Nanopartikel-Tracking-Analyse zur Quantifizierung und Größenbestimmung extrazellulärer Vesikel

NTA-Ergebnisse sind sehr anfällig für Bedienerverzerrungen. Dieses Protokoll demonstriert die Auswirkungen veränderter NTA-Parameter auf die erzielten Ergebnisse. Eine standardisierte Methode wird dazu beitragen, die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit der NTA-Analyse zu erhöhen.

Durch die Analyse der Probe in einer Küvette kann in jedem Video eine statistisch zufällige Stichprobe erfasst werden. Dies führt zu reproduzierbareren Daten und der Visualisierung von Partikeln über einen breiten Größenbereich. Da es schwierig sein kann, eine Probe im empfohlenen Partikelkonzentrationsbereich zu erhalten, sollten Sie unbedingt eine serielle Verdünnung durchführen, um den idealen Verdünnungsfaktor zu identifizieren.

Demonstriert wird das Verfahren von Kungheng Cai, einem Doktoranden aus anthony Ferrantes Labor. Um die Küvette für die Analyse der Nanopartikelverfolgung vorzubereiten, bedecken Sie den Arbeitsbereich mit einem fusselfreien Material, um zu verhindern, dass Fasern in die Küvetten gelangen. Legen Sie mit Handschuhen eine Küvette mit einem Rührstab auf die magnetische Küvettenvorrichtung.

Verwenden Sie ein Hakenwerkzeug, um den Einsatz in die Küvette zu legen, wobei die Keiler des Einsatzes an der Vorderseite der Küvette sichtbar ist. Verwenden Sie eine Pipette, um langsam 400 bis 500 Mikroliter gereinigter extrazellulärer Vesikel durch das Loch im Einsatz auf die Küvette zu geben, und mischen Sie die Probe durch sanftes Pipettieren ohne Luftblasen, dann verschließen Sie die Küvette, klopfen Sie blasen nach Bedarf heraus und verwenden Sie ein fusselfreies Tuch, um die Außenfläche der Küvette abzuwischen. Um die Partikelkonzentration des Verdünnungss oder einer Probe zu analysieren, schalten Sie den Computerarbeitsplatz und das Instrument ein und starten Sie das Partikelverfolgungsanalyseprogramm.

Wenn Sie dazu aufgefordert werden, klicken Sie auf NTA und öffnen Sie die Registerkarte Aufzeichnung. Folgen Sie den Anweisungen auf dem Bildschirm, um alle erforderlichen Beispielinformationen auszufüllen. Stellen Sie für die EV-Tracking-Analyse das Verdünnungssent auf PBS ein.

Der Salzgehalt füllt sich automatisch auf 9%Um die Verdünnungs- oder Probenpartikelkonzentration zu erhalten, öffnen Sie den Instrumentendeckel und entfernen Sie die Schutzkappe, auf der die Küvette platziert wird. Laden Sie die Küvette in der richtigen Ausrichtung mit der Der Kamera zugewandten Einlegekung in das Instrument und ersetzen Sie die Kappe und den Instrumentendeckel. Klicken Sie auf den Streaming-Pfeil, um die Kamera einzuschalten, und klicken Sie auf den Chevron-Pfeil, um die Aufnahmeeinstellungen zu erweitern.

Stellen Sie den Fokus ein, bis die relativ kleinen Partikel deutlich sichtbar sind. Um die Analyse für eine kleine EV-Quantifizierung einzustellen, stellen Sie die Bildrate auf 30 Bilder pro Sekunde, die Belichtung auf 15 Millisekunden, die Rührzeit auf fünf Sekunden, die Wartezeit auf drei Sekunden, die blauen, grünen und roten Laserleistungen auf 210, 12 bzw. 8 Milliwatt, die Bilder pro Video auf 300 und die Verstärkung auf 30 Dezibel ein. Stellen Sie den Fokus ein, bis die relativ kleinen Partikel deutlich sichtbar sind.

Das Erhöhen des Zooms und/oder der Verstärkung kann bei der Partikelfokussierung helfen. Wenn Sie jedoch die Verstärkung erhöhen, denken Sie daran, sie vor der Aufnahme auf 30 Dezibel einzustellen. Sobald die Partikel im Fokus sind, stellen Sie die Zoomeinstellung auf 0,5X ein, um Bandbreite zu sparen und Den Verlust von Frames zu vermeiden, und klicken Sie auf Aufnahme, um mit der Aufnahme des Videos zu beginnen.

Wenn eine Eingabeaufforderung angezeigt wird, dass die Videos aufgezeichnet wurden, klicken Sie auf OK, um die Aufzeichnung abzuschließen, und wählen Sie die Registerkarte Prozess aus. Wenn während der Aufnahme sehr große Partikel in einem Video sichtbar waren, navigieren Sie zum Verzeichnis der aufgenommenen Videos und entfernen Sie alle problematischen Videos vor der Verarbeitung. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Audioerkennung deaktivieren, und legen Sie den Funktionsdurchmesser auf 30 fest.

Klicken Sie auf Prozess, um die Videoverarbeitung zu starten und ein Live-Verteilungsdiagramm anzuzeigen. Wenn die Verarbeitung abgeschlossen ist, klicken Sie auf OK und wählen Sie die Registerkarte Plot aus. Zeigen Sie bei Elektrofahrzeugen das Hauptdiagramm als Holzbehälter-Kieselsäure an.

Andere Funktionen des Diagramms, wie z. B. das Ändern der x-Achse, um den Bereich für die Integration der erzeugten Figur festzulegen, können angepasst werden. Um einen PDF-Bericht der Ergebnisse zu erstellen, klicken Sie auf die Schaltfläche Bericht. Der Mittelwert, der Median, die Modusgröße und die Konzentration, die für den Verdünnungsfaktor und die Verteilungsbreite angepasst sind, werden angezeigt.

Die NTA des Verdünnungsmittels sollte vor jeder Probe durchgeführt werden, damit die Konzentration dieses Rohlings von der Partikelkonzentration der EV-Probe subtrahiert werden kann. Um die Küvetten nach der Analyse zu reinigen, entleeren Sie die Küvette und füllen Sie die Küvetten 10 bis 15 Mal vollständig mit entionisiertem Wasser und dreimal mit 70 bis 100% Ethanol, um Restproben zu entfernen. Trocknen Sie die Außenseite der Küvetten mit einem fusselfreien Mikrofasertuch und trocknen Sie die Innenseite mit einem Druckluftstaubwedel.

Um die Einsätze und Rührstäbe zu reinigen, legen Sie die Materialien in eine Glasszintillationsfläschchen mit 70 bis 100% Ethanol und schütteln Sie die Durchstechflasche kräftig. Dann spülen Sie die Einsätze und Rühren sie in entionisiertem Wasser mit Schütteln wie gezeigt und trocknen Sie sie mit fusselfreien Tüchern. Nach dem Trocknen sofort alle sauberen Komponenten bis zur nächsten Analyse einlagern.

Vor der Durchführung einer Analyse wurde die Gerätekalibrierung mit Polystyrolperlen getestet, um die Gültigkeit der erfassten Daten sicherzustellen. Wie beobachtet, meldete das Partikelverfolgungsinstrument genau die Größe der 100-Nanometer-Schmelzperlen, aber nur die Größe der 400-Nanometer-Perlen. Daher waren die Geräteeinstellungen für dieses Protokoll für kleinere Partikel genauer, näher an 100 Nanometern in der Größe.

Unter Verwendung dieser Einstellungen skaliert die gemeldete Partikelkonzentration entsprechend, wobei der Verdünnungsfaktor zeigt, dass das Gerät die Partikelkonzentration bei verschiedenen Verdünnungen mit geringer Variabilität zwischen technischen Replikanten genau detektieren kann. Die optimale Verdünnung für eine 4,41 mal 10 bis 10-fache Partikel pro Milliliter Mausgewebe-abgeleitete EV-Probe wurde zwischen 1.000 und 3.000 bestimmt. In dieser Analyse erhöhte die Erhöhung der Verstärkung die Empfindlichkeit der Kamera, was eine Erhöhung der Visualisierung einer höheren Anzahl kleinerer Partikel ermöglichte.

Die Erhöhung der blauen Laserleistung von 70 auf 210 Milliwatt bei konstanter grüner und roter Laserleistung verschob die gemeldete durchschnittliche Partikelgröße von 122 auf 105 Nanometer und erhöhte die gemeldete Gesamtpartikelkonzentration von 1,1 mal 10 auf die achte auf 1,7 mal 10 auf die achte. Durch die Erhöhung der Leistung des roten Lasers erhöhte sich die gemeldete durchschnittliche Partikelgröße von 175 auf 246 Nanometer und verringerte die gemeldete Gesamtpartikelkonzentration. Die Erhöhung der grünen Laserleistung führte zu einer Abnahme der gemeldeten durchschnittlichen Partikelgröße und einer Erhöhung der gemeldeten Gesamtpartikelkonzentration.

Die richtige Verdünnung zu finden, um eine Probe innerhalb des optimalen Nachweisbereichs zu platzieren, kann für jede Probe einige Versuche in Anspruch nehmen. Auch die Küvettenreinigung erfordert eine besonders sorgfältige Handhabung. Wir empfehlen, mehr als eine orthogonale Methode für EV-Partikelgrößen- und Konzentrationsmessungen anzuwenden.

Dynamische Lichtstreuung, resistive Pulserfassung, Transmissionselektronenmikroskopie und interferometrische Reflexionsmessung mit einem Partikel können ebenfalls durchgeführt werden, um EVs zu charakterisieren.