Erforschung von ^m6A- und m5C-Epitranskriptomen bei Virusinfektion: ein Beispiel mit HIV

Hallo, in diesem Video zeigen wir Ihnen, wie Sie die m6A- und m5C-Epitranskriptome bei einer Virusinfektion erforschen können. Um das Experiment zu starten, benötigen Sie 50 Millionen Zellen für die nicht infizierten und 50 Millionen für die infizierte Erkrankung. Um bei der Analyse einen qualitativ hochwertigen Datensatz zu erhalten, müssen Sie eine universelle Infektion erreichen.

Hier infizieren wir diese Zellen mit einem HIV-basierten Vektor und messen das viral kodierte GFP durch FACS. In diesem Fall hatten wir 80% der infizierten Zellen und fuhren mit dem Workflow fort, beginnend mit der gesamten RNA-Extraktion. Also teilten wir die Zellen in Aliquots von jeweils 10 Millionen auf und lysierten sie in 1 ml Trizol.

Wir haben dann 200 Mikroliter Chloroform in das Zelllysat gegeben und durch Inversion gemischt. An dieser Stelle lassen wir das Lysat drei Minuten bei Raumtemperatur ruhen und zentrifugieren dann alle Proben mit hoher Geschwindigkeit für 15 Minuten bei vier Grad. Sie erwarten eine Phasentrennung in drei verschiedenen Phasen, wie hier gezeigt.

RNA sitzt in der oberen Phase, also übertragen Sie die wässrige Phase vorsichtig in eine frische Röhre, indem Sie darauf achten, die organische Schicht nicht zu übertragen. An dieser Stelle 0,5 ml Isopropanol in die wässrige Phase geben und vorsichtig durch Inversion mischen. Die Proben können dann eine Stunde bei 80 Grad inkubiert werden, um die RNA-Ausfällung sicherzustellen.

Bei der Zentrifugation mit hoher Geschwindigkeit sollten Sie in der Lage sein, ein schönes RNA-Pellet zu sehen, wie hier gezeigt. Verwerfen Sie den Überstand vorsichtig entweder durch Inversion oder durch Pipettieren und achten Sie darauf, das Pellet nicht zu stören. Dann waschen Sie das RNA-Pellet mit einem ml Ethanol von 75% molekularer Qualität.

Und wirbeln Sie die Probe kurz. Stellen Sie bei der Zentrifugation sicher, dass Sie ein schönes weißes RNA-Pellet abrufen. Entsorgen Sie den Überstand und lassen Sie das RNA-Pellet 15 Minuten bei Raumtemperatur trocknen.

Resuspend jedes Pellet in 20 Mikroliter Wasser und poolen Sie alle Proben aus dem gleichen Zustand zusammen. Die Gesamt-RNA ist nun bereit für die mRNA-Isolierung durch Poly-A-Selektion. Für jede Probe von 75 Mikrogramm RNA werden 200 Mikroliter Oligo-DT-Magnetperlen hergestellt und in einem ml Bindungspuffer gewaschen.

Stellen Sie das Rohr auf einen magnetischen Ständer und lassen Sie die Perlen während einer Mischung an den Magneten binden. Verwerfen Sie den Überstand und wiederholen Sie den Vorgang für eine zweite Wäsche. Dann die Perlen von den Magnetständern entfernen und vorsichtig in 100 Mikroliter Bindungspuffer resuspendieren.

Bereiten Sie zu diesem Zeitpunkt die RNA-Probe vor, indem Sie sie in 75 Mikrogramm RNA pro Aliquot aufteilen, resuspendiert in 100 Mikroliter Wasser. Fügen Sie 100 Mikroliter Bindungspuffer hinzu und inkubieren Sie für zwei Minuten bei 65 Grad. Dann drehen Sie die Proben herunter und inkubieren Sie auf Eis.

Fügen Sie dann 100 Mikroliter gewaschene Magnetperlen zu jeder RNA-Probe hinzu und lassen Sie die Bindung auf einem rotierenden Rad für 15 Minuten bei Raumtemperatur zu. Legen Sie das Rohr nach der Inkubation wieder in ein Magnetgestell und lassen Sie es eine Minute lang inkubieren. Dann holen Sie den Überstand in ein frisches Röhrchen zurück und halten Sie ihn für eine zweite Runde der Isolierung beiseite.

Waschen Sie die Perlen zweimal mit 200 Mikroliter Waschpuffer und fahren Sie dann mit der Elution fort. Um Poly-A-selektierte RNA aus den magnetischen Kügelchen zu eluieren, geben Sie 20 Mikroliter eiskaltes TRIS HCl zu jeder Probe und pipettieren Sie vorsichtig. Dann inkubieren Sie Ihre Proben bei 80 Grad für zwei Minuten, um die RNA aus den Kügelchen freizusetzen.

Übertragen Sie den Überstand, der Poly-A-ausgewählte RNA enthält, in ein frisches Röhrchen, wobei Sie vorsichtig sein müssen, um die Verschleppung von Perlen zu vermeiden. Der Elutionsschritt sowie der Isolationsschritt sollten zweimal wiederholt werden, um die mRNA-Ausbeute zu erhöhen. mRNA ist nun bereit, entweder im Fragmentierungsschritt in die meRIP-Seq-Pipeline einzudringen oder direkt zur Bisulfit-Umwandlung überzugehen.

Der erste Schritt zum Eintritt in die meRIP-Seq-Pipeline besteht in der mRNA-Fragmentierung. Dazu benötigen Sie fünf Mikrogramm mRNA, aufgeteilt in Aliquots von 18 Mikroliter in 0,2 ml Röhrchen. Um konsistente Daten zu gewährleisten, ist es wichtig, schnell und mit nur wenigen Proben zu arbeiten.

Für dieses Experiment wurde die Fragmentierung optimiert, um Fragmente einer Größe zwischen 115 und 200 Nukleotiden zu erhalten. Dann fügen Sie zwei Mikroliter Fragmentierungsreagenz zu jedem Röhrchen hinzu, das 18 Mikroliter mRNA enthält, wobei Sie vorsichtig sein müssen, den Tröpfchen an der Röhrchenwand abzuscheiden. Drehen Sie alle Proben herunter, um den Kontakt zwischen dem Reagenz und der RNA gleichzeitig zu ermöglichen, und inkubieren Sie bei 70 Grad für 15 Minuten.

Sobald die Inkubation beendet ist, stoppen Sie die Reaktion, indem Sie zwei Mikroliter mit 0,5 M EDTA hinzufügen. An diesem Punkt können Sie Ihre fragmentierte mRNA mit der Methode Ihrer Wahl reinigen und mit einer RNA-Qualitätskontrolle durch Fragmentanalysator fortfahren. Dieser Schritt ist optional, ermöglicht es jedoch, die Größe des Fragments vor der RNA-Ausfällung zu beurteilen.

Wie Sie hier in der vierten Spur sehen können, erhalten wir für unsere beiden Probenfragmente jeweils rund 150 Nukleotid. Wir fuhren dann mit meRIP-Seq fort. Der erste Schritt besteht aus Koppeln von A / G-Magnetperlen mit entweder Anti-m6A-Antikörpern oder IgG-Kontrollen.

Für jeden Reaktionsplan werden 25 Mikroliter Magnetperlen in ein frisches Röhrchen gegeben. Bitte beachten Sie, dass Sie mindestens eine m6A-spezifische Bedingung und eine Kontrollbedingung benötigen. Waschen Sie jeweils 25 Mikroliter Perlen mit 250 Mikroliter IP-Puffer.

Befestigen Sie die Perlen vorsichtig durch Pipettieren auf und ab und legen Sie das Rohr für eine Minute auf das Magnetgestell, um eine Perlentrennung zu ermöglichen. Entfernen und entsorgen Sie den Überstand, achten Sie darauf, dass die Magnetperlen nicht angesaugt werden, und wiederholen Sie den Waschschritt einmal. Dann resuspendieren Sie die magnetischen Perlen in 100 Mikroliter IP-Puffer pro 25 Mikroliter des ursprünglichen Volumens der Perlen.

Bereiten Sie eine Tube pro Bedingung vor und beschriften Sie sie. In unserem Fall haben wir zwei Röhrchen für die infizierte Erkrankung, eine für m6A und eine für die IgG-Kontrolle und zwei Röhren für die nicht infizierte Erkrankung. Dann fügen Sie 100 Mikroliter gewaschene Perlen in jedes Röhrchen hinzu.

Perlen sind jetzt bereit, mit spezifischen Antikörpern oder IgG-Kontrollen gekoppelt zu werden. Jedem Röhrchen, das 100 Mikroliter gewaschene Magnetperlen enthält, werden fünf Mikrogramm entweder eines spezifischen Anti-m6A-Antikörpers oder eines Anti-IgG-Kontrollantikörpers hinzugefügt. Lassen Sie die Konjugation von Antikörper-Kügelchen zu, indem Sie das Röhrchen 30 Minuten auf einem rotierenden Rad inkubieren.

Fahren Sie in der Zwischenzeit mit der Probenvorbereitung fort. Für jede geplante Bedingung, entweder m6A-spezifische oder IgG-Kontrolle, besteht Ihr Ausgangsmaterial aus 2,5 Mikrogramm fragmentierter mRNA, resuspendiert 100 Mikroliter Wasser. Um ein endgültiges Reaktionsvolumen von 500 Mikroliter zu erhalten, fügen Sie jeder Probe 295 Mikroliter Wasser hinzu.

Fügen Sie dann fünf Mikroliter RNAase-Inhibitor bei 40 Einheiten pro Mikroliter für eine Gesamtmenge von 200 Einheiten pro Probe hinzu und mischen Sie vorsichtig. Schließlich fügen Sie 100 Mikroliter 5X konzentrierten IP-Puffer zu jedem Röhrchen hinzu. Die Proben sind nun bereit für die Immunfällungsreaktion.

Holen Sie die mit Antikörpern gekoppelten Magnetperlen aus dem rotierenden Rad und drehen Sie sie nach unten. Fügen Sie dann 500 Mikroliter der zuvor vorbereiteten Proben zu jedem 100 Mikroliter Perlen hinzu, die mit den spezifischen Antikörpern gekoppelt sind. Mischen Sie vorsichtig, indem Sie mehrmals auf und ab pipettieren, um die Perlen vollständig neu zu versenken.

Inkubieren Sie sie oder Ihre meRIP-Reaktion auf einem rotierenden Rad bei vier Grad während zwei Stunden. Sobald die Inkubation vorbei ist, drehen Sie jedes Rohr herunter und legen Sie es für eine Minute auf ein magnetisches Rack, um die Perlentrennung zu ermöglichen. Entfernen Sie dann die ungebundene Fraktion und legen Sie sie auf ein frisches Röhrchen und bewahren Sie es bei Bedarf zur weiteren Analyse auf.

Entfernen Sie den Magneten aus dem Rack und resuspendieren Sie alle Proben in 500 Mikroliter IP-Puffer. Resuspend jede Probe vorsichtig durch Pipettieren auf und ab. Setzen Sie den Magneten auf das Gestell ein, inkubieren Sie ihn eine Minute lang und entfernen Sie dann vorsichtig den Überstand.

Wiederholen Sie die Wäsche zweimal und fahren Sie dann mit der Elution fort. Bereiten Sie für jedes Probenpaar, m6A spezifisch und Kontrolle, 225 Mikroliter Elutionspuffer mit 20 Millimol gereinigtem m6A vor. Dann fügen Sie 100 Mikroliter Elutionspuffer pro Probe hinzu.

Inkubieren Sie alle Proben eine Stunde bei vier Grad auf einer Wippe. Sammeln Sie dann alle mit m6A angereicherten RNA-Proben in einem frischen Röhrchen und fahren Sie mit einer zweiten Elutionsrunde fort. Reinigen Sie die mit m6A angereicherte RNA mit der Methode Ihrer Wahl Und dann sind an dieser Stelle probenbereit für die Bibliotheksvorbereitung und -sequenzierung bereit.

Um die m5C-Modifikation zu untersuchen, verwenden wir die Bisulfit-Umwandlung. Beginnen Sie das Experiment mit 500 Nanogramm poly-adenylierter RNA. Obwohl optional, können Sie durch Hinzufügen von 500 Pikogramm Poly-A-depletierter RNA zu Ihrer Probe, um eine ribosomale Repräsentation zu gewährleisten, und 0,5 Mikroliter kommerziell erhältlicher synthetischer Sequenz die Bisulfit-Umwandlungsrate bei der Sequenzierung beurteilen.

Stellen Sie Ihre Probe auf ein Endvolumen von 20 Mikroliter in Wasser ein und geben Sie dann 130 Mikroliter RNA-Umwandlungsreagenz zu jeder Probe hinzu. Mischen Sie vorsichtig, indem Sie alle Proben nach oben und unten pipettieren und nach unten drehen, um sicherzustellen, dass keine Tröpfchen auf der Seite der Röhrchen übrig sind. Inkubieren Sie alle Proben in einer PCR-Maschine für drei Zyklen der Denaturierung 70 Grad für fünf Minuten und der Bisulfitumwandlung bei 54 Grad während 45 Minuten.

Führen Sie die In-Column-Deaminierung durch, indem Sie direkt auf eine leere Säule 250 Mikroliter RNA-Bindungspuffer, 150 Mikroliter Ihrer bisulfit-konvertierten Probe hinzufügen. Mischen Sie die Probe, indem Sie nach oben und unten pipettieren, aber achten Sie darauf, die Säulenfilter nicht zu berühren. 400 Mikroliter 95-100% Ethanol in die Proben-RNA-Bindungspuffermischung direkt in der Säule geben.

Schließen Sie die Kappe und mischen Sie sofort durch Inversion. Drehen Sie Ihre Probe für 30 Sekunden herunter und verwerfen Sie den Durchfluss. Waschen Sie Ihre Säule mit Waschpuffer und fügen Sie dann 200 Mikroliter Entschwingungslösung in die Mitte jeder Säule hinzu.

Inkubieren Sie Ihre gesamte Probe für 30 Minuten bei Raumtemperatur. Drehen Sie die Probe für 30 Sekunden herunter und fahren Sie dann mit zwei Runden Waschen fort. Jeder Probe 400 Mikroliter Waschpuffer hinzufügen, 30 Sekunden lang mit voller Geschwindigkeit zentrifugieren und den Durchfluss verwerfen.

Legen Sie die Säule in ein neues leeres Röhrchen und eluieren Sie die umgewandelte Bisulfit-RNA in 20 Mikroliter Wasser. Kontrollieren Sie die Bisulfit-Umwandlungseffizienz durch RT-qPCR und fahren Sie dann mit der Bibliotheksvorbereitung und -sequenzierung fort. Nach der bioinformatischen Analyse finden Sie hier ein Beispiel für Ergebnisse, die Sie mit diesem Workflow erhalten können.

Hier vergleichen wir das Epitranskriptom von HIV-infizierten Zellen mit nicht infizierten Zellen. 24 Stunden nach der Infektion. Im A-Panel können Sie die Ergebnisse sehen, die wir bei der Untersuchung des m6A-Epitranskriptoms erhalten.

In diesem Diagramm zeichnen wir die mit m6A angereicherten Messwerte bei der meRIP-Seq-Analyse auf. Wir können gut sehen, dass ein Zinkfinger 24 Stunden nach der Infektion hypermethyliert ist. Wir haben die gleiche Art der Analyse für die m5C-Epitranskriptom-Untersuchung in Panel B.In dieser Grafik durchgeführt, jedes nicht methylierte Cytosin wird rot angezeigt, während der Anteil an Cytosin, der m5C-methyliert wurde, blau dargestellt wird.

Wie Sie sehen können, PHLPP1, alle drei Cytosine, die 24 Stunden nach der HIV-Infektion hypermethyliert sind. Insgesamt erlaubt dieser Workflow, sowohl das M6A- als auch das m5C-Epitranskriptom infizierter Zellen zu untersuchen und kann als solches auch auf virale Partikel angewendet werden. Das Verständnis von Virusinfektionen, die in der Lage sind, die epitranskriptomische Wirtslandschaft zu verändern, wird uns Zugang zu einer neuen Regulierungsebene geben.

Die Untersuchung von differentiell methylierten Transkripten nach einer Virusinfektion wird natürlich eine wertvolle Ressource für neue therapeutische Interventionen darstellen. Unter dem link hier unten finden Sie unsere Open-Access-Ressource für die Untersuchung des differentiellen methylierten Transkripts bei einer HIV-Infektion im Laufe der Zeit.