Name: Verwendung von Organkulturen vom Trowell-Typ zur Untersuchung der Regulation von dentalen Stammzellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-08T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 22 s
Description: Lernen Sie die Trowell-Organkulturmethode zur Untersuchung dentaler Stammzellen in der Mausinzisivus-Nische. Dieses Protokoll ermöglicht Live-Imaging und Screening regulatorischer Moleküle für Stammzellforschung.

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Diese Studie wurde von der Jane and Aatos Erkko Foundation unterstützt.

Dieses Protokoll beinhaltet die Verwendung von Tieren und alle Verfahren wurden von den Ethikkommissionen für die Verwendung und Pflege von Tieren und der Tiereinrichtung der Universität Helsinki genehmigt.
1. Zubereitung der Organkulturschale
<ol><li>Führen Sie alle Verfahren in einer Laminar-Flow-Haube durch. Reinigen Sie Arbeitsflächen mit 70% Ethanol und verwenden Sie Instrumente und Lösungen aus autoklaviertem Glas. Sterilisieren Sie Scheren und andere Metallgeräte in einem Glasperlensterilisator.</li>
	<li>Bereiten Sie Filter vor, die normalerweise in 70% Ethanol gelagert werden, indem Sie sie dreimal in 1x PBS waschen, um Ethanol zu entfernen (Abbildung 1). Filter in rechteckige Stücke schneiden (3 x 3-5 x 5 mm). HINWEIS: Gewaschene Filterstücke können mehrere Tage in 1x PBS bei 4 °C gelagert werden.</li>
	<li>Das Kulturmedium wird vorbereitet (1:1 DMEM:F12 ergänzt mit 1% [v/v] 200 mM L-Alanyl-L-glutamin-Dipeptid in 0,85% NaCl, 10% [v/v] FBS, 150 μg/ml Ascorbinsäure und 0,2% [v/v] Penicillin [10.000 I.U./ml] und Streptomycin [10.000 μg/ml]). Bei 4 °C lagern.</li>
	<li>Legen Sie die 30 mm Metallgitter (mit Löchern mit 1-2 mm Durchmesser, die die Gewebebildgebung ermöglichen) in eine 35 mm große Petrischale. Fügen Sie genügend Medien hinzu, um die Gitteroberfläche zu erreichen, ohne Luftblasen zu erzeugen. Die vorbereitete Kulturschale bei 37 °C vorwärmen, bis das Gewebe isoliert und kulturbereit ist (in einem Standard-Inkubator mit 5%CO2 und 90%-95% Feuchtigkeit).</li>
</ol>2. Inzistordissektion und Isolierung des proximalen Endes
<ol><li>Opfern Sie die Tiere nach einem genehmigten Tierpflegeprotokoll.</li>
	<li>Enthaupte die Maus und seziere den Unterkiefer. Entfernen Sie dazu zuerst die Haut, um den Unterkiefer freizulegen, und schneiden Sie durch die Massetermuskeln, um sie vom Oberkiefer und dem Rest des Kopfes zu trennen.</li>
	<li>Sobald der Unterkiefer isoliert ist, entfernen Sie die Zunge und so viel Weichgewebe wie möglich.</li>
	<li>Sammeln Sie alle Unterkiefer und bewahren Sie sie in einer Petrischale auf, die PBS auf Eis enthält, da dies die Lebensfähigkeit des Gewebes verbessert.</li>
	<li>Bringen Sie einen Unterkiefer in eine Glas-Petrischale und verwenden Sie Einweg-20/26 G Injektionsnadeln, um den Schneidezahn unter einem Stereomikroskop zu sezieren. Teilen Sie den Unterkiefer an der Mittellinie und schneiden Sie durch die Symphyse. Reinigen Sie das Weich- und Muskelgewebe von der Knochenoberfläche weg, um eine bessere Visualisierung zu ermöglichen. HINWEIS: Eine Glas-Petrischale ist unerlässlich, da dies die Nadeln nicht abstumpft.</li>
	<li>Unterkiefer von Tieren, die jünger als 10 Tage sind, sind weicher und zerbrechlicher, daher verwenden Sie Einweg-20/26 G-Injektionsnadeln, um jede Hälfte des Unterkiefers längs zu öffnen, um den Schneidezahn freizulegen. Verwenden Sie bei Mäusen, die älter als 10 Tage sind, eine Pinzette, um den Unterkiefer zu greifen und den Knochen zu brechen, um den Zahn freizulegen.</li>
	<li>Lösen Sie den Schneidezahn vorsichtig vom umgebenden Knochen und schneiden Sie das proximale Ende ab, das die Zervixschlinge enthält.</li>
	<li>Schneiden Sie das proximale Ende ab und entfernen Sie den mineralisierten Zahnschmelz und die Dentinmatrix.</li>
	<li>Bewahren Sie die gesammelten proximalen Enden in Dulbeccos PBS auf Eis, bis sie für die Kultur bereit sind.</li>
</ol>3. Kultur
<ol><li>Platzieren Sie vorsichtig ein Filterrechteck auf der Oberseite eines Gitters in einer vorgewärmten Kulturschale.</li>
	<li>Verwenden Sie ein Stereomikroskop, um die Gewebestücke richtig auszurichten.</li>
	<li>In einen Standard-Inkubator bei 37 °C mit 5%CO2 und 90%-95% Luftfeuchtigkeit geben.</li>
	<li>Wechseln Sie das Medium jeden zweiten Tag und ersetzen Sie es durch frisches Medium, wobei die Bildung von Luftblasen sorgfältig vermieden wird. Überwachen Sie das Gewebewachstum und fotografieren Sie täglich mit einer Kamera, die am Stereomikroskop befestigt ist.</li>
</ol>4. Hinzufügen löslicher Faktoren zur Kultur
<ol><li>Ergänzen Sie das Kulturmedium mit löslichen Faktoren und Molekülen von Interesse, um ihre Wirkung auf die Regulation von SCs zu untersuchen. HINWEIS: Das Verabreichungsprotokoll für jedes Molekül (Wachstumsfaktoren, Signalmoleküle, blockierende Antikörper, pharmakologische Verbindungen wie Inhibitoren oder Aktivatoren, Vektoren usw.) hängt von seiner Halbwertszeit und Löslichkeit ab. Diese Parameter bestimmen auch die geeignete Steuerung.</li>
</ol>5. Molekulare und histologische Analysen
<ol><li>Entfernen Sie das Kulturmedium.</li>
	<li>Fügen Sie vorsichtig eiskaltes Methanol zu den Geweben hinzu, um ein Ablösen von den Filtern zu verhindern.</li>
	<li>Methanol 5 min einwirken lassen.</li>
	<li>Transferfilter, die Gewebeexplantate transportieren, in Probenahmeröhrchen.</li>
	<li>Die Explantate in 4% Paraformaldehyd in PBS für 10-24 h bei 4 °C fixieren.</li>
	<li>Fahren Sie mit etablierten Protokollen für die histologische Verarbeitung (Paraffin, gefroren usw.) oder Immunfärbungen fort.</li>
</ol>6. Kultur von Gewebeschnitten
HINWEIS: Es gibt mehrere Variationen dieses Protokolls, die alle gleichermaßen erfolgreich sind und eine Frage der persönlichen Wahl sind, abhängig von der Geschwindigkeit und den Fähigkeiten des Benutzers. Diese beziehen sich auf den Puffer, der verwendet wird, um die Lebensfähigkeit des Gewebes zu sammeln und zu erhalten. Zu diesem Zweck können Krebspuffer, PBS ergänzt mit 2% Glukose und Antibiotika oder PBS verwendet werden. Wenn Krebspuffer verwendet wird, sollte er 1 Tag im Voraus hergestellt und bei 4 ° C gehalten werden.
<ol><li>Vor dem Versuch 4%-5% Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt vorbereiten, indem 2-2,5 g Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt in 50 ml siedender 2% Glucose/PBS gelöst werden, wonach die Lösung in ein 45 °C warmes Wasserbad gegeben werden sollte.</li>
	<li>Vibratom aufstellen, mit 70% Ethanol waschen und mit eiskaltem 2% Glukose / PBS füllen, ergänzt mit Antibiotika (100 U / ml Penicillin, 100 mg / ml Streptomycin).</li>
	<li>Sezieren Sie die proximalen Enden des Schneidezahns und sammeln Sie sie in der eiskalten 2% Glukose / PBS ergänzt mit Antibiotika.</li>
	<li>Legen Sie ein proximales Ende des Schneidezahns in die Form, die 4% -5% Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt enthält. Richten Sie das Stück unter einem Stereomikroskop in die gewünschte Richtung aus und lassen Sie es auf Eis, damit die Agarose aushärten kann.</li>
	<li>Schneiden Sie den gehärteten Agaroseblock ab und legen Sie ihn in den Vibratom. Dicke Scheiben schneiden (150-300 μm).</li>
	<li>Sammeln Sie die Scheiben in einer Petrischale mit eiskalter 2% Glukose / PBS, ergänzt mit Antibiotika.</li>
	<li>Die dicken Scheiben werden mit einem Spatel auf ein Filterrechteck übertragen, das auf dem gemäß Abschnitt 1.3 vorbereiteten vorgewärmten Gitter platziert ist.</li>
	<li>Inkubieren Sie die dicken Scheiben im Inkubator und fahren Sie mit der Bildgebung fort (Abbildung 2).</li>
</ol>

<ol><li>Balic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+explaining+tooth+repair+and+regeneration%3A+A+mini-review%5BTitle%5D)+AND+%22Gerontology%22%5BJournal%5D)">Biology explaining tooth repair and regeneration: A mini-review.</a> Gerontology. 64 (4), 382-388 (2018).</li>
<li>Harada, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+putative+stem+cells+in+dental+epithelium+and+their+association+with+Notch+and+FGF+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Localization of putative stem cells in dental epithelium and their association with Notch and FGF signaling.</a> The Journal of Cell Biology. 147 (1), 105-120 (1999).</li>
<li>Smith, C. E., Warshawsky, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+renewal+in+the+enamel+organ+and+the+odontoblast+layer+of+the+rat+incisor+as+followed+by+radioautography+using+3H-thymidine%5BTitle%5D)+AND+%22The+Anatomical+Record%22%5BJournal%5D)">Cellular renewal in the enamel organ and the odontoblast layer of the rat incisor as followed by radioautography using 3H-thymidine.</a> The Anatomical Record. 183 (4), 523-561 (1975).</li>
<li>Balic, A., Thesleff, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+interactions+regulating+tooth+development+and+renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Tissue interactions regulating tooth development and renewal.</a> Current Topics in Developmental Biology. 115, 157-186 (2015).</li>
<li>Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+stem-cell+niche+as+an+entity+of+action%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The stem-cell niche as an entity of action.</a> Nature. 441 (7097), 1075-1079 (2006).</li>
<li>Juuri, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox2+marks+epithelial+competence+to+generate+teeth+in+mammals+and+reptiles%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Sox2 marks epithelial competence to generate teeth in mammals and reptiles.</a> Development. 140 (7), 1424-1432 (2013).</li>
<li>Juuri, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox2%2B+stem+cells+contribute+to+all+epithelial+lineages+of+the+tooth+via+Sfrp5%2B+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Sox2+ stem cells contribute to all epithelial lineages of the tooth via Sfrp5+ progenitors.</a> Developmental Cell. 23 (2), 317-328 (2012).</li>
<li>Feng, J., Mantesso, A., De Bari, C., Nishiyama, A., Sharpe, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+origin+of+mesenchymal+stem+cells+contributing+to+organ+growth+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Dual origin of mesenchymal stem cells contributing to organ growth and repair.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (16), 6503-6508 (2011).</li>
<li>Kaukua, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+origin+of+mesenchymal+stem+cells+in+a+tooth+model+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Glial origin of mesenchymal stem cells in a tooth model system.</a> Nature. 513 (7519), 551-554 (2014).</li>
<li>Zhao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretion+of+shh+by+a+neurovascular+bundle+niche+supports+mesenchymal+stem+cell+homeostasis+in+the+adult+mouse+incisor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Secretion of shh by a neurovascular bundle niche supports mesenchymal stem cell homeostasis in the adult mouse incisor.</a> Cell Stem Cell. 14 (2), 160-173 (2014).</li>
<li>Vidovic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((alphaSMA-expressing+perivascular+cells+represent+dental+pulp+progenitors+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dental+Research%22%5BJournal%5D)">alphaSMA-expressing perivascular cells represent dental pulp progenitors in vivo.</a> Journal of Dental Research. 96 (3), 323-330 (2017).</li>
<li>Trowell, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+technique+for+organ+culture+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">A modified technique for organ culture in vitro.</a> Experimental Cell Research. 6 (1), 246-248 (1954).</li>
<li>Saxen, L., Vainio, T., Toivonen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+polyoma+virus+on+mouse+kidney+rudiment+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+National+Cancer+Institute%22%5BJournal%5D)">Effect of polyoma virus on mouse kidney rudiment in vitro.</a> Journal of the National Cancer Institute. 29, 597-631 (1962).</li>
<li>Thesleff, I., Sahlberg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+culture+in+the+analysis+of+tissue+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Organ culture in the analysis of tissue interactions.</a> Methods in Molecular Biology. 461, 23-30 (2008).</li>
<li>Jarvinen, E., Shimomura-Kuroki, J., Balic, A., Jussila, M., Thesleff, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+Wnt%2Fbeta-catenin+signaling+limits+tooth+number%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal Wnt/beta-catenin signaling limits tooth number.</a> Development. 145 (4), (2018).</li>
<li>Ahtiainen, L., Uski, I., Thesleff, I., Mikkola, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+epithelial+signaling+center+governs+tooth+budding+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Early epithelial signaling center governs tooth budding morphogenesis.</a> The Journal of Cell Biology. 214 (6), 753-767 (2016).</li>
<li>Narhi, K., Thesleff, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Explant+culture+of+embryonic+craniofacial+tissues%3A+analyzing+effects+of+signaling+molecules+on+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Explant culture of embryonic craniofacial tissues: analyzing effects of signaling molecules on gene expression.</a> Methods in Molecular Biology. 666, 253-267 (2010).</li>
<li>Yang, Z., Balic, A., Michon, F., Juuri, E., Thesleff, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+Wnt%2Fbeta-Catenin+signaling+controls+epithelial+stem+cell+homeostasis+in+teeth+by+inhibiting+the+antiapoptotic+effect+of+Fgf10%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal Wnt/beta-Catenin signaling controls epithelial stem cell homeostasis in teeth by inhibiting the antiapoptotic effect of Fgf10.</a> Stem Cells. 33 (5), 1670-1681 (2015).</li>
<li>Binder, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionally+distinctive+Ptch+receptors+establish+multimodal+hedgehog+signaling+in+the+tooth+epithelial+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Functionally distinctive Ptch receptors establish multimodal hedgehog signaling in the tooth epithelial stem cell niche.</a> Stem Cells. 37 (9), 1238-1248 (2019).</li>
<li>Harada, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+putative+stem+cells+in+dental+epithelium+and+their+association+with+Notch+and+FGF+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Localization of putative stem cells in dental epithelium and their association with Notch and FGF signaling.</a> The Journal of Cell Biology. 147 (1), 105-120 (1999).</li>
<li>Seidel, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog+signaling+regulates+the+generation+of+ameloblast+progenitors+in+the+continuously+growing+mouse+incisor%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Hedgehog signaling regulates the generation of ameloblast progenitors in the continuously growing mouse incisor.</a> Development. 137 (22), 3753-3761 (2010).</li>
<li>Hadjantonakis, A. K., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FACS+for+the+isolation+of+individual+cells+from+transgenic+mice+harboring+a+fluorescent+protein+reporter%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">FACS for the isolation of individual cells from transgenic mice harboring a fluorescent protein reporter.</a> Genesis. 27 (3), 95-98 (2000).</li>
<li>Yu, Y. A., Szalay, A. A., Wang, G., Oberg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+molecular+and+cellular+events+with+green+fluorescent+proteins+in+developing+embryos%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Luminescence%22%5BJournal%5D)">Visualization of molecular and cellular events with green fluorescent proteins in developing embryos: a review.</a> Luminescence. 18 (1), 1-18 (2003).</li>
<li>D'Amour, K. A., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+functional+differences+between+multipotent+neural+and+pluripotent+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Genetic and functional differences between multipotent neural and pluripotent embryonic stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, Suppl 1 11866-11872 (2003).</li>
<li>Chavez, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+dental+epithelial+stem+cells+from+the+adult+mouse+incisor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of dental epithelial stem cells from the adult mouse incisor.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), (2014).</li>
<li>Binder, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+strategies+for+expansion+of+tooth+epithelial+stem+cells+and+ameloblast+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Novel strategies for expansion of tooth epithelial stem cells and ameloblast generation.</a> Science Reports. 10 (1), 4963(2020).</li>
</ol>

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

In-vitro-Organkultur wurde ausgiebig verwendet, um induktives Potenzial und epithelial-mesenchymale Wechselwirkungen zu untersuchen, die das Organwachstum und die Morphogenese steuern. Das Thesleff-Labor hat gezeigt, wie die Saxén-Modifikation der Organkultur vom Trowell-Typ angepasst und zur Untersuchung der Zahnentwicklung verwendet werden kann14. Die reproduzierbaren Bedingungen und Fortschritte bei fluoreszierenden Reportern haben dies zu einer nützlichen Methode zur Überwachung der Z...

Mausschneidezähne wachsen kontinuierlich aufgrund der lebenslangen Erhaltung der Stammzellen (SC), die die unaufhörliche Produktion von Zahnkomponenten unterstützen. Dazu gehören epitheliale SCs, die unter anderem schmelzproduzierende Ameloblasten erzeugen, und mesenchymale Stammzellen (MSCs), die Dentin produzierende Odontoblasten erzeugen1. Die epithelialen SCs in den kontinuierlich wachsenden Schneidezähnen wurden zunächst als markierungserhaltende Zellen2,3 identifiziert und es wurde seitdem gezeigt, dass sie eine Reihe bekannter Stammnessgene, einschließlich Sox24, exprimieren. Diese Zellen teilen gemeinsame Merkmale mit epithelialen SCs in anderen Organen und befinden sich in der SC-Nische, die als zervikale Schleife auf der labialen Seite des Schneidezahns bezeichnet wird. Die Nische ist eine dynamische Einheit, die aus Zellen und extrazellulärer Matrix besteht, die die SC-Aktivitätsteuern 5. Studien zur Linienverfolgung haben gezeigt, dass Sox2+ epitheliale SCs das gesamte Epithelkompartiment des Zahnes regenerieren können und dass sie für die Sukzessionszahnbildung entscheidend sind 6,7. MSCs mit reparativem oder regenerativem Dentinpotenzial werden größtenteils von außerhalb des Organs über Blutgefäße und Nerven 8,9,10,11 rekrutiert und bieten daher ein geeignetes Modell zur Untersuchung der Rekrutierung, Migration und Unterbringung der MSC-Population.
Die Untersuchung von SCs in vivo ist nicht immer möglich, da viele der genetischen und/oder pharmakologischen Manipulationen die Organhomöostase beeinträchtigen und/oder tödliche Folgen haben können. Daher bietet die Organkultur ein hervorragendes Werkzeug, um die Regulation von SCs und ihren Nischen in vitro zu untersuchen. Das Organkultursystem, das ein Metallgitter verwendet, wurde ursprünglich von Trowell12 entwickelt, um die Organentwicklung zu untersuchen, und wurde von Saxen13 weiter modifiziert, um induktive Signale in der Nierenentwicklung zu untersuchen. Seitdem wird diese In-vitro-Methode zur Kultivierung des gesamten oder eines Teils des Organs in verschiedenen Bereichen erfolgreich angewendet. Im Bereich der Zahnentwicklung wurde diese Methode häufig verwendet, um die epithelial-mesenchymalen Wechselwirkungen zu untersuchen, die die Zahnentwicklung14 und die Sukzessionszahnbildung15 steuern. Die Arbeit des Thesleff-Labors hat den Nutzen dieses Systems für die zeitliche Analyse des Zahnwachstums und der Morphogenese, für die Analyse der Wirkung verschiedener Moleküle und Wachstumsfaktoren auf das Zahnwachstum und für die Zeitraffer-Live-Bildgebung der Zahnentwicklung gezeigt16,17. In jüngerer Zeit wurde diese Methode verwendet, um die Regulation von Schneidezahn-SCs und ihrer Nische18,19 zu untersuchen, die hier ausführlich beschrieben wird.

<table><tbody><tr><td>1-ml-Kunststoffspritzen</td> Einweg-Injektionsnadeln <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20/26 Gauge</td><td>Terumo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>61965-026</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>Gibco</td><td>14287</td><td></td></tr><tr><td>Extra Fine Bonn Schere</td><td>F.S.T.</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>F-12</td><td>Gibco</td><td>31765-027</td><td></td></tr><tr><td>FBS Südamerika (CE)</td><td>LifeTechn.</td><td>10270106</td><td>in Aliquoten dividieren, bei -20° lagern; C</td></tr><tr><td>Glasperlensterilisator, Steri 250 Sekunden-Sterilisator</td><td>Simon Keller Ltd</td><td>4AJ-6285884</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX-1 (200 mM L-Alanyl-L-Glutamin-Dipeptid)</td><td>Gibco</td><td>35050-038</td><td></td></tr><tr><td>Isopore Polycarb.Filter, 0,1 μm Durchmesser 25 mm</td><td>MerckMillipore</td><td>VCTP02500</td><td>In 70%igem Ethanol bei Raumtemperatur lagern.</td></tr><tr><td>L-Ascobinsäure</td><td>Sigma</td><td>A4544-25g</td><td>verdünnt 100 mg/ml in MilliQ, filtriert und geteilt in 20μ; l Aliquotes, bei dunkel lagern, -20°; C</td></tr><tr><td>Niedrigschmelzende Agarose</td><td>TopVision</td><td>R0801</td><td></td></tr><tr><td>Metallgitter</td><td></td><td></td><td>Handelsüblich oder selbst hergestellt aus Edelstahlgewebe (korrosionsbeständig, Maschenweite 0,7 mm). Schneiden Sie eine Scheibe mit einem Durchmesser von ca. 30 mm ab und biegen Sie die Kanten auf eine Höhe von 3 mm. Verwende Nägel, um Löcher zu machen.</td></tr><tr><td>Mikrozange</td><td>Medicon</td><td>07.60.03</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10.000U/ml) sol.</td><td>Gibco</td><td>15140-148</td><td></td></tr><tr><td>Petrischale, Limonadenglas</td><td>DWK Life Sciences</td><td>9170442</td><td></td></tr><tr><td>Petrischale 35 mm, mit Entlüftung</td><td>Duran</td><td>237554008</td><td></td></tr><tr><td>Petrischale 90 mm, ohne Entlüftung classic</td><td>Thermo Fisher</td><td>101RT/C</td><td></td></tr><tr><td>Kleine Schere</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

verwendung von organkulturen vom trowell-typ zur untersuchung der regulation von dentalen stammzellen

Use of Trowell-Type Organ Culture to Study Regulation of Dental Stem Cells

Organentwicklung, -funktion und -regeneration hängen von Stammzellen ab, die sich in diskreten anatomischen Räumen befinden, die als Stammzellnischen bezeichnet werden. Der kontinuierlich wachsende Mausschneidezahn bietet ein hervorragendes Modell, um gewebespezifische Stammzellen zu untersuchen. Die epithelgewebespezifischen Stammzellen des Schneidezahns befinden sich am proximalen Ende des Zahnes in einer Nische, der sogenannten Zervixschleife. Sie sorgen für einen kontinuierlichen Zellzustrom, um den ständigen Abrieb der selbstschärfenden Zahnspitze auszugleichen. Hier wird ein detailliertes Protokoll für die Isolierung und Kultur des proximalen Endes des Mausschneidezahns vorgestellt, in dem sich Stammzellen und ihre Nische befinden. Dies ist ein modifiziertes Organkulturprotokoll vom Typ Trowell, das die In-vitro-Kultur von Gewebestücken (Explantaten) sowie der dicken Gewebescheiben an der Flüssig-Luft-Grenzfläche auf einem Filter ermöglicht, der von einem Metallgitter unterstützt wird. Das hier beschriebene Organkulturprotokoll ermöglicht Gewebemanipulationen, die in vivo nicht durchführbar sind, und in Kombination mit der Verwendung eines fluoreszierenden Reporters bietet es eine Plattform für die Identifizierung und Verfolgung diskreter Zellpopulationen in lebenden Geweben im Laufe der Zeit , einschließlich Stammzellen. Verschiedene regulatorische Moleküle und pharmakologische Verbindungen können in diesem System auf ihre Wirkung auf Stammzellen und deren Nischen getestet werden. Dies ist letztendlich ein wertvolles Werkzeug, um die Regulation und Aufrechterhaltung von Stammzellen zu untersuchen.

Die epithelialen SCs befinden sich in einer Nische, die als zervikale Schleife bezeichnet wird und sich am proximalen Ende des Schneidezahns befindet (Abbildung 3A). Zervikale Schleifen sind morphologisch unterschiedliche Strukturen, die aus innerem und äußerem Schmelzepithel bestehen und das Sternretikulum, einen Kern locker angeordneter Epithelzellen, umhüllen (Abbildung 3B,C). Es gibt zwei zervikale Schleifen in jedem Schneidezahn (<strong cl...

Die Trowell-Typ-Organkulturmethode wurde verwendet, um komplexe Signalnetzwerke zu entschlüsseln, die die Zahnentwicklung steuern, und in jüngerer Zeit zur Untersuchung der Regulation von Stammzellen des kontinuierlich wachsenden Mausschneidezahns. Fluoreszenzreporter-Tiermodelle und Live-Imaging-Verfahren ermöglichen eingehende Analysen von dentalen Stammzellen und ihrer spezifischen Nischenmikroumgebung.

Verwendung von Organkulturen vom Trowell-Typ zur Untersuchung der Regulation von dentalen Stammzellen

Organ development, function, and regeneration depend on stem cells, which reside within discrete anatomical spaces called stem cell niches. The ...

Die Organkultur vom Trowell-Typ wird zur Kultivierung von Gewebeexplantaten verwendet. Hier zeigen wir, wie man mit dieser Methode die Stammzellen in kontinuierlich wachsenden Zähnen untersuchen kann. Mit dieser Technik können wir die Stammzellen und ihr Verhalten in der Nische untersuchen und die Wirkung verschiedener Moleküle auf das Überleben und die Erhaltung von Stammzellen untersuchen.Diese Methode kann auch angewendet werden, um die Stammzellen anderer Organe wie Haut oder Brustdrüse zu untersuchen. Beginnen Sie, indem Sie 30-Millimeter-Metallgitter mit Löchern mit einem bis zwei Millimetern Durchmesser in eine 35-Millimeter-Petrischale legen. Füllen Sie den Ort mit Medien, bis das Medium die Rasteroberfläche erreicht.Dann inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius, bis das Gewebe isoliert und bereit für die Kultur ist. Nachdem Sie die Maus enthauptet haben, entfernen Sie die Haut, um den Unterkiefer freizulegen, und schneiden Sie durch die Massetermuskeln, um den Unterkiefer vom Oberkiefer und dem Rest des Kopfes zu trennen. Sobald der Unterkiefer isoliert ist, entfernen Sie die Zunge und das maximale Weichgewebe.Teilen Sie den Unterkiefer an der Mittellinie, indem Sie d

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Das beschriebene Verfahren Isolierung und Charakterisierung von menschlichen Zahnpulpa Stammzellen (hDPSCs) unter Verwendung...

Isolation, Charakterisierung und vergleichende Differenzierung humaner Dental Pulp Stammzellen aus bleibenden Zähne mit zwei verschiedenen Methoden abgeleitet

Das kontinuierlich wachsende Maus Schneidezahn stellt ein Modell für die Untersuchung Erneuerung der Zahngewebe aus Zahn epithelialen Stammzellen (DESC). Ein robustes System für konsistent und zuverlässig diese Zellen von den Schneide erhalten und in vitro expandiert sie hier berichtet wird.

Isolation und Kultur der Dental epithelialen Stammzellen aus dem erwachsenen Maus Schneidezahn

Co-Kulturen stellen eine wertvolle Methode dar, um die Wechselwirkungen zwischen Nerven und Zielgeweben und -organen zu untersuchen. Mikrofluidische Systeme ermöglichen die Co-Kultivierung von Ganglien und ganzen sich entwickelnden Organen oder Geweben in verschiedenen Kulturmedien und stellen somit ein wertvolles Werkzeug für die in vitro Untersuchung der Wechselwirkung zwischen Neuronen und ihren Zielen dar.

Die Analyse der Entwicklung von Zahnkeim Innervation Mit Microfluidic Co-Kultur-Geräte

Dieses Protokoll beschreibt der Transienten Gentechnik zahnmedizinische Stammzellen aus der menschlichen zahnmedizinische Follikel extrahiert. Die angewandte nicht-viralen Modifikation Strategie kann eine Grundlage für die Verbesserung der therapeutischen Stammzellen Produkte geworden.

Isolierung, Charakterisierung und RNA-basierte gentechnische Veränderung von menschlichen Dental follikelstimulierendes Stammzellen

Wir bieten Protokolle zur Evaluation von mesenchymalen Stammzellen isoliert von Zahnpulpa und Prostata-Krebs-Zell-Interaktionen basierend auf direkten und indirekten Co Kulturmethoden. Zustand Medium und Trans-gut Membranen eignen sich zur indirekten parakrine Aktivität zu analysieren. Seeding differentiell ist gefärbten Zellen zusammen ein geeignetes Modell für direkten Zell-Zell-Interaktion.

Mesenchymale Stammzellen isoliert von Pulpagewebe und Kokultur mit Krebszellen ihre Interaktionen zu untersuchen

Wir beschreiben die Isolierung, Dispersion und Beschichtung von Zellstoff (DP) Primärzellen mit trigeminalen (TG) Neuronen, die auf darüber liegenden Transwellfiltern kultiviert sind. Zelluläre Reaktionen von DP-Zellen können mit Immunfluoreszenz oder RNA/Protein-Analyse analysiert werden. Die Immunfluoreszenz neuronaler Marker mit konfokaler Mikroskopie ermöglicht die Analyse von Neuriten-Auswuchsreaktionen.

Eine Co-Kultur-Methode zur Untersuchung des Neuriten-Auswuchss als Reaktion auf Dental Pulp Paracrine Signale

Dieses Protokoll stellt eine Methode für die Kultur und das 3D-Wachstum von Ameloblasten-ähnlichen Zellen in Schwerelosigkeit vor, um ihre längliche und polarisierte Form sowie die schmelzspezifische Proteinexpression zu erhalten. Auch Kulturbedingungen für die Kultur von parodontalen Engineering-Konstrukten und Lungenorganen in Schwerelosigkeit werden beschrieben.

Vermehrung von Zahn- und Atmungszellen und -organen in Schwerelosigkeit

Wir präsentieren ein Protokoll zur Entwicklung epithelialer Organoidkulturen ausgehend vom menschlichen Zahn. Die Organoide sind robust expandierbar und rekapitulieren die epithelialen Stammzellen des Zahnes, einschließlich ihrer Ameloblasten-Differenzierungskapazität. Das einzigartige Organoidmodell bietet ein vielversprechendes Werkzeug, um die Biologie der menschlichen Zahnmedizin (Stammzelle) mit Perspektiven für zahnregenerative Ansätze zu untersuchen.

Etablierung von Organoiden aus dem menschlichen Zahn als mächtiges Werkzeug für die mechanistische Forschung und regenerative Therapie

Dieser Artikel enthält eine schrittweise Anleitung zur Etablierung einer Primärkultur von Zahnpulpa-Stammzellen unter Verwendung der Explantatkulturmethode und zur Charakterisierung dieser Zellen auf der Grundlage der ICSCRT-Richtlinien. Die durch dieses Protokoll isolierten Zellen können als mesenchymale Stammzellen für weitere Anwendungen betrachtet werden.

Primärkultur von Stammzellen der Zahnpulpa

Dieses Protokoll konzentriert sich auf die Extraktion, Kultivierung und Konservierung von multipotenten Stammzellen aus Zahnpulpa durch enzymatischen Verdau. Darüber hinaus demonstriert es ihr Potenzial, sich in Osteoblasten, Adipozyten und Chondrozyten zu differenzieren, was die Bedeutung von Präzision und Konsistenz in diesem Prozess unterstreicht.

Isolierung, Kultivierung und Charakterisierung von Stammzellen der Zahnpulpa aus menschlichen Milchzähnen und bleibenden Zähnen

Die Ex-vivo-Live-Bildgebung ist eine leistungsfähige Technik zur Untersuchung der dynamischen Prozesse zellulärer Bewegungen und Interaktionen in lebendem Gewebe. Hier stellen wir ein Protokoll vor, das die Zwei-Photonen-Mikroskopie implementiert, um dentale Epithelzellen in kultivierten ganzen erwachsenen Mausschneidezähnen live zu verfolgen.

Verwendung von Ex-vivo-Live-Bildgebung zur Untersuchung von Zellteilungen und -bewegungen während der Zahnerneuerung von Mäusen

Lernen Sie die Trowell-Organkulturmethode zur Untersuchung dentaler Stammzellen in der Mausinzisivus-Nische. Dieses Protokoll ermöglicht Live-Imaging und Screening regulatorischer Moleküle für Stammzellforschung.

Verwendung von Organkulturen vom Trowell-Typ zur Untersuchung der Regulation von dentalen Stammzellen

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