Nachweis eines SARS-CoV-2-Rezeptor-bindenden Domänenantikörpers mit einem HiBiT-basierten Bioreporter

Mein Labor hat in der COVID-19-Forschung gearbeitet, und wir haben kürzlich einen neuartigen Assay entwickelt, der es uns ermöglichte, SARS-CoV-2-Antikörper schnell und genau nachzuweisen. Dieses Protokoll beschreibt einen Hochdurchsatz-Assay zum Nachweis von Anti-SARS-CoV-2-Antikörpern in Serumproben von Patienten, was angesichts der aktuellen Pandemie von entscheidender Bedeutung ist. Die Mehrheit der aktuellen serologischen Assays opfert Geschwindigkeit für Empfindlichkeit oder umgekehrt.

Unsere Daten zeigen, dass unser Assay sowohl empfindlich ist als auch eine schnelle Reaktionszeit hat. Um eine ausreichende Menge an High HiBiT-RBD-Bioreporter zu produzieren, beginnen Sie mit der Vorbereitung auf die Zellkultur. Bereiten Sie zunächst das komplette modifizierte Adlermedium von Dulbecco vor, das 10% fötales Rinderserum und 1% Penicillin und Streptomycin enthält.

Anschließend erwärmen Sie das Medium in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad. Schalten Sie die biologische Sicherheitswerkbank ein und verwenden Sie 70% Ethanol zum Sterilisieren der Schrankoberfläche. Um die Zelllinie zu kultivieren, nehmen Sie sie aus minus 80 Grad Celsius oder flüssigem Stickstoff heraus und tauen Sie sie in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad auf.

Mischen Sie die aufgetauten Zellen mit mindestens 10 Millilitern komplettem Medium. Die Zellsuspension in eine 15 Zentimeter große Petrischale pipettieren und die Platte schwenken, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen. Stellen Sie die Schale bei 37 Grad Celsius, 5% Kohlendioxid und 85 bis 95% Luftfeuchtigkeit in einen Zellkulturinkubator.

Beobachten Sie die Zellen unter dem Mikroskop, bis der Konfluenzwert 80 bis 90% erreicht Bei hoher Konfluenz entfernen Sie das Medium, waschen Sie die Zellen mit warmem PBS und fügen Sie drei bis fünf Milliliter 0,25% Trypsin-EDTA hinzu, um die Zellen von der Oberfläche zu lösen. Nach etwa fünf Minuten betrachten Sie die Zellen unter einem Mikroskop. Wenn alle Zellen schwimmen, fügen Sie mindestens vier Milliliter Medium hinzu und übertragen Sie die Zellsuspension in ein neues steriles Röhrchen.

Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer und fügen Sie eine Million Zellen in jede Vertiefung einer Sechs-Well-Platte zur Transfektion ein. Um eine Transfektion des HiBiT-RBD-Plasmids durchzuführen, verwenden Sie ein Mikrogramm des HiBiT-RBD-Expressionsplasmids mit einem geeigneten Transfektionsreagenz. 10 bis 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren und dann das Gesamtvolumen zu jeder Vertiefung der Platte tropfenweise hinzufügen.

Ersetzen Sie am nächsten Tag das Medium, das die Transfektionsmischung enthält, durch ein vollständiges Medium. Beobachten Sie die Transfektionskontrolle 48 Stunden nach der Transfektion gut. Sammeln Sie den Überstand in 1,5 Milliliter Mikroröhrchen.

Fügen Sie 500 Mikroliter 1X passiven Lysepuffer oder PLB zu den Zellen hinzu, inkubieren Sie dann und schütteln Sie die Platte für 15 Minuten bei Raumtemperatur für die Zelllyse. Um das Lumineszenzsignal des Bioreporters mit einem Luciferase-Assay zu bewerten, bereiten Sie zunächst die Reaktionskomponenten vor und verwenden Sie den Überstand als Quelle des Bioreporters. Verdünnen Sie das große BiT und das Substrat vor Gebrauch auf 1X.

Übertragen Sie 50 Mikroliter des Überstands von jedem Bohrloch oder Röhrchen auf eine 96-Well-Platte und fügen Sie 50 Mikroliter 1X großes BiT zu jedem Bohrloch hinzu. Fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Öffnen Sie die Luminometer-Software, fügen Sie 50 Mikroliter 1X-Substrat zu jeder Vertiefung hinzu, legen Sie die Platte in das Luminometer und führen Sie die Software aus.

Um den HiBiT-RBD-Antikörper-Nachweis-Assay durchzuführen, bereiten Sie den HiBiT-RBD-Bioreporter wie zuvor beschrieben vor und kombinieren Sie 50 Mikroliter des HiBiT-RBD-haltigen Überstands mit einem Mikrogramm des kommerziellen SARS-CoV-2 RBD-Antikörpers in einem 1,5 Milliliter Mikroröhrchen. Fügen Sie der Lösung 20 Mikroliter Immunglobulin-bindendes Protein oder Protein G hinzu. Bringen Sie das Gesamtvolumen auf 300 Mikroliter durch Hinzufügen von PBS.

Inkubieren Sie die Röhrchen 30 Minuten lang auf einem Tubenschüttler oder Rotator. Zentrifuge bei 12.000 G für 30 Sekunden. Entsorgen Sie dann den Überstand und waschen Sie ihn mit PBS.

Wiederholen Sie den Vorgang dreimal, um das freie HiBiT-RBD zu entfernen. Resuspendieren Sie die Zellen in 50 Mikroliter PBS und übertragen Sie sie auf eine 96-Well-Platte. Fügen Sie 50 Mikroliter 1X großes BiT hinzu und warten Sie fünf Minuten.

Dann fügen Sie 50 Mikroliter 1X NanoLuc-Substrat hinzu. Sofort das Lumineszenzsignal mit einem Luminometer ablesen. Bereiten Sie größere Mengen des HiBiT-RBD-Bioreporters für einen Hochdurchsatz-Assay vor und kombinieren Sie 20 Mikroliter magnetisches Protein G mit 50 Mikrolitern des HiBiT-RBD-Überstands in jeder Vertiefung einer 96-Well-Platte für jede Probe.

Fügen Sie 10 Mikroliter der Serumprobe zu jeder Vertiefung hinzu und bringen Sie das Gesamtvolumen durch Zugabe von PBS auf 150 Mikroliter. 30 Minuten auf einem Shaker bei Raumtemperatur inkubieren. Legen Sie dann die Platte auf eine magnetische Unterlegscheibe, um den Protein G-Antikörperkomplex auszulösen.

Entsorgen Sie die Lösung im mittleren Abschnitt jeder Vertiefung und fügen Sie PBS zum Waschen hinzu. Wiederholen Sie den Waschschritt mindestens dreimal, um überschüssige HiBiT-RBD zu entfernen. Fügen Sie 50 Mikroliter 1X PBS und 50 Mikroliter 1X großes BiT hinzu und inkubieren Sie mindestens fünf Minuten bei Raumtemperatur.

Bereiten Sie die Luminometer-Software vor. Dann fügen Sie 50 Mikroliter 1X-Substrat hinzu. Legen Sie die Platte in die Maschine, führen Sie eine Software aus und zeichnen Sie die Signale auf.

Vergleichen Sie die Signale von Serumproben, Kontrollproben und Hintergrundsignalen von leeren Vertiefungen. Die Signale sowohl des HiBiT-RBD-haltigen Zelllysat als auch des Überstandes der transfizierten Zellen wurden aufgezeichnet, um die geeignete Proteinquelle zu bewerten. Die Daten zeigten einen niedrigen Hintergrund im Vergleich zu einem starken Signal, wenn beide Teile kombiniert wurden.

Die Zugabe von Protein G hilft bei der Antikörperfällung. Der Assay wurde verwendet, um das Signal eines kommerziellen SARS-CoV-2-neutralisierenden Antikörpers mit einem Kontroll-IgG zu vergleichen. Das spezifische Antikörpersignal war robust, während der Kontrollantikörper nahe am lumineszierenden Hintergrundniveau lag.

Rekombinantes abgeschwächtes onkolytisches vesikuläres Stomatitisvirus oder VSV mit einer Mutation an Position 51 des M-Proteins, das exprimierende exprimierende RBD, wurde zur Impfung von Mäusen verwendet. Das serum, das von geimpften Mäusen gesammelt wurde, erzeugte ein robustes Signal im Vergleich zu keinem Signal bei Mäusen, die mit Kontroll-VSV injiziert wurden. Dieses Protokoll kann für den Nachweis der SARS-CoV-2-Antikörper in Serumproben von Patienten verwendet werden.

Die Waschschritte nach der Inkubation mit Protein G sind entscheidend für die Reduzierung des Hintergrunds. Darüber hinaus ist es wichtig, das Substrat so schnell wie möglich hinzuzufügen, um Signalverluste zu vermeiden. Mit ein paar zusätzlichen Optimierungsschritten kann derselbe Assay zur Analyse von Blutproben verwendet werden und könnte eine effektive Methode zur Bestimmung von Anti-SARS-CoV-2-Antikörpern in Patientenblutproben sein.