Name: Nanopartikel-Tracking-Analyse zur Quantifizierung und Größenbestimmung extrazellulärer Vesikel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: Erfahren Sie die standardisierte Nanopartikel-Tracking-Analyse zur Quantifizierung und Größenbestimmung extrazellulärer Vesikel. Diese Methode erhöht die Reproduzierbarkeit und minimiert Operatorenfehler in der EV-Forschung.

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Alle Autoren erklärten, dass es keine Interessenkonflikte gibt.

Hier demonstrieren wir ein Protokoll für NTA von Elektrofahrzeugen, um die Größenverteilung eines breiten Spektrums von Partikelgrößen gleichzeitig zu messen und die Gesamtkonzentration von Elektrofahrzeugen in einer polydispersen Probe zu messen. In dieser Studie wurden periguronadales Fettgewebe und menschliches Plasma der Maus als Quelle für EVs verwendet. EVs, die aus anderen Geweben oder biologischen Flüssigkeiten wie Serum, Urin, Speichel, Muttermilch, Fruchtwasser und Zellkulturüberstand isoliert wurden, können je...

Extrazelluläre Vesikel (EVs) sind kleine (0,03-2 μm) membrangebundene Vesikel, die von fast allen Zelltypen abgesondert werden1. Sie werden oft als "Exosomen", "Mikrovesikel" oder "apoptotische Körper" bezeichnet, abhängig von ihrem Freisetzungsmechanismus und ihrer Größe2. Während man anfangs dachte, dass EVs nur ein Mittel sind, um Abfälle aus der Zelle zu entfernen, um die Homöostaseaufrechtzuerhalten 3,wissen wir jetzt, dass sie auch an der interzellulären Kommunikation durch Transfer von molekularem Material - einschließlich DNA, RNA (mRNA, microRNA), Lipiden und Proteinen4,5 - teilnehmen können und dass sie wichtige Regulatoren der normalen Physiologie sowie pathologischer Prozesse sind1. 5,6,7,8.
Es gibt viele verschiedene Methoden zur Isolierung und Quantifizierung von EVs, die an anderer Stelle beschrieben wurden9,10,11,12. Das verwendete Isolationsprotokoll sowie die Quelle von Elektrofahrzeugen können die EV-Ausbeute und -Reinheit stark beeinflussen. Selbst die differentielle Zentrifugation, die lange als "Goldstandard" -Ansatz für die Exosomenisolierung galt, kann einer erheblichen Variabilität unterliegen, die sich anschließend auf die erhaltene EV-Population und die nachgelagerten Analysen auswirkt13. Daher erschweren die verschiedenen Methoden zur Isolierung und Quantifizierung von Elektrofahrzeugen den Vergleich, die Reproduktion und die Interpretation der Ergebnisse von Experimenten, die in der Literaturberichtet wurden 14. Darüber hinaus kann die EV-Freisetzung durch zelluläre Bedingungen oder verschiedene externe Faktoren reguliert werden. Es wurde vorgeschlagen, dass EVs eine Rolle bei der Aufrechterhaltung der zellulären Homöostase spielen, indem sie Zellen vor intrazellulärem Stressschützen 15, da mehrere Studien gezeigt haben, dass zellulärer Stress die EV-Sekretion stimuliert. Zum Beispiel wurde eine erhöhte EV-Freisetzung nach zellulärer Exposition gegenüber Hypoxie, endoplasmatischem Retikulumstress, oxidativem Stress, mechanischem Stress, Zigarettenrauchextrakt und Feinstaubluftverschmutzung berichtet16,17,18,19,20,21,22. Es wurde auch gezeigt, dass die EV-Freisetzung in vivo modifiziert wurde; Mäuse, die sechzehn Stunden lang einer fettreichen Diät oder einem Fasten unterzogen wurden, setzten mehr Adipozyten-EVsfrei 23. Um zu untersuchen, ob eine bestimmte Behandlung oder bedingung die Ev-Freisetzung verändert, muss die Anzahl der EVs genau bestimmt werden. Die Beurteilung der EV-Größenverteilung kann auch auf den vorherrschenden subzellulären Ursprung von EVs hinweisen (z. B. Fusion von späten Endosomen / multivesikulären Körpern mit der Plasmamembran vs. Knospung der Plasmamembran)24. Daher besteht ein Bedarf an robusten Methoden, um die Gesamtkonzentration und die Größenverteilung des untersuchten EV-Preps genau zu messen.
Eine schnelle und hochempfindliche Methode zur Visualisierung und Charakterisierung von Elektrofahrzeugen in Lösung ist die Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA). Eine detaillierte Erläuterung der Prinzipien dieser Methode und der Vergleich mit alternativen Methoden zur Beurteilung der EV-Größe und -Konzentration wurden zuvor beschrieben25,26,27,28. Kurz gesagt, während der NTA-Messung werden EVs durch das Licht visualisiert, das gestreut wird, wenn sie mit einem Laserstrahl bestrahlt werden. Das Streulicht wird von einem Mikroskop auf eine Kamera fokussiert, die die Partikelbewegung aufzeichnet. Die NTA-Software verfolgt die zufällige thermische Bewegung jedes Teilchens, bekannt als Brownsche Bewegung, um den Diffusionskoeffizienten zu bestimmen, der verwendet wird, um die Größe jedes Teilchens mit der Stokes-Einstein-Gleichung zu berechnen. NTA wurde erstmals 2011 zur Messung von Elektrofahrzeugen in einer biologischen Probe angewendet25. Bis vor kurzem gab es nur zwei Mainstream-Unternehmen, die kommerzielle NTA-Instrumente29 anboten, bis zur Einführung des ViewSizer 3000 (im Folgenden als Partikelverfolgungsinstrument bezeichnet), das eine Kombination aus neuartigen Hardware- und Softwarelösungen verwendet, um erhebliche Einschränkungen anderer NTA-Techniken zu überwinden.
Das Partikelverfolgungsinstrument charakterisiert Nanopartikel in flüssigen Proben durch Analyse ihrer Brownschen Bewegung und charakterisiert größere mikrometergroße Partikel durch Analyse der Gravitationsablagerung. Das einzigartige optische System dieses Instruments, das eine multispektrale Beleuchtung mit drei Laserlichtquellen (bei 450 nm, 520 nm und 635 nm) umfasst, ermöglicht es den Forschern, eine Vielzahl von Partikelgrößen (z. B. Exosomen, Mikrovesikel) gleichzeitig zu analysieren. Ein Schema des Geräteaufbaus ist in Abbildung 1 dargestellt.
Hier zeigen wir, wie man Partikelgrößenverteilungs- und Konzentrationsmessungen von isolierten Maus- und Human-EVs mit einem neuartigen NTA-Instrument durchführt.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62447/62447fig01.jpg"> Abbildung 1:Optisches System des Partikelverfolgungsinstruments. Das NTA-Instrument beleuchtet Partikel mit drei Lasern mit folgenden Wellenlängen: 450 nm, 520 nm, 635 nm. Die Videoaufzeichnung des Streulichts einzelner Partikel wird von einer digitalen Videokamera, die 90° von der Küvette ausgerichtet ist, detektiert und verfolgt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62447/62447fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

<table><tbody><tr><td>1X dPBS</td><td>VWR</td><td>02-0119-1000</td><td>Zum Verdünnen von Proben</td></tr><tr><td>100 nm Kügelchenstandard</td><td>Thermo Scientific</td><td>3100A</td><td>Zum Testen der ViewSizer 3000 Kalibrierung</td></tr><tr><td>400 nm Kügelchenstandard</td><td>Thermo Scientific</td><td>3400A</td><td>Zum Testen der ViewSizer 3000</td></tr><tr><td>Zentrifugalfiltereinheit</td><td>Amicon</td><td>UFC901024</td><td>Zum Filtern von PBS Verdünnungsmittel</td></tr><tr><td>Sammelröhrchen, 2 mL</td><td>Qiagen</td><td>19201</td><td>Zur Isolierung von extrazellulären Vesikeln im menschlichen Plasma</td></tr><tr><td>Druckluft-Staubwedel</td><td>DustOff</td><td>DPSJB-12</td><td>Zum Reinigen von Küvetteneinsatz</td></tr><tr><td></td><td>HORIBA</td> <td>Scientific-Bereitgestellt</td> <td>mit dem Kauf von ViewSizer 3000</td></tr><tr><td>Küvettenvorrichtung</td><td>HORIBA Scientific-Zum</td><td></td> <td>Ausrichten des magnetischen Rührstabs beim Platzieren der Einsätze in der Küvette; Geliefert mit dem Kauf von ViewSizer 3000</td></tr><tr><td>De-ionisiertes Wasser</td><td>VWR</td><td>02-0201-1000</td><td>Zum Reinigen von Küvetten</td></tr><tr><td>Desktop-Computer mit Monitor, Tastatur, Maus und allen erforderlichen Kabeln</td><td></td> <td>Dell-Bereitgestellt</td> <td>beim Kauf von ViewSizer 3000</td></tr><tr><td>Ethanol (70-100%)</td><td>Millipore</td> <td>Sigma-Zum</td> <td>Reinigen von Küvetten</td></tr><tr><td>ExoQuick ULTRA</td><td>System Biosciences</td><td>EQULTRA-20A-1</td><td>Zur Isolierung von extrazellulären Vesikeln im menschlichen Plasma</td></tr><tr><td>Glasszintillationsfläschchen mit Deckel</td><td>Thermo Scientific</td><td>B780020</td><td>Zur Reinigung von Küvetten</td></tr><tr><td>"Hook" Werkzeug</td><td>Excelta-Geliefert</td><td></td> <td>mit dem Kauf von ViewSizer 3000</td></tr><tr><td>Fusselfreies Mikrofasertuch</td><td>Texwipe</td><td>TX629</td><td>Zum Reinigen von Küvetten und zum Abdecken der Arbeitsfläche</td></tr><tr><td>Mikrozentrifugenröhrchen, 2 mL</td><td>Eppendorf</td><td>22363344</td><td>Zur Isolierung von extrazellulären Vesikeln im menschlichen Plasma</td></tr><tr><td>Rührstab</td><td>Sp Scienceware</td><td>F37119-0005</td><td></td></tr><tr><td>Suprasil Quarzküvette mit Kappe</td><td>Agilent Technologies</td><td>AG1000-0544</td><td>Ursprünglich mit dem Kauf von ViewSizer 3000</td></tr><tr><td>geliefert ViewSizer 3000</td><td>HORIBA Scientific-Nanoparticle</td><td></td> <td>Tracking Instrument</td></tr></tbody></table>

nanopartikel-tracking-analyse zur quantifizierung und größenbestimmung extrazellulärer vesikel

Nanoparticle Tracking Analysis for the Quantification and Size Determination of Extracellular Vesicles

Die physiologischen und pathophysiologischen Rollen extrazellulärer Vesikel (EVs) werden zunehmend anerkannt, was das EV-Feld zu einem sich schnell entwickelnden Forschungsgebiet macht. Es gibt viele verschiedene Methoden zur Isolierung von Elektrofahrzeugen, die jeweils unterschiedliche Vor- und Nachteile haben, die sich auf die nachgelagerte Ausbeute und Reinheit von Elektrofahrzeugen auswirken. Daher ist die Charakterisierung der EV-Vorbereitung, die aus einer bestimmten Quelle durch eine gewählte Methode isoliert wurde, wichtig für die Interpretation der nachgelagerten Ergebnisse und den Vergleich der Ergebnisse zwischen Labors. Es gibt verschiedene Methoden zur Bestimmung der Größe und Menge von Elektrofahrzeugen, die durch Krankheitszustände oder als Reaktion auf äußere Bedingungen verändert werden können. Die Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA) ist eine der führenden Technologien für die Hochdurchsatzanalyse einzelner Elektrofahrzeuge. Hier präsentieren wir ein detailliertes Protokoll zur Quantifizierung und Größenbestimmung von EVs, die aus periguronadalem Fettgewebe und menschlichem Plasma der Maus isoliert wurden, wobei eine bahnbrechende Technologie für NTA verwendet wurde, die große Fortschritte auf diesem Gebiet darstellt. Die Ergebnisse zeigen, dass diese Methode reproduzierbare und valide Daten zur Gesamtpartikelkonzentration und -größenverteilung für EVs liefern kann, die mit verschiedenen Methoden aus verschiedenen Quellen isoliert wurden, wie durch die Transmissionselektronenmikroskopie bestätigt. Die Anpassung dieses Instruments an NTA wird die Notwendigkeit einer Standardisierung von NTA-Methoden adressieren, um die Strenge und Reproduzierbarkeit in der EV-Forschung zu erhöhen.

Vor dieser Demonstration wurde zunächst die Kalibrierung des Instruments getestet, um die Gültigkeit der erfassten Daten durch Messung der Größenverteilung von Polystyrolperlenstandards sicherzustellen. Wir haben die Größenverteilung von 100 nm und 400 nm Perlen mit den Standardaufzeichnungsparametern und den in diesem Protokoll empfohlenen Verarbeitungseinstellungen getestet (Abbildung 8).
Für den 100 nm Polystyrolperlenstandard wurde eine Konzentration von 4,205...

Wir zeigen, wie man ein neuartiges Nanopartikel-Tracking-Analyseinstrument verwendet, um die Größenverteilung und Gesamtpartikelkonzentration von extrazellulären Vesikeln abzuschätzen, die aus dem periigonadalen Fettgewebe der Maus und dem menschlichen Plasma isoliert wurden.

Nanopartikel-Tracking-Analyse zur Quantifizierung und Größenbestimmung extrazellulärer Vesikel

The physiological and pathophysiological roles of extracellular vesicles (EVs) have become increasingly recognized, making the EV field a quickly evolving ...

NTA-Ergebnisse sind sehr anfällig für Bedienerverzerrungen. Dieses Protokoll demonstriert die Auswirkungen veränderter NTA-Parameter auf die erzielten Ergebnisse. Eine standardisierte Methode wird dazu beitragen, die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit der NTA-Analyse zu erhöhen.Durch die Analyse der Probe in einer Küvette kann in jedem Video eine statistisch zufällige Stichprobe erfasst werden. Dies führt zu reproduzierbareren Daten und der Visualisierung von Partikeln über einen breiten Größenbereich. Da es schwierig sein kann, eine Probe im empfohlenen Partikelkonzentrationsbereich zu erhalten, sollten Sie unbedingt eine serielle Verdünnung durchführen, um den idealen Verdünnungsfaktor zu identifizieren.Demonstriert wird das Verfahren von Kungheng Cai, einem Doktoranden aus anthony Ferrantes Labor. Um die Küvette für die Analyse der Nanopartikelverfolgung vorzubereiten, bedecken Sie den Arbeitsbereich mit einem fusselfreien Material, um zu verhindern, dass Fasern in die Küvetten gelangen. Legen Sie mit Handschuhen eine Küvette mit einem Rührstab auf die magnetische Küvettenvorrichtung.Verwenden Sie ein Hakenwerkzeug, um den Einsatz in die Küvette zu legen, wobei die Keiler des Ei

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

In diesem Artikel wird eine Methode zur Isolierung von Exosomen aus Vollblut und zur weiteren Analyse durch Nanopartikel-Tracking mit einem halbautomatischen Instrument vorgestellt. Die vorgestellte Technologie bietet eine äußerst empfindliche Methode zur Visualisierung und Analyse von Partikeln in flüssiger Suspension.

Eine innovative Methode zur Quantifizierung und Exosom Size Measurement

Extrazellulären Vesikeln spielen eine wichtige Rolle in physiologischen und pathologischen Prozessen, einschließlich Gerinnung, Immunreaktionen und Krebs oder als potentielle therapeutische Mittel bei der Arzneimittelabgabe oder der regenerativen Medizin. Dieses Protokoll stellt Methoden zur Quantifizierung und Charakterisierung von Größe isoliert und nicht-isoliert extrazellulären Vesikeln in verschiedenen Flüssigkeiten mit abstimmbaren Widerstandspulsmessung.

Quantifizierung und Größe-Profilierung der extrazellulären Vesikeln Mit Tunable Resistive Pulse Sensing

In diesem Protokoll beschreiben wir den kompletten Workflow für die schnelle Isolierung von extrazellulären Vesikeln aus menschlichen Vollblut und Charakterisierung spezifischer Marker durch Fluoreszenz-basierte Nanopartikel-Tracking-Analyse. Die vorgestellten Ergebnisse zeigen ein hohes Maß an Reproduzierbarkeit und Zelle Kultur Überstände angepasst werden können.

Rasche Fluoreszenz basierende Charakterisierung der einzelnen extrazelluläre Vesikel im menschlichen Blut mit Nanopartikel-Tracking Analyse

Das Protokoll beschreibt eine reproduzierbare Methode zur Verwendung mit Zelle Kultur Überstände, Oberfläche Epitope auf kleine extrazelluläre Vesikel (EV) zu erkennen. Es nutzt spezifische EV Immunopräzipitation mit Perlen mit Antikörpern, die Oberflächenantigen CD9, erkennen CD63 und CD81 gekoppelt. Die Methode ist für nachgeschaltete Flow Cytometry Analyse optimiert.

Fließen Sie durchflusszytometrischen Analyse der extrazellulären Vesikel aus Zelle konditioniertes Medien

Die Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) ist eine weit verbreitete Methode zur Charakterisierung extrazellulärer Vesikel. Dieses Papier hebt NTA-experimentelle Parameter und Kontrollen sowie eine einheitliche Methode zur Analyse und Charakterisierung von Proben und Verdünnungsmitteln hervor, die notwendig ist, um die von MISEV2018 und EV-TRACK vorgeschlagenen Richtlinien für die Reproduzierbarkeit zwischen Laboratorien zu ergänzen.

Verbesserung der Reproduzierbarkeit, um minimale Informationen für Studien zu extrazellulären Vesikeln zu erfüllen Richtlinien 2018 in der Nanopartikel-Tracking-Analyse

Die neueste Generation von EV-Charakterisierungswerkzeugen ist in der Lage, eine einzelne EV-Analyse über mehrere Parameter gleichzeitig durchzuführen. Die Nano-Durchflusszytometrie misst alle biologischen Partikel größer als 45 nm ohne Markierung und identifiziert spezifische Eigenschaften von Subpopulationen durch eine Vielzahl von fluoreszierenden Markierungstechniken.

Charakterisierung einzelner extrazellulärer Vesikel-Transmembranproteine mittels Nano-Durchflusszytometrie

In diesem Artikel wird eine neue Generation multiparametrischer Analyseplattformen mit erhöhtem Durchsatz für die Charakterisierung von extrazellulären Vesikel-Untergruppen vorgeschlagen. Die Methode basiert auf einer Kombination von gemultiplexten Biosensormethoden mit metrologischen und morphomechanischen Analysen durch Rasterkraftmikroskopie, gekoppelt mit Raman-Spektroskopie, um vesikuläre Ziele zu qualifizieren, die auf einem Microarray-Biochip gefangen sind.

Multimodale Analyseplattform auf einem Multiplex-Oberflächenplasmonen-Resonanztomographie-Chip zur Analyse extrazellulärer Vesikel-Untergruppen

Dieses Protokoll bietet eine schnelle und größenspezifische Isolationsmethode für kleine extrazelluläre Vesikel, indem die Größe der Luftsprühdüse, der Mantelflüssigkeitsdruck, der Probenflussdruck, die Spannung, die Verstärkung und die Auslöseschwellenparameter optimiert werden.

Optimierung der durchflusszytometrischen Sortierparameter für die Hochdurchsatzisolierung und Aufreinigung kleiner extrazellulärer Vesikel

Dieser Artikel beschreibt eine Methodik zur Isolierung, Charakterisierung und Quantifizierung von extrazellulären Vesikeln (EV) aus humanem Plasma und stellt einen Arbeitsablauf für die markierungsfreie Analyse des EV-Proteoms mittels Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) vor.

Isolierung, Charakterisierung und proteomische Analyse von aus Plasma gewonnenen extrazellulären Vesikeln zur Entdeckung kardiovaskulärer Biomarker

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung kleiner extrazellulärer Vesikel aus Mausskelettmuskeln und Knochenmark mittels enzymatischer Verdauung und Größenausschlusschromatographie, wodurch reproproduzierbare Rückgewinnung von vesikelangereicherten Fraktionen aus strukturell komplexen, leistungsarmen Geweben für die nachgelagerte molekulare Analyse ermöglicht wird.

Isolierung kleiner extrazellulärer Vesikel aus Mausskelettmuskulatur und Knochenmark mittels Größenausschlusschromatographie

Erfahren Sie die standardisierte Nanopartikel-Tracking-Analyse zur Quantifizierung und Größenbestimmung extrazellulärer Vesikel. Diese Methode erhöht die Reproduzierbarkeit und minimiert Operatorenfehler in der EV-Forschung.

Nanopartikel-Tracking-Analyse zur Quantifizierung und Größenbestimmung extrazellulärer Vesikel

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