. Wenn Sie die Klassifizierungsschaltfläche umschalten, wird neben der Erkennung exozytischer Ereignisse jedes exozytäre Ereignis in eine von vier Klassen eingeteilt.Nachdem Sie sich entschieden haben, wie Ihre Analyse ausgeführt werden soll, können Sie die Analyse beginnen, indem Sie auf die Schaltfläche Analyse klicken. Die Laufanzeige wird gelb, um anzuzeigen, dass die Analyse läuft, und wird nach Abschluss der Analyse wieder auf Grün umschalted. Sobald die Analyse abgeschlossen ist, wie durch den Wechsel Ihres Ausführungsindikators von gelb nach grün angezeigt, werden Sie feststellen, dass ein neuer Datendateienordner in dem von Ihnen ausgewählten Verzeichnis angezeigt wurde.Im Ordner "Datendateien" finden Sie Analysedateien, die jedem Bildsatz in Ihrem Analyselauf entsprechen. Darüber hinaus finden Sie hier eine Zellstatistikdatei mit zusammenfassenden Informationen wie der Häufigkeit der Exozytose für jeden der Bildsätze. Für jeden Bildsatz haben Sie eine fluoreszierende Spurendatei, die Informationen über die X-Position, die Y-Position und die Rahmennummer enthält, wo sie exozytäre Ereignisse auftreten.Darüber hinaus wird die durchschnittliche Fluoreszenz in einer Region von Interesse um jedes exozytäre Ereignis sowohl vor, während als auch nach der Exozytose dargestellt. Darüber hinaus gibt es auch eine Tracking-Datei, die ähnliche Informationen über die X-, Y- und temporalen Positionen enthält. Wenn jedoch das Kontrollkästchen Klassifizierung aktiviert ist, gibt es zusätzlich vier zusätzliche Spalten, die die Wahrscheinlichkeit des exozyten Ereignisses angeben, das zu einer von vier Klassen gehört.Entweder volle Vesikelfusion augenblicklich, volle Vesikelfusion verzögert, Kiss-and-Run augenblicklich oder Kiss-and-Run verzögert. Ein exozytäres Ereignis gehört zu einer der vier Klassen, wenn es größer als 0,5 ist und die höchste Wahrscheinlichkeit innerhalb der vier regierten Klassen ist. In diesem Fall gehört das erste exozytäre Ereignis hier zur momentanen Klasse der vollständigen Vesikelfusion, da es die höchste Zahl über den vier Klassen ist und größer als 0,5 ist.Darüber hinaus gibt es für jedes Bildset eine Reihe weiterer Feature-Dateien, die bei der Klassifizierung der Exozytose verwendet werden und für die weitere Analyse von Interesse sein können. Wenn wir schließlich Ripleys K-Analyse verwenden möchten, um die räumlich-zeitliche Organisation der Exozytose zu erkennen, werden wir zunächst unsere Maskendatei in eine Neuritmaskendatei und eine Somamaskendatei aufteilen. Wir tun dies, indem wir zuerst unsere Maske in Bild J öffnen.Wir werden den Farbwähler verwenden wollen, um ein Hintergrundpixel auszuwählen.Und auf diese Weise, wenn wir die Maskendatei ausfüllen, ist es der richtige Wert. Als nächstes verwenden wir das Polygonauswahlwerkzeug und skizzieren den somatischen Bereich. Dies erfordert nun ein wenig subjektive, manuelle Entscheidungsfindung.Wir schlagen ein grobes Ellipsoid vor. Sobald Sie dies abgeschlossen haben, gehen Sie zum Bearbeiten, Auswahlen und Erstellen einer Maske. Schließlich kehren Sie zu unserer ursprünglichen Maskendatei zurück und verwenden Bearbeiten und Ausfüllen, um das Soma auszufüllen, und jetzt haben wir eine separate Neurit- und Somamaskendatei, die Sie dann speichern.Sobald Sie Ihre separate Neurit- und Somamaskendatei gespeichert haben, hier habe ich sie als Maskendatei Unterstrich neur für Neurit und Unterstrich soma, wir kommen zu MATLAB und öffnen die Neurite 2D Netzwerk MATLAB Datei. Hier navigieren wir über den aktuellen Ordner zu unserem Verzeichnis, in dem wir alle unsere Analysedaten hinterlegt haben. Sobald wir das getan haben, haben wir den Maskennamenpfad in unsere neue Maskendatei geändert, die der Neurit ist.In diesem Fall habe ich also meine Neurite-Maskendatei unter dem Ordner Maskendateien. Wir ändern dann den CSV-Dateinamen so, dass sich unsere fluoreszierende Traces-Datei befindet. In diesem Fall befindet es sich immer noch im Ordner "Data Files", und so sind die Datendateien Schrägstriche und der Name der fluoreszierenden Traces-CSV-Datei.Sobald dies abgeschlossen ist, können Sie auf Ausführen klicken. Dadurch wird dann eine skelettierte Version der Neurite-Maskendatei erstellt und als CSV-Datei unter dem Ordner Maskendateien abgelegt, den wir hier sehen können. Als nächstes generieren wir auch eine CSV-Datei für die Soma.Öffnen Sie dazu die CSV-Maskenerstellerdatei. Sie sollten den Pfad für Ihre Soma-Maske und einen Namen für die zu erstellende CSV-Datei einfügen. Hier habe ich einfach den gleichen genauen Dateinamen verwendet, nur mit Punkt CSV angehängt.Klicken Sie auf Ausführen, und Sie werden sehen, dass neben dem Neurit eine neue Soma-CSV-Datei erstellt wurde. Sobald wir die CSV-Dateien sowohl für die Neurite-Maske als auch für die Soma-Maske erstellt haben, können wir Ripleys K-Analyse ausführen. Dazu navigieren wir zu R Studio und öffnen die Ripley's K Analysis R Datei.Hier gibt es zwei Hauptvariablen, auf die man achten muss, Neuronenmaske und Neuronendatenpunkte. Die Neuronenmaske weist auf die Maskendateien hin, die Sie ausführen möchten. In diesem Fall führe ich zuerst die Soma-Maskendateien aus.Sie sollten alle Ihre Soma-Maskendateien getrennt von allen Neurite-Maskendateien ausführen. Hier habe ich zwei Neuronen, die ich für diese Analyse verwenden werde. Sie können jedoch so viele verwenden, wie Sie möchten, für die Ripley's K-Analyse, Sie sollten nur diesen Code für die Neuronenmaske kopieren und einfügen und die Variable in drei und weiter ändern.Die zweite Variable sind Neuronendatenpunkte. Hier möchten Sie es auf die Datei verweisen, die von Ihren Features generiert wurde, alle extrahierte R-Datei. Jetzt wurde meine Fusionsstatistik genannt, und das ist es, was sie hier liest.Wie bereits erwähnt, habe ich eine zweite Soma-Maskendatei und ein Neuron, das zusammen analysiert wird, damit wir das Ripley's K zusammen aggregieren können. Nachdem Sie diese Pfade in den richtigen Pfad geändert haben, verwenden Sie Code, führen Region aus und führen alle aus. Nach Abschluss des Durchlaufs werden mehrere Diagramme generiert, einschließlich der gruppierten Ripley-K-Werte sowie der Dichtediagramme.Diese können gespeichert werden, indem Sie exportieren, das Bild speichern unter und das entsprechende Bildformat, das Verzeichnis, den Dateinamen und schließlich auf Speichern klicken. Hier sehen wir repräsentative Ergebnisse von 12 murinen kortikalen Neuronen, die Entlüftung zu Fluor exprimieren, die an zwei Tagen in vitro mit TIRF-Mikroskopie abgebildet wurden. In A sehen wir die Häufigkeit der Exozytose geteilt nach Klasse.Hier können wir sehen, dass die vollständige Vesikelfusion augenblicklich häufiger auftritt als die anderen Klassen. In B können wir die Modenverteilung sehen, was bestätigt, dass die vollständige Vesikelfusion augenblicklich mehr als die Hälfte aller Ereignisse ausmacht. In C bestimmen wir die räumliche Verteilung der Exozytose als Heatmap.Wir können sehen, dass die Mehrheit der exozytären Ereignisse in einem Hotspot in der Nähe des Somas sowie an den distalen Enden der Neuriten gruppiert ist. In D können wir feststellen, dass exozytäre Ereignisse statistisch signifikant geclustert sind und dass die Größe dieser Cluster von einem halben Mikrometer bis zu einem Mikrometer reicht. Der Einsatz eines automatisierten Analyseprogramms zur korrekten Identifizierung und Analyse exozytärer Ereignisse auf unvoreingenommene Weise erhöht die Analyseeffizienz und verbessert die Reproduzierbarkeit und Strenge.Um die Genauigkeit der Erkennung zu gewährleisten, ist es wichtig, während der Bildgebung ein hohes Signal zu Rauschen aufrechtzuerhalten. Die Erfassung exozytärer Ereignisse oder anderer pH-sensitiver transienter Ereignisse erfordert eine Bildgebungsfrequenz, die schnell genug ist, um alle Ereignisse zu erfassen und Schätzungen wie die Halbwertszeit oder die Spitzenänderung der Fluoreszenz zu verbessern. Wir haben gezeigt, dass dieses Programm nicht nur die pH-sensitive Fluoreszenz in sich entwickelnden Neuronen genau erfasst, sondern auch andere Zelltypen.Wenn Sie jedoch einen anderen Zelltyp verwenden, ist es wichtig, aufgrund des unterschiedlichen Verhaltens vorübergehender Ereignisse in anderen Zelltypen nach Unterschieden in der Genauigkeit zu suchen. Diese Klassifikation wurde bisher nur bei der Entwicklung von Neuronen verwendet. Und tatsächlich wissen wir nicht, dass diese Prozesse in anderen Zelltypen oder zu späteren Entwicklungszeitpunkten in Neuronen existieren.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieses Video zeigt eine Technik zur Visualisierung von Exozytose in Mastzellen. Die Zellen werden mit FITC-Dextran – einem fluoreszierenden Reporter – inkubiert, das von Zellen in sekretorischen Granulaten (SGs) aufgenommen wird, wo der saure pH-Wert seine Fluoreszenz löscht. Bei Stimulation der Granula-Exozytose induziert der höhere pH-Wert des Mediums eine Reporterfluoreszenz innerhalb der fusionierten SGs, die mit einem Fluoreszenzmikroskop sichtbar gemacht wird.

Eine in vitro Technik zur Visualisierung der Exozytose von sekretorischen Granula in Mastzellen

Clathrin-vermittelte Endozytose, ein schneller und hochdynamischer Prozess, der viele Proteine, einschließlich Signalrezeptoren, internalisiert. Das hier beschriebene Protokoll visualisiert direkt die Kinetik einzelner endozytärer Ereignisse. Dies ist wichtig, um zu verstehen, wie die Kernmitglieder der endozytischen Maschinerie miteinander harmonieren und wie die Proteinfracht diesen Prozess beeinflusst.

Visualisierung Clathrin-vermittelte Endozytose von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren an Einzelereignis Resolution über TIRF-Mikroskopie

Viele verschiedene Methoden existieren für die Messung der extrazellulären Vesikeln (EVs) mittels Durchflusszytometrie (FCM). Mehrere Aspekte sollten bei der Bestimmung der am besten geeignete Methode, um zu verwenden. Zwei Protokolle zur Messung EVs präsentiert werden, unter Verwendung von entweder einzelnen Detektions oder einen Wulst-basierten Ansatz.

Techniken für die Analyse der extrazellulären Vesikeln mittels Durchflusszytometrie

Das Ziel des vorliegenden Protokolls war es, eine Methode, die funktionelle Genomanalysen von Mastzellen Sekretion ermöglichen entwickeln wird. Das Protokoll basiert auf einer quantitativen Beurteilung der Freisetzung eines fluoreszierenden Reporter-Gen mit dem Gen von Interesse und den Echtzeit cotrasfected Analysen der sekretorischen Granula Morphologie.

Untersuchung Mast Cell Sekretgranula; von Biosynthese zu Exocytosis

Synaptischen Vesikel Endozytose wird durch Lichtmikroskopie pHluorin verschmolzen mit synaptischen Vesikel Protein und Elektronenmikroskopie der Vesikel Aufnahme erkannt.

Messung der synaptischen Vesikel Endozytose in kultivierten Hippocampal Neuronen

Osmotischen Stress wirkt sich Exozytose und die Menge der Neurotransmitter freigesetzt während dieses Prozesses. Wir zeigen, wie Kombination elektrochemische Methoden zusammen mit Transmissions-Elektronenmikroskopie kann verwendet werden, um die Wirkung von extrazellulärer osmotischer Druck auf Exozytose Aktivität, Vesikel Quanten Größe und die Menge der Neurotransmitter freigesetzt untersuchen während der Exozytose.

Überwachung der Wirkung des osmotischen Druckes auf sekretorischen Vesikel und Exozytose

Hier zeigen wir eine Methode für das live Cell Imaging von regulierten Exozytose. Diese Methode nutzt FITC-Dextran, die reichert sich in Lysosomen-bezogene Organellen, als Reporter. Diese einfache Methode ermöglicht auch die Unterscheidung zwischen verschiedenen Modi der regulierten Exozytose in Zellen, die schwer zu genetisch zu manipulieren sind.

Imaging-FITC-Dextran als Reporter für regulierte Exozytose

Efferocytosis, die phagocytic Entfernung der Apoptotic Zellen ist erforderlich, um die Homöostase und wird erleichtert durch die Rezeptoren und Signalwege, die für die Anerkennung, Engulfment und Internalisierung der Apoptotic Zellen ermöglichen. Hier präsentieren wir ein Fluoreszenz-Mikroskopie-Protokoll für die Quantifizierung des Efferocytosis und die Aktivität der Efferocytic Signalwege.

Quantifizierung der Efferocytosis durch einzellige Fluoreszenz-Mikroskopie

Die Live-Bildgebung der lysosomalen Exozytose auf mikromusterten Zellen ermöglicht eine räumliche Quantifizierung dieses Prozesses. Morphologie-Normalisierung mit Mikromustern ist ein hervorragendes Werkzeug, um allgemeine Regeln über die räumliche Verteilung zellulärer Prozesse aufzudecken.

Quantifizierung der raumzeitlichen Parameter der zellulären Exozytose in mikrogemusterten Zellen

Dieses Protokoll beschreibt Ansätze zur Detektion und Quantifizierung großer Aggregat- und/oder Organellenextrusionen (ca. 4 m), die von C. elegans-Zellen in Form von membrangebundenen Exophern erzeugt werden. Wir beschreiben Stämme, Wachstumsbedingungen, Bewertungskriterien, Timing und Mikroskopieüberlegungen, die erforderlich sind, um die Zerlegung dieses Abfallvertreibungsmechanismus zu erleichtern.

Quantitative Ansätze für scoring in vivo Neuronal Aggregate und Organelle Extrusion in Large Exopher Vesicles in C. elegans

Erfahren Sie die automatisierte Erkennung und Analyse von Exozytoseereignissen in Zellkulturen mittels TIRF-Mikroskopie und MATLAB-basierter Bildverarbeitung. Diese Methode ermöglicht die Klassifizierung von vier Fusionsmodi und die Bewertung räumlich-zeitlicher Cluster in Neuronen.

Automatisierte Erkennung und Analyse von Exozytose

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