Name: Isolierung von erwachsenen menschlichen Astrozytenpopulationen aus frisch gefrorenen Kortex mittels fluoreszenzaktivierter Zellkernsortierung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 18 s
Description: Lernen Sie die Isolierung erwachsener Astrozyten aus frisch gefrorenem menschlichem Kortex mittels fluoreszenzaktivierter Zellkernsortierung. Diese Methode ermöglicht hochreine Populationen für transkriptomische und epigenetische Analysen.

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Wir danken den Mitgliedern der Pathologie und Neurochirurgie an der Icahn School of Medicine am Mount Sinai für ihre Hilfe bei der Beschaffung von de-identifiziertem Hirngewebe und der Durchflusszytometrie CORE von ISMMS für die fachkundige Beratung. Die Studie wurde teilweise von NIH RF1DA048810, R01NS106229, R03NS101581 (zu N.M.T.) und R61DA048207 (zu S.A.) finanziert.

HINWEIS: Das Programm zum Schutz menschlicher Probanden an der Icahn School of Medicine at Mount Sinai (ISMMS) und sein Institutional Review Board (IRB) gewährleisten die ethische Durchführung der Forschung und die Einhaltung von Bundes-, Landes- und institutionellen Vorschriften. In dieser Studie wurden alle verwendeten Post-mortem-Proben de-identifiziert, mit entsprechender Zustimmung durch das Biorepository erhalten und von der Bezeichnung "Humanforschung" durch das IRB des ISMMS (HS#14-01007) ausgenommen.
1. Puffervorbereitung
HINWEIS: Wenn Sie eine nachgeschaltete RNA-Sequenzierung durchführen, behandeln Sie alle Arbeitsbereiche und Werkzeuge gründlich mit RNase Decontamination Solution, um den mRNA-Abbau zu verhindern.
<ol><li>Bereiten Sie den Lysepuffer vor.<ol>
<li>In destilliertem H2 O bis zu50 ml wird Folgendes gelöst: 5,47 g Saccharose (0,32 M endg.), 250 μL 1 MCaCl2 (5 mM endg.), 150 μL 1 M mg(CH3COO)2 (3 mM endg.), 10 μL 500 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) (0,1 mM endg.), 500 μL 1 M Tris-HCl (pH 8) (10 mM endg.), 50 μL Triton X-100 (0,1% endgültig) und 17 μL 3 M Dithiothreitol (DTT, 1 mM final, frisch hinzufügen) (siehe Materialtabelle).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Saccharosepuffer vorbereiten<ol>
<li>Folgendes wird in destilliertemH2Obis zu 50 ml gelöst: 30,78 g Saccharose (1,8 M endg.), 150 μL 1 M Mg(CH 3 COO)2 (3mM endg.), 500 μL 1 M Tris-HCl (pH 8) (10 mM endg.), 17 μL 3 M DTT (1 mM final, frisch hinzufügen).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Gefrorene Gewebedissoziation in Einzelkernsuspension
<ol><li>Fügen Sie 4 ml eiskalten Lysepuffer zu einem 7 ml Glasgewebedouncer (Grinder) hinzu und halten Sie es auf Eis. Sezieren Sie etwa 200-400 mg frisch gefrorenen menschlichen Erwachsenenkortex, douncen Sie ungefähr 50x und übertragen Sie das Gewebehomogenat auf ein 12 ml Ultrazentrifugen-Polypropylenröhrchen.</li>
	<li>Mit einer 5-ml-Pipette 6,5 ml eiskalten Saccharosepuffer auf den Boden des Ultrazentrifugenröhrchens geben, wobei darauf zu achten ist, dass die Schicht zwischen Saccharose und dem Gewebehomogenat nicht gestört wird. HINWEIS: Wenn Sie zusätzliche Proben verarbeiten, balancieren Sie die Röhrchen sorgfältig nach Gewicht aus, indem Sie der leichteren Probe zusätzlichen Lysepuffer hinzufügen. Ein präzises Auswuchten der Ultrazentrifugenröhrchen ist unerlässlich, um Schäden am Rotor zu vermeiden und die Rotation mit der richtigen Geschwindigkeit sicherzustellen.</li>
</ol>3. Ultrazentrifugation
<ol><li>Ultrazentrifugieren Sie das Lysat bei 24.400 U/min (101.814 × g) für 1 h bei 4 °C. Den Überstand und die Ablagerungen vorsichtig abspritzen, ohne das Pellet zu stören. HINWEIS: Ein Pellet ist möglicherweise nicht sichtbar, wenn es mit weniger als 200 mg Gewebe beginnt.</li>
	<li>600 μL phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) (Ca 2+, Mg2+ frei) in das Kernpellet geben und vor dem Resuspendieren 10 min auf Eis inkubieren.</li>
	<li>50 Mal auf und ab pipettieren, um das Kernpellet auf Eis zu resuspendieren.</li>
	<li>Verwenden Sie ein Hämozytometer, um die intakten Kerne unter einem Mikroskop sichtbar zu machen und sicherzustellen, dass die Konzentration der Resuspension über 105 Kerne / ml liegt, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren (kombinieren Sie 10 μL der resuspendierten Kerne mit 10 μL Trypanblau).</li>
</ol>4. Antikörper-Inkubation
<ol><li>Um die Probe für FANS zu immuntaggen, fügen Sie 500 μL des resuspendierten Probenpellets, 490 μL 1x PBS (Ca 2+, Mg2+ frei), 10 μL 10% BSA (0,1% endgültig), 1 μL Maus-Anti-NeuN-Antikörper, konjugiert an AF555 (NeuN-AF555, 1:1000 Endkonzentration), und 1 μL Maus-Anti-PAX6-Antikörper, konjugiert an Allophycocyanin (PAX6-APC, 1:1000 Endkonzentration), hinzu. HINWEIS: Alternative Antikörper, die mit anderen Fluorophoren konjugiert sind, können hinzugefügt werden (siehe Diskussion). Hier wurde Maus-Anti-OLIG2 konjugiert mit AF488 (1:1000 Konzentration) mit günstigen Ergebnissen verwendet.</li>
	<li>Führen Sie 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI)-only und einfarbige Kontrollen durch, um Gating-Parameter einzurichten, wobei bei Bedarf eine kleine Menge der Probe verwendet wird.<ol>
<li>Um eine AF555-Einzelfarbkontrolle durchzuführen, fügen Sie 20 μL des resuspendierten Probenpellets, 970 μL 1x PBS (Ca 2+, Mg 2+ frei), 10 μL 10% BSA (0,1% endgültig) und 1 μL NeuN-AF555 Antikörper (1:1000 Konzentration) hinzu.</li>
		<li>Um eine APC-Einzelfarbkontrolle durchzuführen, fügen Sie 20 μL des resuspendierten Probenpellets, 970 μL 1X PBS (Ca 2+, Mg2+ frei), 10 μL 10% BSA (0,1% endgültig) und 1 μL PAX6-APC-Antikörper (1:1000 Konzentration) hinzu.</li>
		<li>Um eine reine DAPI-Kontrolle durchzuführen, fügen Sie 20 μL des resuspendierten Probenpellets, 970 μL 1X PBS (Ca 2+, Mg2+ frei) und 10 μL 10% BSA (0,1% endgültig) hinzu (DAPI wird später hinzugefügt, siehe 4.4). HINWEIS: Wenn mehr als zwei Antikörper verwendet werden, wird zusätzlich zu den einfarbigen Kontrollen eine Fluoreszenz-Minus-Eins-Kontrolle (FMO) empfohlen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Die Proben und die Kontrollen werden mit Rotation im Dunkeln für 1 h bei 4 °C inkubiert.</li>
	<li>Fügen Sie allen Stichproben und Kontrollen DAPI bei 1:1000 hinzu, und fahren Sie mit der Sortierung fort.</li>
</ol>5. Fluoreszenzaktivierte Kernsortierung (FANS)
HINWEIS: Es wird empfohlen, eine institutionelle Durchflusszytometrieeinrichtung mit Unterstützung von geschultem Personal zu verwenden, es sei denn, Sie beherrschen bereits die Durchflusszytometrie / Sortiertechniken.
<ol><li>Tor wie unten gezeigt.<ol>
<li>Zuerst und für jede Probe, Gate durch Vorwärtsstreuung (FSC-A) vs. Seitenstreuung (SSC-A), um Partikel im geeigneten Größenbereich für Kerne einzuschließen, wodurch rote Blutkörperchen und Ablagerungen ausgeschlossen werden (Abbildung 1A). HINWEIS: Eine sehr saubere Kernaufbereitung kann zwischen einem kleineren Trümmerhaufen und einem Kerncluster unterscheiden.</li>
		<li>Als nächstes und für jede Stichprobe Gate durch FSC-A vs. FSC-W (oder FSC-A vs. FSC-H) und SSC-A vs. SSC-W (oder SSC-A vs. SSC-H), um nur Singulett-Kerne einzuschließen (Abbildung 1B).</li>
		<li>Als nächstes und für jede Stichprobe, Gate durch DAPI, um intakte Kern-Singlets (DAPI-hohe Gated Population) einzubeziehen, ohne Trümmer (DAPI-niedrig, links von der Gated Population) und Dubletten (rechts von Gated Population) (Abbildung 1C).</li>
		<li>Legen Sie weitere Gatings basierend auf Fluoreszenzkontrollen fest, die visuell als unterschiedliche Cluster auf FACS-Plots bestimmt werden.<ol>
<li>Führen Sie eine reine DAPI-Kontrolle durch, um die Hintergrundfärbung von Populationen in Abwesenheit von Antikörpern zu bestimmen (Abbildung 1D und Abbildung 2A).</li>
			<li>Führen Sie die Nur-NeuN-AF555-Steuerung aus, um den Grenzwert für die NeuN+-Färbung im Kanal für AF555 zu bestimmen (Abbildung 2B).</li>
			<li>Führen Sie die Nur-PAX6-APC-Steuerung aus, um den Grenzwert für die PAX6+-Färbung im APC-Kanal zu bestimmen (Abbildung 2C).</li>
			<li>Führen Sie zusätzliche einfarbige Kontrollen aus, wenn Sie mehr Antikörper verwenden (Abbildung 2D, E). HINWEIS: Bei Verwendung von mehr als zwei Antikörpern wird eine FMO-Kontrolle empfohlen, um Verschiebungen in den Populationen zu visualisieren.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Sobald alle Steuerelemente ausgeführt wurden, ziehen Sie die Tore für NeuN+- und PAX6+-Sammlungen über die festgelegten Schwellenwerte.<ol>
<li>Gate die NeuN+-Population, um Neuronen zu sammeln (Abbildung 1E und Abbildung 2F).</li>
			<li>Gate die PAX6+-Population aus der NeuN-Population, um Astrozyten zu sammeln (Abbildung 1E, F und Abbildung 2F).</li>
			<li>Gate und collect zusätzliche Gliapopulationen (wie Oligodendrozyten-Vorläuferzellen, wie hier durch OLIG2+ gezeigt) aus der NeuN-PAX6-Population (Abbildung 1F). HINWEIS: Falls die Bestimmung geeigneter Gating-Cutoffs mit der Durchflusszytometrie-Software aufgrund undeutlicher Populationen schwierig ist, kann es hilfreich sein, die Anzahl der zu visualisierenden Ereignisse zu ändern (entweder die Anzahl der Ereignisse auf dem FANS-Diagramm zu erhöhen oder zu reduzieren).</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sammeln Sie Proben entsprechend auf der Grundlage der beabsichtigten nachgelagerten Analyse.</li>
</ol>6. Sammlung von FANS-Populationen für nachgelagerte molekulare Analysen
<ol><li>Für die Bulk-RNA-Sequenzierung werden 50.000-500.000 Kerne in PBS gesammelt (siehe auch Abschnitt 7.1).<ol>
<li>2 ml Saccharoselösung, 50 μL 1 MCaCl2 und 30 μL 1 M Mg(CH3COO)2 zugeben und mit PBS bis zu 10 ml füllen.</li>
		<li>Invertieren und 15 min auf Eis inkubieren, dann bei 900 × g für 10-15 min bei 4 °C zentrifugieren.</li>
		<li>Den Überstand abspritzen, in 1 ml RNA-extrahierendem Reagenz resuspendieren, wirbeln, auf Trockeneis gefrieren und bei -80 °C lagern.</li>
		<li>Alternativ können Sie die Proben direkt in 200 μL des RNA-extrahierenden Reagenzes entnehmen. Fügen Sie das RNA-extrahierende Reagenz nach dem Sortieren bis zu 1 ml hinzu, wobei ein Verhältnis von 1: 1 des Reagenzes zur sortierten Probe beibehalten wird. Wirbeln, auf Trockeneis gefrieren und bei -80 °C lagern.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Für den Bulk-Assay auf Transposase-zugängliches Chromatin mittels Sequenzierung (ATAC-seq) werden 50.000-75.000 Kerne in PBS in einem Mikrozentrifugenröhrchen gesammelt, das mit 5% Rinderserumalbumin (BSA) beschichtet ist. Kerne auf Trockeneis/-80 °C einfrieren oder sofort zur ATAC-Aufbereitung verwenden.</li>
	<li>Für sn RNA-seq oder ATAC-seq werden Kerne in 0,04% BSA in PBS gesammelt (siehe auch Abschnitt 7.2).</li>
</ol>7. Tipps zur Vorbereitung der Bibliothek
<ol><li>Vorbereitung der Bulk-Nu-RNA-Sequenzierungsbibliothek<ol>
<li>Nach dem Sammeln in RNA-Extraktionsreagenz führen Sie eine Standard-Phenol/Chloroform-RNA-Extraktion durch, indem Sie Phenol/Chloroform hinzufügen und RNA aus der oberen wässrigen Schicht mit Ethanol ausfällen, gefolgt von einem DNase-Aufschluss auf Tube (15 min).</li>
		<li>Führen Sie eine RNA-Reinigung durch und konzentrieren Sie sich in einem Endvolumen von 15 μL Wasser. HINWEIS: Mit dieser Methode beträgt die repräsentative Erholung aus 300 mg adulter Kortexprobe ~ 300.000 NeuN + -Kerne (15-20 ng / μL Gesamt-RNA nach Aufreinigung und Konzentration) und ~ 250.000 PAX6 + -Kerne (10-12 ng / μL Gesamt-RNA nach Aufreinigung und Konzentration). Diese repräsentative Ausbeute kann je nach Probenqualität, Gating-Stringenz und RNA-Rückgewinnung stark variieren.</li>
		<li>Durchführung einer quantitativen Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) vor der Sequenzierung, um die Anreicherung von Astrozyten basierend auf einer hohen differentiellen Expression von kanonischen Astrozytenmarkern (GFAP, SOX9), 10-Formyltetrahydrofolat-Dehydrogenase (ALDH1L1)) und der Erschöpfung neuronaler und anderer Zelllinienmarker zu bestätigen (Abbildung 1G). HINWEIS: Die Erfassung der doppelnegativen Population (NeuN-PAX6-) ermöglicht eine genauere, mehrstufige qPCR-Qualitätskontrollanalyse für die relative Anreicherung von Astrozyten (Abbildung 2H).</li>
		<li>Generieren Sie RNA-seq-Bibliotheken mit einem Kit, das für niedrige RNA-Integritätszahlwerte empfohlen wird, wie von postmortalen Proben erwartet.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vorbereitung der Einzelkern-Sequenzierungsbibliothek<ol>
<li>Führen Sie eine SN-Sequenzierung über einen institutionellen Sequenzierungskern durch.</li>
		<li>Für die nanofluidikbasierte Verarbeitung und Sequenzierung verwenden Sie die empfohlene Konzentration von 1 × 10 6 Zellen/ml in mindestens 60 μL 1x PBS + 0,04% BSA für die Single-Nucleus-RNA-Sequenzierung (snRNA-seq) und 3 × 106 Zellen/ml in mindestens 20 μL 1x PBS + 0,04% BSA für Single-Nucleus Assay für Transposase-Accessible Chromatin mittels Sequenzierung (snATAC-seq).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Mitchell, A., Roussos, P., Peter, C., Tsankova, N., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+future+of+neuroepigenetics+in+the+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Molecular+Biology+and+Translational+Science%22%5BJournal%5D)">The future of neuroepigenetics in the human brain.</a> Progress in Molecular Biology and Translational Science. 128, 199-228 (2014).</li>
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<li>Pollen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+identity+of+human+outer+radial+glia+during+cortical+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular identity of human outer radial glia during cortical development.</a> Cell. 163 (1), 55-67 (2015).</li>
<li>Cvekl, A., Callaerts, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAX6%3A+25th+anniversary+and+more+to+learn%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">PAX6: 25th anniversary and more to learn.</a> Experimental Eye Research. 156, 10-21 (2017).</li>
<li>Goc, J., Liu, J. Y., Sisodiya, S. M., Thom, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+spatiotemporal+study+of+gliosis+in+relation+to+depth+electrode+tracks+in+drug-resistant+epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A spatiotemporal study of gliosis in relation to depth electrode tracks in drug-resistant epilepsy.</a> European Journal of Neuroscience. 39 (12), 2151-2162 (2014).</li>
<li>Monoranu, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pH+measurement+as+quality+control+on+human+post+mortem+brain+tissue%3A+a+study+of+the+BrainNet+Europe+consortium%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropathology+and+Applied+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">pH measurement as quality control on human post mortem brain tissue: a study of the BrainNet Europe consortium.</a> Neuropathology and Applied Neurobiology. 35 (3), 329-337 (2009).</li>
<li>Ninkovic, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+Pax6+regulates+survival+of+dopaminergic+olfactory+bulb+neurons+via+crystallin+%CE%B1A%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The transcription factor Pax6 regulates survival of dopaminergic olfactory bulb neurons via crystallin αA.</a> Neuron. 68 (4), 682-694 (2010).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Das experimentelle Design nach dem skizzierten Protokoll sollte unter Berücksichtigung mehrerer biologischer und technischer Faktoren abgeschlossen werden. Beginnende Gewebeproben sind frisch gefroren, ohne fixiert worden zu sein, und haben vorzugsweise ein kurzes postmortales Entnahmeintervall, um die Kernerholung zu maximieren. Erfahrungsgemäß ermöglicht ein PMI von bis zu 24 h eine adäquate Kernerholung; Ein PMI von 12 h oder weniger ist jedoch vorzuziehen, um die Erholung intakter Kerne zu optimieren. Zusätzliche Fak...

Die molekulare Komplexität menschlicher Astrozyten ist im Primärgewebe nach wie vor schlecht definiert und erfordert bessere Werkzeuge für ihre Isolierung und Charakterisierung bei hoher Auflösung, sowohl im Gesundheits- als auch im Krankheitsbereich. Die Trennung intakter menschlicher Neuronen und Gliazellen von ihrer Nische hat sich aufgrund des begrenzten Zugangs zu frischen Hirngewebeproben, der stark miteinander verbundenen Natur von Glia- und neuronalen Prozessen und der unvermeidlichen zellulären Aktivierung während der Verarbeitung als schwierig erwiesen, die alle die molekulare Charakterisierung dieser Zelltypen ex vivoeinschränken 1 . Die fluoreszenzaktivierte Kernsortierung (FANS) hat sich als Alternative zur Lebendzellsortierung herauskristallisiert und ermöglicht die Dissoziation und Immuntagsierung von Kernpopulationen aus gefrorenem Gewebe. In den letzten zehn Jahren wurde FANS häufig zur Isolierung und molekularen Charakterisierung menschlicher neuronaler (NeuN +) Kernpopulationen in einer Vielzahl von Gehirnproben und anatomischen Regioneneingesetzt 1,2,3,4.
Ähnliche Methoden zur Isolierung spezifischer Gliakern-Subpopulationen aus dem menschlichen Kortex waren jedoch begrenzt, was zu einem relativen Mangel an Raffinesse beim Verständnis der Astrozytenkomplexität sowohl in normalem als auch in erkranktem Gewebe führte. Zu diesem Zweck wurde ein zuvor veröffentlichtes Protokoll zur Isolierung menschlicher neuronaler Populationen mit FANS4 angepasst und eine Methode zur Anreicherung für Astrozyten (und für oligodendrogliale Vorläufer) unter Verwendung einer Dreifach-Antikörper-Kombination validiert, wobei Astrozyten sowohl unter ruhenden als auch unter reaktiven Bedingungen erfasstwurden 5. Um speziell für Astrozyten in der NeuN-Fraktion anzureichern, wurden Antikörper gegen einen von zwei Transkriptionsfaktoren verwendet, von denen bekannt ist, dass sie über Astrozytenpopulationen hinweg unterschiedlich exprimiert werden, PAX6 oder SRY-Box-Transkriptionsfaktor 9 (SOX9) 6,7. PAX6 wird während der frühen fetalen Entwicklung in radialen gliaähnlichen Vorläufern in Keimzonen hoch exprimiert und trägt sowohl zur Neurogenese und Gliogenese 8,9,10,11 als auch zur retinalen neuronalen Spezifikation 12 bei. Beim Erwachsenen ist PAX6 in ruhenden menschlichen Astrozyten6 differentiell überexprimiert und zeigt eine Proteinkoexpression mit glialfibrillärem saurem Protein (GFAP) in humanen Epilepsiegewebeastrozyten13.
Dieses Protokoll beschreibt die gleichzeitige Isolierung neokortikaler neuronaler und astrozytenangereicherter Kernpopulationen durch FANS. Frisches (nicht fixiertes) schockgefrorenes (d.h. frisch gefrorenes) postmortales Gewebe, das aus dem erwachsenen Kortex entnommen wird, wird zunächst mechanisch und chemisch dissoziiert. Nach der Lyse und Ultrazentrifugation in einem Saccharosegradienten werden die zytoplasmatischen und extrazellulären Komponenten verworfen, während die Kerne erhalten bleiben. Die Kerne werden dann mit fluoreszierend konjugierten Kernantikörpern markiert, die den gewünschten Ziellinien entsprechen, und mit FANS sortiert. Nach diesem Ansatz wird die Anreicherung von Astrozyten in den gesammelten PAX6+NeuN-Populationen demonstriert, validiert sowohl durch ein gezieltes qPCR-Panel als auch durch nachgeschaltete nukleare RNA-Sequenzierung.

<table><tbody><tr><td>10x PBS pH 7,2</td><td>Invitrogen</td><td>70013073</td><td></td></tr><tr><td>ANTI-NEUN ANTIKÖRPER KLON A60</td><td>Millipore</td><td>MAB377A5MI</td><td>Maus Anti-NeuN, konjugiert an eine fluoreszierende Verbindung AF555 (Anregung, 553 nm; Emission, 568 nm)</td></tr><tr><td>ANTI-OLIG2 ANTIKÖRPER Klon 211</td><td>Millipore</td><td>MABN50A4MI</td><td>Maus-Anti-OLIG2, konjugiert an eine fluoreszierende Verbindung AF488 (Anregung, 499 nm; Emission, 520 nm)</td></tr><tr><td>Rind Serumalbumin</td><td>Fisher</td><td>BP9704-100</td><td></td></tr><tr><td>Bright-Line-Zählkammer</td><td>Hausser Scientific</td><td>3110V</td><td></td></tr><tr><td>Calciumchlorid wasserfrei</td><td>Fisher</td><td>C614-3</td><td></td></tr><tr><td>Zellsiebe, 40 & Mikro; M</td><td>SP Scienceware</td><td>136800040</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4',6-Diamidino-2-phenylindole, Dihydrochlorid)</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol</td><td>Sigma</td><td>43815-1G</td><td></td></tr><tr><td>DNA Library Kit</td><td>Illumina, Nextera</td><td>FC-121&ndash; 1030</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>Worthington</td><td>LS002139</td><td></td></tr><tr><td>Dounce Tissue Grinder</td><td>WHEATON</td><td>357542</td><td></td></tr><tr><td>FACS Sorter</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>BD FACSAria III</td></tr><tr><td>Magnesiumacetat Tetrahydrat</td><td>Fisher</td><td>M13-500</td><td></td></tr><tr><td>PAX6 (PAX6/496) - 100 TESTS</td><td>Novus</td><td>NBP234705J</td><td></td></tr><tr><td>RNA Clean & Konzentrator</td><td>Zymo Research</td><td>R1013</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap RNase Dekontaminationslösung</td><td>Invitrogen</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit Pico Input Mammalian</td><td>Clontech</td><td></td><td>Laboratories 635005 Fragmentierungszeit von 2,5 Minuten, wie empfohlen für niedrige RIN-RNA-Werte.</td></tr><tr><td>Saccharose, kristallzertifiziert, ACS, 500 mg</td><td>Fisher</td><td>S5500</td><td></td></tr><tr><td>SW 41 Ti Schwingschaufelrotor</td><td>Beckman-Schar</td><td>331362</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl, 1M Lösung, pH 8,0, molekularbiologische Qualität, hochreines</td><td>Thermo Scientific</td><td>J22638AE</td><td></td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>Fisher</td><td>BP151-500</td><td>nichtionisches Tensid in Lysepuffer</td></tr><tr><td>TRIzol LS Reagenz</td><td>Invitrogen</td><td>10296028</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol Reagenz</td><td>Invitrogen</td><td>15596026</td><td>Reagenz zur Isolierung von RNA</td></tr><tr><td>Trypanblau Lösung, 0,4%</td><td>Gibco</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Ultrazentrifuge</td><td>Beckman Coulter Optima XE-100</td><td>A94516</td><td></td></tr><tr><td>Ultrazentrifugenröhrchen PP 9/16 X 3-1/2</td><td>Beckman Coulter</td><td>331372</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Destilliertes Wasser ( RNAse-, DNAse-frei)</td><td>Invitrogen</td><td>10977023</td><td>als destilliertes Wasser bezeichnet</td></tr><tr><td>Ultrapure EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>15576-028</td><td></td></tr></tbody></table>

isolierung von erwachsenen menschlichen astrozytenpopulationen aus frisch gefrorenen kortex mittels fluoreszenzaktivierter zellkernsortierung

Isolation of Adult Human Astrocyte Populations from Fresh-Frozen Cortex Using Fluorescence-Activated Nuclei Sorting

Die Komplexität menschlicher Astrozyten ist im primären menschlichen Gewebe nach wie vor schlecht definiert und erfordert bessere Werkzeuge für ihre Isolierung und molekulare Charakterisierung. Die fluoreszenzaktivierte Nuclei Sorting (FANS) kann verwendet werden, um menschliche neuronale Kernpopulationen (NeuN +) erfolgreich aus gefrorenem Archivgewebe zu isolieren und zu untersuchen und so Probleme im Zusammenhang mit der Handhabung von frischem Gewebe zu vermeiden. Es fehlen jedoch Bemühungen, Astroglia in ähnlicher Weise vom nicht-neuronalen (NeuN-) Element zu isolieren. Eine kürzlich entwickelte und validierte Immunotagging-Strategie verwendet drei Transkriptionsfaktor-Antikörper, um gleichzeitig angereicherte neuronale (NeuN +), Astrozyten- (gepaart Boxprotein 6 (PAX6) + NeuN-) und Oligodendrozyten-Vorläufer- (OLIG2 + NeuN-) Kernpopulationen aus nicht erkranktem, frischem (nicht fixiertem) postmortalem humanem temporalem Neokortexgewebe zu isolieren.
Diese Technik erwies sich als nützlich für die Charakterisierung von zelltypspezifischen Transkriptomveränderungen im primären pathologischen Epilepsie-Neokortex. Transkriptomische Analysen bestätigten, dass PAX6+NeuN-sortierte Populationen robust für Pan-Astrozytenmarker angereichert sind und Astrozyten sowohl unter ruhenden als auch unter reaktiven Bedingungen einfangen. Dieses Papier beschreibt die FANS-Methodik zur Isolierung von Astrozyten-angereicherten Kernpopulationen aus frisch gefrorenen menschlichen Kortex, einschließlich der Gewebedissoziation in Einzelkernsussuspension (sn); Immuntagging von Kernen mit fluoreszenzkonjugierten Antikörpern gegen NeuN und PAX6; FANS Gating-Strategien und Qualitätskontrollmetriken zur Optimierung der Sensitivität und Spezifität während der Sortierung und zur Bestätigung der Astrozytenanreicherung; und empfohlene Beschaffung für die nachgelagerte Transkriptom- und Chromatin-Zugänglichkeitssequenzierung in Massen- oder SN-Auflösung. Dieses Protokoll gilt für nicht-nekrotische, frisch gefrorene, menschliche kortikale Proben mit verschiedenen Pathologien und empfohlener postmortaler Gewebeentnahme innerhalb von 24 h.

Die Kerne wurden aus frischem (nicht fixiertem) schockgefrorenem temporalem Neokortexgewebe mit einer postmortalen Entnahmezeit von 12 h entnommen. Nach der Dissoziation des Gewebes in die Kernsuspension wurden die Proben mit Antikörpern gegen NeuN, PAX6 und OLIG2 inkubiert und nach dem in Abbildung 1 und Abbildung 2 gezeigten Gating sortiert. Kerne wurden aus NeuN+, PAX6+NeuN- und OLIG2+NeuN- sortierten Populationen gesammelt (Abbildung 1E<...

Wir haben eine Methode entwickelt, die menschliche Astrozytenpopulationen aus frisch gefrorenem Gewebe anreichert und isoliert, um sie in nachgelagerten molekularen Analysen zu verwenden.

Isolierung von erwachsenen menschlichen Astrozytenpopulationen aus frisch gefrorenen Kortex mittels fluoreszenzaktivierter Zellkernsortierung

The complexity of human astrocytes remains poorly defined in primary human tissue, requiring better tools for their isolation and molecular ...

Dieses Protokoll kann Wissenschaftlern helfen, die daran interessiert sind, die molekulare Funktion menschlicher Astrozyten in ihrer Heimatnische zu untersuchen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Isolierung und Anreicherung eines bestimmten Zelltyps, erwachsener Astrozyten, aus großen menschlichen Hirngewebeproben mittels fluoreszenzaktivierter Kernsortierung ermöglicht. Diese Methodik kann angewendet werden, um andere Zelltypen aus dem menschlichen Neokortex, wie Neuronen und Oligodendrozyten-Vorläuferzellen, unter Verwendung anderer geeigneter fluoreszierender konjugierter Antikörper zu isolieren.Beginnen Sie mit der Sezierung von etwa 200 bis 400 Milligramm Gewebe aus einer frisch gefrorenen menschlichen erwachsenen Kortexgewebeprobe. Legen Sie das Gewebe in einen sieben Milliliter großen Glasgewebedouncer mit vier Millilitern eiskaltem Lysepuffer auf Eis und mahlen Sie das Gewebe etwa 50 Mal. Überführen Sie das Homogenat in ein 12-Milliliter-Ultrazentrifugen-Polypropylenröhrchen.Verwenden Sie eine Fünf-Milliliter-Pipette, um 6,5 Milliliter eiskalten Saccharosepuffer in den Boden des Ultrazentrifugenröhrchens zu geben, ohne die Grenzfläche zwischen Sacc

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Neurowissenschaften

In diesem Video beschreiben wir die Methode, um ein reines Präparat von Astrozyten aus neugeborenen Mäusen zu erhalten.

Astrozytenisolierung: Eine Methode zur reinen Präparation von kortikalen Astrozyten der Maus

Das Video zeigt eine einfache Methode, um murine Astrozyten isoliert von anderen Gehirnzellen zu kultivieren. Während der Kultivierung werden durch die Verwendung von Astrozyten-spezifischen Medien und die Hemmung der Adhärenz nicht-astrozytärer Zellen selektiv Astrozyten kultiviert. Diese kultivierten Astrozyten weisen eine sternförmige Morphologie mit feinen Fortsätzen auf.

Eine einfache Technik zur Isolierung und Kultivierung von murinen Astrozyten

Dieses Video demonstriert das Verfahren zur Isolierung und Sortierung von Zellkernen aus frisch gefrorenem menschlichem Hirngewebe mittels fluoreszenzaktivierter Kernsortierung (FANS), das die Untersuchung verschiedener Zellpopulationen für verschiedene neurologische Anwendungen ermöglicht.

Isolierung von Zellpopulationen aus Hirngewebe mittels fluoreszenzaktivierter Zellkernsortierung

Astrozyten wurden erkannt, vielseitige beteiligten Zellen in grundlegender biologischer Prozesse, die wichtig für die normale Entwicklung des Gehirns und Funktion, und das zentrale Nervensystem Reparatur sein. Hier präsentieren wir ein schnelles Verfahren zur reinen Maus Astrozytenkulturen erhalten, um die Biologie dieser wichtigen Klasse von zentralen Nervensystems Zellen zu untersuchen.

Isolation und Kultur von Maus Kortikale Astrozyten

Hier präsentieren wir ein Protokoll Mikroglia aus postnataler Maus Welpen (Tag 1) für in - vitro - Experimente zu isolieren. Diese improvisierte Isolierungsmethode erzeugt sowohl hohe Ausbeute und Reinheit, einen bedeutenden Vorteil gegenüber alternativen Methoden, die für die Zwecke der Erläuterung Mikroglia biology breites Spektrum Experimente ermöglicht.

Schnelle und Refined CD11b Magnetic Isolierung von primären Mikroglia mit erhöhter Reinheit und Vielseitigkeit

Die hier beschriebene AWESAM-Protokoll ist optimal für die Kultivierung von murinen Astrozyten isoliert von anderen Gehirnzellen in eine schnelle, einfache und kostengünstige Weise. AWESAM Astrozyten weisen spontane Ca2 + -Signalisierung, Morphologie und gen Expressionsprofile Astrozyten in Vivoähnlich.

In VivoKultivierung-wie Murine Astrozyten über das schnelle, einfache und kostengünstige AWESAM-Protokoll

Hier beschreiben wir eine In-vitro-Live-Imaging-Methode zur Visualisierung des intrazellulären Transports von Organellen und des Handels mit Plasmamembranproteinen in murinen Astrozyten. Dieses Protokoll stellt auch eine Bildanalysemethodik zur Bestimmung von Frachttransportrouten und Kinetik dar.

Visualisierung und Analyse des intrazellulären Transports von Organellen und anderen Ladungen in Astrozyten

Wir bieten ein Protokoll zur Isolierung von Mikroglia aus verschiedenen sezierten Regionen einer erwachsenen Maushirnhälfte, gefolgt von halbautomatischer Bibliotheksvorbereitung für die tiefe einzelzellige RNA-Sequenzierung von Transkriptomen in voller Länge. Diese Methode wird dazu beitragen, die funktionelle Heterogenität von Mikroglia bei Gesundheit und Krankheit aufzuklären.

Isolierung von regionsspezifischer Mikroglia von einer Erwachsenenmaus Gehirnhälfte für tiefe einzellige RNA-Sequenzierung

Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll zur Erzeugung hochangereicherter Kulturen von Astrozyten, die aus verschiedenen Regionen des Zentralnervensystems postnataler Mäuse stammen, und deren direkte Umwandlung in funktionelle Neuronen durch die erzwungene Expression von Transkriptionsfaktoren.

Isolierung und direkte neuronale Reprogrammierung von Maus-Astrozyten

Bis heute sind Protokolle für die gleichzeitige Isolierung aller wichtigsten Zelltypen des Zentralnervensystems aus derselben Maus ein ungedeckter Bedarf. Das Protokoll zeigt ein Verfahren, das in naiven und experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis-Mäusen angewendet werden kann, um komplexe zelluläre Netzwerke während der Neuroinflammation zu untersuchen und gleichzeitig die erforderliche Anzahl von Mäusen zu reduzieren.

Gleichzeitige Isolierung der wichtigsten Zelltypen des Zentralnervensystems aus adulten Autoimmun-Enzephalomyelitis-Mäusen

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung von gereinigten Astrozyten und Mikroglia aus dem Rückenmark der erwachsenen Maus und erleichtert spätere Anwendungen wie RNA-Analyse und Zellkultur. Es umfasst detaillierte Zelldissoziationsmethoden und -verfahren, die darauf ausgelegt sind, sowohl die Qualität als auch die Ausbeute isolierter Zellen zu verbessern.

Isolierung von reinen Astrozyten und Mikroglia aus dem Rückenmark adulter Mäuse für In-vitro-Assays und Transkriptomstudien

Lernen Sie die Isolierung erwachsener Astrozyten aus frisch gefrorenem menschlichem Kortex mittels fluoreszenzaktivierter Zellkernsortierung. Diese Methode ermöglicht hochreine Populationen für transkriptomische und epigenetische Analysen.

Isolierung von erwachsenen menschlichen Astrozytenpopulationen aus frisch gefrorenen Kortex mittels fluoreszenzaktivierter Zellkernsortierung (Video) | JoVE Journal

Isolierung von erwachsenen menschlichen Astrozytenpopulationen aus frisch gefrorenen Kortex mittels fluoreszenzaktivierter Zellkernsortierung

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