Name: Nachweis eines SARS-CoV-2-Rezeptor-bindenden Domänenantikörpers mit einem HiBiT-basierten Bioreporter (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-12T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: Erfahren Sie einen hochdurchsatzfähigen HiBiT-basierten Assay zum Nachweis von SARS-CoV-2-Antikörpern in Patientenserum. Diese Methode kombiniert Schnelligkeit und Sensitivität für die serologische Diagnostik.

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Wir schätzen und danken der technischen Unterstützung von Xiaohong He, Ricardo Marius, Julia Petryk, Bradley Austin und Christiano Tanese De Souza. Wir danken auch Mina Ghahremani für Grafikdesign. Wir möchten uns auch bei allen Personen bedanken, die teilgenommen und ihre Blutproben für diese Studie gespendet haben. DWC wird zum Teil von der uOttawa Fakultät und abteilung für Medizin unterstützt.

HINWEIS: Das unten beschriebene Protokoll entspricht allen Ethikrichtlinien gemäß Protokollcode 20200371-01H.
1. Erstellung und Auswertung des HiBiT-RBD Bioreporters
<ol><li>Herstellung einer ausreichenden Menge HiBiT-RBD-Bioreporter<ol>
<li>Bereiten Sie sich auf die Zellkultur vor<ol>
<li>Bereiten Sie ein komplettes modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) von Dulbecco vor, das 10% fötales Rinderserum und 1% Penicillin/Streptomycin enthält. Anschließend erwärmen Sie das Medium in einem 37 °C warmen Wasserbad.</li>
			<li>Schalten Sie die biologische Sicherheitswerkbank (BSC) ein und verwenden Sie 70% v / v Ethanol für die Sterilisation der Schrankoberfläche.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Kultur die Zelllinie.<ol>
<li>Nehmen Sie die Zelllinie von -80 °C oder flüssigem Stickstoff heraus und tauen Sie sie in einem 37 °C warmen Wasserbad auf. HINWEIS: Eine geeignete Zelllinie ist in Kultur leicht zu pflegen, hat eine hohe Transfektionseffizienz und eignet sich für die exogene Proteinproduktion. Für dieses Protokoll wurden menschliche embryonale Nierenzellen HEK293 verwendet.</li>
			<li>Mischen Sie die aufgetauten Zellen mit mindestens 10 ml vollständigem Medium, pipettieren Sie die Zellsuspension auf eine 10 cm lange Petrischale und schwenken Sie die Platte, um die Zellen gleichmäßig in der Schale zu verteilen. Stellen Sie die Schale bei 37 °C, 5% CO2 und 85-95% Luftfeuchtigkeit in einen Zellkultur-Inkubator.</li>
			<li>Beobachten Sie die Zellen unter dem Mikroskop, bis der Konfluenzgrad 80-90% erreicht. Bei hoher Konfluenz das Medium entfernen, die Zellen mit warmer phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) waschen und 1 ml 0,25% Trypsin-Ethylendiamintetraessigsäure hinzufügen, um die Zellen von der Oberfläche zu lösen. HINWEIS: Die HEK293-Zellen lassen sich relativ leicht lösen. Daher sollte der Waschschritt sehr sanft durchgeführt werden, um ein versehentliches Ablösen und Verlieren von Zellen zu verhindern.</li>
			<li>Nach ca. 5 min betrachten Sie die Zellen unter einem Mikroskop. Wenn alle Zellen schwimmen, fügen Sie mindestens 4 ml Medium hinzu und übertragen Sie die Zellsuspension in ein neues steriles Röhrchen. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer und fügen Sie 1 × 106 Zellen in jede Vertiefung einer 6-Well-Platte zur Transfektion hinzu. HINWEIS: Nach 24 h sollten die Zellen zu 80% oder mehr konfluent sein.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Transfektion des HiBiT-RBD-Plasmids<ol>
<li>Verwenden Sie 1 μg des HiBiT-RBD-Expressionsplasmids mit einem geeigneten Transfektionsreagenz. Inkubieren Sie für 10-15 min bei Raumtemperatur und fügen Sie dann das Gesamtvolumen zu jeder Vertiefung der Platte hinzu, tropfenweise. HINWEIS: Befolgen Sie das Transfektionsprotokoll des Herstellers. In diesem Fall wurde dem verdünnten Plasmid (1 μg) in DMEM ein Gemisch (eine bestimmte Menge) des Transfektionsreagenzes mit DMEM zugesetzt (siehe Materialtabelle). Verwenden Sie ein markerhaltiges (z. B. grün fluoreszierendes Protein [GFP]) Plasmid als Kontrolle, um die Transfektionseffizienz zu überwachen.</li>
			<li>Ersetzen Sie am nächsten Tag das Medium, das die Transfektionsmischung enthält, durch ein vollständiges Medium. Beobachten Sie die Transfektionskontrolle 48 h nach der Transfektion gut. HINWEIS: Wenn die Transfektion positiv und effizient war (mehr als 80% GFP-positiv), sollten die Zellen für die Ernte des HiBiT-RBD-Bioreporters bereit sein. Das Konstrukt enthält auch His-Tag, mit dem gereinigtes Protein anstelle des gesamten Überstandes gewonnen werden kann.</li>
			<li>Sammeln Sie den Überstand in 1,5 ml Mikroröhrchen. Fügen Sie den Zellen 500 μL 1x passiven Lysepuffer (PLB) hinzu; Inkubieren und schütteln Sie die Platte für 15 min bei Raumtemperatur für die Zelllyse. HINWEIS: Der Überstand und die Lysatlösung können bei -20 °C mit geringem Integritätsverlust für mindestens 6 Monate konserviert werden. Laut Azad et al.22 ist der Reporter bei einem weiten Bereich von pH-Wert (4-12) und Temperatur (4-42 °C) stabil.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Auswertung des Lumineszenzsignals aus dem Bioreporter mittels Luciferase-Assay<ol>
<li>Vorbereitung der Reaktionskomponenten<ol>
<li>Verwenden Sie den Überstand als Quelle des Bioreporters. HINWEIS: Sowohl Überstand als auch Lysat enthalten den HiBiT-RBD-Bioreporter und können für den Assay verwendet werden. Der Überstand wird jedoch aus Gründen, die in den folgenden Anmerkungen erläutert werden, als Quelle empfohlen.</li>
			<li>Verdünnen Sie das LgBiT und das Substrat vor Gebrauch auf 1x (Die Stammkonzentration beträgt 100x). HINWEIS: Weitere Informationen zum LgBiT finden Sie in der Materialtabelle .</li>
		</ol>
</li>
		<li>Luciferase-Assay<ol>
<li>Übertragen Sie 50 μL des Überstands von jedem Bohrloch oder Röhrchen auf eine 96-Well-Platte und fügen Sie 50 μL 1x LgBiT zu jeder Vertiefung hinzu. 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
			<li>Öffnen Sie die Luminometer-Software, fügen Sie 50 μL 1x Substrat (Furimazin) zu jeder Vertiefung hinzu, legen Sie die Platte in das Luminometer und führen Sie die Software aus. HINWEIS: Fügen Sie das Substrat unmittelbar vor dem Lesen der Platte hinzu, um den Verzehr des Substrats durch die aktiven Enzyme vor der Signalmessung zu verhindern.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>2. Nachweis von Anti-RBD-Antikörpern mit einem schnellen und empfindlichen Assay
<ol><li>HiBiT-RBD Antikörper-Nachweis-Assay<ol>
<li>Bereiten Sie den HiBiT-RBD-Bioreporter wie in Abschnitt 1.1 des Protokolls beschrieben vor. HINWEIS: Es wird empfohlen, den Überstand für den folgenden Assay zu verwenden, da er einfacher zu sammeln ist und die reife glykosylierte Version des Proteins enthält. Darüber hinaus hat das Lysat mehrere andere Proteine, die die HiBiT-RBD-Antikörper-Interaktion stören könnten.</li>
		<li>Kombinieren Sie 50 μL des HiBiT-RBD-haltigen Überstands mit 1 μg des kommerziellen SARS-CoV-2-RBD-Antikörpers in einer 1,5 ml Mikroröhre. 20 μL Immunglobulin-bindendes Protein (Protein G) in die Lösung geben. Erhöhen Sie das Gesamtvolumen auf 300 μL durch Hinzufügen von PBS. HINWEIS: Das Gesamtvolumen der Mischung kann auf 150 μL verringert werden. Niedrigere Gesamtvolumina werden nicht empfohlen, da dies zu einer unzureichenden Vermischung von Antikörpern mit dem Bioreporter führen könnte.</li>
		<li>Inkubieren Sie das Röhrchen (die Röhrchen) auf einem Röhrchenschüttler oder Rotator für 30 min. Zentrifugiere bei 12.000 × g für 30 s, entsorge den Überstand und wäsche ihn mit PBS. Wiederholen Sie den Vorgang dreimal, um das freie HiBiT-RBD zu entfernen. Resuspendieren Sie 50 μL PBS und übertragen Sie es auf eine 96-Well-Platte.</li>
		<li>Fügen Sie 50 μL 1x LgBiT hinzu und warten Sie 5 min. Dann fügen Sie 50 μL 1x NanoLuc-Substrat hinzu. Sofort das Lumineszenzsignal mit einem Luminometer ablesen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Hochdurchsatznachweis der SARS-CoV-2-spezifischen Antikörper aus Patientenserumproben
<ol><li>Bereiten Sie größere Mengen des HiBiT-RBD-Bioreporters für einen Hochdurchsatz-Assay vor, indem Sie Abschnitt 1.1 des Protokolls befolgen.</li>
	<li>Kombinieren Sie 20 μL magnetisches Protein G mit 50 μL des HiBiT-RBD-Überstands in einer Vertiefung von 96-Well-Platte für jede Probe. Fügen Sie 10 μL der Serumprobe zu jeder Vertiefung hinzu und erhöhen Sie das Gesamtvolumen auf 150 μL durch Zugabe von PBS. HINWEIS: Verwenden Sie sowohl unspezifische IgG (Negativkontrolle) als auch neutralisierende SARS-CoV-2-Antikörper (Positivkontrolle) bei einer Konzentration von 1 μg/ml, wie in Schritt 2.1.2 beschrieben. Darüber hinaus können Serumproben von geimpften Mäusen auch auf Antikörper untersucht werden. Bei diesem Test wurden Serumproben vom Ottawa Hospital General Campus nach einem zugelassenen Verfahren und mit informierter Zustimmung von Einzelpersonen entnommen.</li>
	<li>30 min auf einem Shaker bei Raumtemperatur inkubieren. Legen Sie die Platte auf eine magnetische Unterlegscheibe, um den Protein-G-Antikörperkomplex auszufällen. HINWEIS: Die spezifische Struktur der Magnetscheibe fällt den Komplex an den Seitenwänden jedes Bohrlochs aus.</li>
	<li>Verwerfen Sie die Lösung im mittleren Abschnitt jeder Vertiefung und fügen Sie PBS zum Waschen hinzu. Wiederholen Sie den Waschschritt mindestens dreimal, um überschüssige HiBiT-RBD zu entfernen. Fügen Sie 50 μL 1x PBS und 50 μL 1x LgBiT hinzu. Mindestens 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
	<li>Bereiten Sie die Luminometer-Software vor und fügen Sie dann 50 μL 1x Substrat hinzu. Legen Sie die Platte in die Maschine, führen Sie die Software aus und zeichnen Sie die Signale auf. Vergleichen Sie die Signale von Serumproben, Kontrollproben und Hintergrund (leere Vertiefungen).</li>
</ol>

<ol><li>Ullah, H., Ullah, A., Gul, A., Mousavi, T., Khan, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+coronavirus+2019+%28COVID-19%29+pandemic+outbreak%3A+A+comprehensive+review+of+the+current+literature%5BTitle%5D)+AND+%22Vacunas%22%5BJournal%5D)">Novel coronavirus 2019 (COVID-19) pandemic outbreak: A comprehensive review of the current literature.</a> Vacunas. , (2020).</li>
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<li>Azad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2+S1+NanoBiT%3A+A+nanoluciferase+complementation-based+biosensor+to+rapidly+probe+SARS-CoV-2+receptor+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2 S1 NanoBiT: A nanoluciferase complementation-based biosensor to rapidly probe SARS-CoV-2 receptor recognition.</a> Biosensors and Bioelectronics. 180, 113122(2021).</li>
<li>Brown, E. E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+critical+determinants+of+ACE2-SARS+CoV-2+RBD+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Characterization of critical determinants of ACE2-SARS CoV-2 RBD interaction.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2268(2021).</li>
<li>Azad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gain-of-functional+screen+identifies+the+Hippo+pathway+as+a+central+mediator+of+receptor+tyrosine+kinases+during+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">A gain-of-functional screen identifies the Hippo pathway as a central mediator of receptor tyrosine kinases during tumorigenesis.</a> Oncogene. 39 (2), 334-355 (2020).</li>
<li>Schwinn, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Mediated+tagging+of+endogenous+proteins+with+a+luminescent+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Mediated tagging of endogenous proteins with a luminescent peptide.</a> ACS Chemical Biology. 13 (2), 467-474 (2018).</li>
<li>Azad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+NanoBiT-based+serological+assay+detects+SARS-CoV-2+seroconversion%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomaterials%22%5BJournal%5D)">A high-throughput NanoBiT-based serological assay detects SARS-CoV-2 seroconversion.</a> Nanomaterials. 11 (3), 807(2021).</li>
</ol>

Die Autoren erklären keinen Interessenkonflikt.

Die steigende Zahl von Menschen, die mit SARS-CoV-2 infiziert sind, und die anhaltenden Bemühungen um eine globale Impfung erfordern empfindliche und schnelle serologische Tests, die in groß angelegten Serosurveys eingesetzt werden können. Jüngste Forschungen zeigen, dass Split-Nanoluciferase-basierte Bioreporter verwendet werden können, um solche Assays zu entwickeln. Wir haben kürzlich den HiBiT-RBD-Bioreporter entwickelt, um einen Test zu entwickeln, mit dem SARS-CoV-2-spezifische Antikörper im Patientenserum schnell ...

Das jüngste Auftreten eines neuen Coronavirus, SARS-CoV21, hat bis zum 30. März 20212 mehr als 2.800.000 Todesfälle und 128 Millionen Infektionen verursacht. Aufgrund des Fehlens eines zuverlässigen und gut etablierten Behandlungsverfahrens für klinische SARS-CoV-2-Therapien wurden viele Anstrengungen unternommen, um die weitere Virusübertragung einzuschränken und vor allem eine wirksame und robuste Behandlung oder einen Impfstoff zu entwickeln3. Bis heute gibt es mehr als 50 COVID-19-Impfstoffkandidaten in Studien, die von der Weltgesundheitsorganisation gemeldet wurden4. Der Nachweis von Antikörpern gegen SARS-CoV-2 ist von größter Bedeutung, um die langfristige Stabilität des humoralen Ansprechens bei Verabreichung des Impfstoffs sowie bei genesenen Patienten mit COVID-195 zu bestimmen. Einige Studien haben gezeigt, dass die Möglichkeit besteht, dass genesene SARS-CoV-2-Patienten nach 1 Jahr die meisten RBD-bindenden Antikörper verlieren5,6,7,8,9. Weitere Untersuchungen sind erforderlich, um die dauerhafte Immunität besser zu verstehen, und empfindlichere Antikörpernachweisplattformen können dazu beitragen, diese Arbeit voranzutreiben. Berichte über eine anhaltende Immunität gegen leichte SARS-CoV-2-Infektionen, die auf langfristige Antikörperreaktionen hindeuten, sind ebenfalls ein interessantes und lohnendes Studiengebiet. Eine schnelle und genaue Nachweismethode ist für die Überwachung von Antikörpern in den Seren von Individuen unerlässlich, um mehr Informationen über die Immunität in der Bevölkerung zu erhalten.
Wie andere Coronaviren verwendet SARS-CoV-2 hervorstehendes Spike-Glykoprotein, um an das Angiotensin-Converting-Enzym-2 (ACE2) zu binden, um eine Kaskade von Ereignissen auszulösen, die zur Fusion der Virus- und Zellmembranen führen6,7. Mehrere Studien haben kürzlich bewiesen, dass die RBD des Spike-Proteins eine entscheidende Rolle bei der Auslösung einer starken und spezifischen Antikörperantwort gegen SARS-CoV28,9,10,11 spielt. Insbesondere die von Premkumar et al. beobachteten Korrelationen zwischen dem Titer des RBD-bindenden Antikörpers und der SARS-CoV-2-Neutralisationskraft des Patientenplasmas stimmen mit RBD als immunogenem Kompartiment der Virusstruktur überein9. Vor diesem Hintergrund sind viele diagnostische Tests, die für den Nachweis von SARS-CoV-2-Antikörpern verfügbar sind, zeit- und kostenintensiv, erfordern ein langwieriges Inkubations- und Waschverfahren (Enzym-Linked Immunosorbent Assay [ELISA]) oder es mangelt ihnen an Sensitivität und Genauigkeit (Lateral-Flow-Immunoassay [LFIA])12. Daher würde eine quantitative und schnelle komplementäre serologische Methode des COVID-19-abgeleiteten Antikörpernachweises mit hoher Sensitivität, schnellem Ansprechen und relativ geringen Kosten die Notwendigkeit eines zuverlässigen serologischen Tests für die epidemiologische Überwachung von SARS-CoV-2 decken.
Insgesamt führten die Einschränkungen der aktuellen serologischen Assays zur Untersuchung des Biolumineszenz-Meldesystems als potenzielles Diagnostikum in zukünftigen Serosurveys. Biolumineszenz ist eine natürlich vorkommende Enzym/Substrat-Reaktion mit Lichtemission. Nanoluc-Luciferase ist das kleinste (19 kDa), aber das hellste System im Vergleich zu Renilla- und Glühwürmchen-Luciferase (36 kDa bzw. 61 kDa)13,14. Darüber hinaus hat Nanoluc das höchste Signal-Rausch-Verhältnis und die höchste Stabilität unter den zuvor genannten Systemen. Die hohe Signalintensität von Nanoluc unterstützt den Nachweis selbst sehr geringer Mengen an Reporterfusionen15. Nanoluc Binary Technology (NanoBiT) ist eine splitte Version des Nanoluc-Systems, das aus zwei Segmenten besteht: kleine BiT (11 Aminosäuren; SmBiT) und große BiT (LgBiT) mit relativ affinitätsarmen Wechselwirkungen (KD = 190 μM) zu einem Lumineszenzkomplex16. NanoBiT wird in verschiedenen Studien zur Identifizierung von Protein-Protein-Interaktionen15,17,18,19 und zellulären Signalwegen eingesetzt11,20,21.
Kürzlich wurde ein weiteres kleines Peptid mit einer deutlich höheren Affinität zu LgBiT (KD = 0,7 nM) eingeführt, nämlich das HiBiT Nano-Glo-System anstelle von SmBiT. Die hohe Affinität und das starke Signal des Nano-Glo "add-mix-read"-Assays machen HiBiT zu einem geeigneten, quantitativen, lumineszierenden Peptid-Tag. Bei diesem Ansatz wird das HiBiT-Tag an das Zielprotein angehängt, indem ein Konstrukt entwickelt wird, das minimale strukturelle Interferenzen aufweist. Die HiBiT-Protein-Fusion würde aktiv an das LgBiT-Gegenstück binden und ein hochaktives Luciferase-Enzym produzieren, um in Gegenwart von Nachweisreagenzien nachweisbare Biolumineszenz zu erzeugen (Abbildung 1). In ähnlicher Weise haben wir ein HiBiT Nano-Glo-basiertes System entwickelt, um den neutralisierenden Antikörpertiter in den Seren von SARS-CoV-2-genesenen Individuen leicht zu messen, und kürzlich einen HiBiT-markierten SARS-CoV-2 RBD entwickelt. Dieser Artikel beschreibt das Protokoll zur Herstellung des HiBiT-RBD-Bioreporters unter Verwendung von Standardlaborverfahren und -geräten und zeigt, wie dieser Bioreporter in einem schnellen und effizienten Assay zum Nachweis von SARS-CoV-2 RBD-Targeting-Antikörpern verwendet werden kann.

<table><tbody><tr><td>5x Passiver Lysepuffer</td><td>Promega</td><td>E194A</td><td>30 mL</td></tr><tr><td>Bio-Plex Handheld Magnetic Washer</td><td>Bio-Rad</td><td>171020100</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma</td><td>D6429-500ml</td><td></td></tr><tr><td>Dual-Glo Luciferase Assay System</td><td>Promega</td><td>E2940</td><td>100 mL Kit</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F1051</td><td></td></tr><tr><td>HiBiT-RBD Plasmid</td><td></td><td></td><td>gacggatcgggagatctcccgatcccctatggt gcactctcagtacaatctgctgatgccgcata gttaagccagtatctgctccctgcttgtgtgtgtgg aggtcgctgagtagtgcgcgagcaaaattta agctacaacaaggcaaggcttgaccgacaa ttgcatgaagaatctgcttagggttaggcgttttg cgctgcttcgggatgtacgggagatatacgc gttgacattgattattgactagttattaatagt aatcaattacggggtcattagtccatcccat atggagttccgccggttakataacttacggtaa atggcccgcctccccccaccc ccgcccattgacgcaacccccccaataatgacgtgttctccc Atagtaacgccaatagggactttccattgacgtc aatgggtggagtatttacggtaactgcccact tggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagta 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(2019-nCoV) Spike Neutralisierender Antikörper, Maus Mab</td><td>SinoBiological</td><td>40592-MM57</td><td></td></tr><tr><td>Synergy Mx Mikroplatten-Reader</td><td>BioTek</td><td></td><td>96-Well-Plattenleser Lumimeter</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2520056</td><td>0,25</td></tr></tbody></table>%

nachweis eines sars-cov-2-rezeptor-bindenden domänenantikörpers mit einem hibit-basierten bioreporter

Detection of SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain Antibody using a HiBiT-Based Bioreporter

Das Auftreten der COVID-19-Pandemie hat den Bedarf an besseren serologischen Nachweismethoden erhöht, um die epidemiologischen Auswirkungen des schweren akuten respiratorischen Syndroms Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) zu bestimmen. Die steigende Zahl von SARS-CoV-2-Infektionen erhöht den Bedarf an besseren Antikörper-Nachweis-Assays. Aktuelle Antikörper-Nachweismethoden beeinträchtigen die Empfindlichkeit in Bezug auf Geschwindigkeit oder sind empfindlich, aber zeitaufwendig. Ein großer Teil der SARS-CoV-2-neutralisierenden Antikörper zielt auf die Rezeptorbindungsdomäne (RBD) ab, eines der primären immunogenen Kompartimente von SARS-CoV-2. Wir haben kürzlich ein hochempfindliches, biolumineszenz-markiertes RBD (NanoLuc HiBiT-RBD) zum Nachweis von SARS-CoV-2-Antikörpern entworfen und entwickelt. Der folgende Text beschreibt das Verfahren zur Herstellung des HiBiT-RBD-Komplexes und eines schnellen Assays zur Bewertung des Vorhandenseins von RBD-Targeting-Antikörpern mit diesem Tool. Aufgrund der Haltbarkeit des HiBiT-RBD-Proteinprodukts über einen weiten Temperaturbereich und des kürzeren experimentellen Verfahrens, das innerhalb von 1 h abgeschlossen werden kann, kann das Protokoll als effizientere Alternative zum Nachweis von SARS-CoV-2-Antikörpern in Patientenserumproben angesehen werden.

Die Signale sowohl des HiBit-RBD-haltigen Zelllysats als auch des Überstandes der transfizierten Zellen wurden aufgezeichnet (Abbildung 2), um die geeignete Proteinquelle zu bewerten. HiBiT-RBD und LgBit wurden separat als Steuerelemente verwendet, und die Daten zeigten einen niedrigen Hintergrund im Vergleich zu einem starken Signal, wenn beide Teile kombiniert wurden. Daher ist die HiBiT-RBD-Interaktion mit LgBiT notwendig, um ein aktives Enzym für die Substratverdauung und die Bioluminesz...

Das skizzierte Protokoll beschreibt das Verfahren zur Herstellung des HiBiT-Rezeptor-bindenden Domänenproteinkomplexes und seine Anwendung für den schnellen und sensitiven Nachweis von SARS-CoV-2-Antikörpern.

Nachweis eines SARS-CoV-2-Rezeptor-bindenden Domänenantikörpers mit einem HiBiT-basierten Bioreporter

The emergence of the COVID-19 pandemic has increased the need for better serological detection methods to determine the epidemiologic impact of severe ...

Mein Labor hat in der COVID-19-Forschung gearbeitet, und wir haben kürzlich einen neuartigen Assay entwickelt, der es uns ermöglichte, SARS-CoV-2-Antikörper schnell und genau nachzuweisen. Dieses Protokoll beschreibt einen Hochdurchsatz-Assay zum Nachweis von Anti-SARS-CoV-2-Antikörpern in Serumproben von Patienten, was angesichts der aktuellen Pandemie von entscheidender Bedeutung ist. Die Mehrheit der aktuellen serologischen Assays opfert Geschwindigkeit für Empfindlichkeit oder umgekehrt.Unsere Daten zeigen, dass unser Assay sowohl empfindlich ist als auch eine schnelle Reaktionszeit hat. Um eine ausreichende Menge an High HiBiT-RBD-Bioreporter zu produzieren, beginnen Sie mit der Vorbereitung auf die Zellkultur. Bereiten Sie zunächst das komplette modifizierte Adlermedium von Dulbecco vor, das 10% fötales Rinderserum und 1% Penicillin und Streptomycin enthält.Anschließend erwärmen Sie das Medium in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad. Schalten Sie die biologische Sicherheitswerkbank ein und verwenden Sie 70% Ethanol zum Sterilisieren der Schrankoberfläche. Um die Zelllinie zu kultivieren, nehmen Sie sie aus minus 80 Grad Celsius oder flüssigem Stickstoff heraus und tauen Sie sie in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad auf.Mischen Sie die aufgetauten Zellen mit mindestens 10 Millilitern komplettem Medium. Die Zellsuspension in eine 15 Zentimeter große Petrischale pipettieren und die Platte schwenken, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen. Stellen Sie die Schale bei 37 Grad Celsius, 5% Kohlendioxid und 85 bis 95% Luftfeuchtigkeit in einen Zellkulturinkubator.Beobachten Sie die Zellen unter dem Mikroskop, bis der Konfluenzwert 80 bis 90% erreicht Bei hoher Konfluenz entfernen Sie das Medium, waschen Sie die Zellen mit warmem PBS und fügen Sie drei bis fünf Milliliter 0,25% Trypsin-EDTA hinzu, um die Zellen von der Oberfläche zu lösen. Nach etwa fünf Minuten betrachten Sie die Zellen unter einem Mikroskop. Wenn alle Zellen schwimmen, fügen Sie mindestens vier Milliliter Medium hinzu und übertragen Sie die Zellsuspension in ein neues steriles Röhrchen.Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer und fügen Sie eine Million Zellen in jede Vertiefung einer Sechs-Well-Platte zur Transfektion ein. Um eine Transfektion des HiBiT-RBD-Plasmids durchzuführen, verwenden Sie ein Mikrogramm des HiBiT-RBD-Expressionsplasmids mit einem geeigneten Transfektionsreagenz. 10 bis 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren und dann das Gesamtvolumen zu jeder Vertiefung der Platte tropfenweise hinzufügen.Ersetzen Sie am nächsten Tag das Medium, das die Transfektionsmischung enthält, durch ein vollständiges Medium. Beobachten Sie die Transfektionskontrolle 48 Stunden nach der Transfektion gut. Sammeln Sie den Überstand in 1,5 Milliliter Mikroröhrchen.Fügen Sie 500 Mikroliter 1X passiven Lysepuffer oder PLB zu den Zellen hinzu, inkubieren Sie dann und schütteln Sie die Platte für 15 Minuten bei Raumtemperatur für die Zelllyse. Um das Lumineszenzsignal des Bioreporters mit einem Luciferase-Assay zu bewerten, bereiten Sie zunächst die Reaktionskomponenten vor und verwenden Sie den Überstand als Quelle des Bioreporters. Verdünnen Sie das große BiT und das Substrat vor Gebrauch auf 1X.Übertragen Sie 50 Mikroliter des Überstands von jedem Bohrloch oder Röhrchen auf eine 96-Well-Platte und fügen Sie 50 Mikroliter 1X großes BiT zu jedem Bohrloch hinzu. Fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Öffnen Sie die Luminometer-Software, fügen Sie 50 Mikroliter 1X-Substrat zu jeder Vertiefung hinzu, legen Sie die Platte in das Luminometer und führen Sie die Software aus.Um den HiBiT-RBD-Antikörper-Nachweis-Assay durchzuführen, bereiten Sie den HiBiT-RBD-Bioreporter wie zuvor beschrieben vor und kombinieren Sie 50 Mikroliter des HiBiT-RBD-haltigen Überstands mit einem Mikrogramm des kommerziellen SARS-CoV-2 RBD-Antikörpers in einem 1,5 Milliliter Mikroröhrchen. Fügen Sie der Lösung 20 Mikroliter Immunglobulin-bindendes Protein oder Protein G hinzu. Bringen Sie das Gesamtvolumen auf 300 Mikroliter durch Hinzufügen von PBS.Inkubieren Sie die Röhrchen 30 Minuten lang auf einem Tubenschüttler oder Rotator. Zentrifuge bei 12.000 G für 30 Sekunden. Entsorgen Sie dann den Überstand und waschen Sie ihn mit PBS.Wiederholen Sie den Vorgang dreimal, um das freie HiBiT-RBD zu entfernen. Resuspendieren Sie die Zellen in 50 Mikroliter PBS und übertragen Sie sie auf eine 96-Well-Platte. Fügen Sie 50 Mikroliter 1X großes BiT hinzu und warten Sie fünf Minuten.Dann fügen Sie 50 Mikroliter 1X NanoLuc-Substrat hinzu. Sofort das Lumineszenzsignal mit einem Luminometer ablesen. Bereiten Sie größere Mengen des HiBiT-RBD-Bioreporters für einen Hochdurchsatz-Assay vor und kombinieren Sie 20 Mikroliter magnetisches Protein G mit 50 Mikrolitern des HiBiT-RBD-Überstands in jeder Vertiefung einer 96-Well-Platte für jede Probe.Fügen Sie 10 Mikroliter der Serumprobe zu jeder Vertiefung hinzu und bringen Sie das Gesamtvolumen durch Zugabe von PBS auf 150 Mikroliter. 30 Minuten auf einem Shaker bei Raumtemperatur inkubieren. Legen Sie dann die Platte auf eine magnetische Unterlegscheibe, um den Protein G-Antikörperkomplex auszulösen.Entsorgen Sie die Lösung im mittleren Abschnitt jeder Vertiefung und fügen Sie PBS zum Waschen hinzu. Wiederholen Sie den Waschschritt mindestens dreimal, um überschüssige HiBiT-RBD zu entfernen. Fügen Sie 50 Mikroliter 1X PBS und 50 Mikroliter 1X großes BiT hinzu und inkubieren Sie mindestens fünf Minuten bei Raumtemperatur.Bereiten Sie die Luminometer-Software vor. Dann fügen Sie 50 Mikroliter 1X-Substrat hinzu. Legen Sie die Platte in die Maschine, führen Sie eine Software aus und zeichnen Sie die Signale auf.Vergleichen Sie die Signale von Serumproben, Kontrollproben und Hintergrundsignalen von leeren Vertiefungen. Die Signale sowohl des HiBiT-RBD-haltigen Zelllysat als auch des Überstandes der transfizierten Zellen wurden aufgezeichnet, um die geeignete Proteinquelle zu bewerten. Die Daten zeigten einen niedrigen Hintergrund im Vergleich zu einem starken Signal, wenn beide Teile kombiniert wurden.Die Zugabe von Protein G hilft bei der Antikörperfällung. Der Assay wurde verwendet, um das Signal eines kommerziellen SARS-CoV-2-neutralisierenden Antikörpers mit einem Kontroll-IgG zu vergleichen. Das spezifische Antikörpersignal war robust, während der Kontrollantikörper nahe am lumineszierenden Hintergrundniveau lag.Rekombinantes abgeschwächtes onkolytisches vesikuläres Stomatitisvirus oder VSV mit einer Mutation an Position 51 des M-Proteins, das exprimierende exprimierende RBD, wurde zur Impfung von Mäusen verwendet. Das serum, das von geimpften Mäusen gesammelt wurde, erzeugte ein robustes Signal im Vergleich zu keinem Signal bei Mäusen, die mit Kontroll-VSV injiziert wurden. Dieses Protokoll kann für den Nachweis der SARS-CoV-2-Antikörper in Serumproben von Patienten verwendet werden.Die Waschschritte nach der Inkubation mit Protein G sind entscheidend für die Reduzierung des Hintergrunds. Darüber hinaus ist es wichtig, das Substrat so schnell wie möglich hinzuzufügen, um Signalverluste zu vermeiden. Mit ein paar zusätzlichen Optimierungsschritten kann derselbe Assay zur Analyse von Blutproben verwendet werden und könnte eine effektive Methode zur Bestimmung von Anti-SARS-CoV-2-Antikörpern in Patientenblutproben sein.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Quantitative, High-Throughput-, Echtzeit-und Label-free biomolekularen Erkennung (DNA, Proteine, etc.) auf...

Biomolekulare Erkennung Einsatz der Interferometrische Reflectance Imaging Sensor (IRIS)

Das Video zeigt den Luciferase-Assay, der zur Quantifizierung von Luciferase-markierten Proteinen verwendet wird. Der Assay verwendet ein künstlich hergestelltes Luciferase-Enzym, das aus einem großen Fragment besteht, das an das kleine Fragment bindet, das mit einem Protein von Interesse konjugiert ist. Die gebundenen Untereinheiten bilden ein aktives Enzym, das in Gegenwart des Substrats ein Lumineszenzsignal freisetzt. Dieses Signal wird dann mit einem Luminometer quantifiziert.

Der Luciferase-Assay: Ein Hochdurchsatz-Assay zur Messung von Lumineszenzsignalen mit Hilfe von Bioreportern auf Basis von Nanoluziferase-Systemen

In diesem Video zeigen wir den auf dem HiBit-RBD-Bioreporter-System basierenden Assay zum Nachweis von SARS-CoV-2-neutralisierenden Antikörpern. Dieses System zielt auf die virale RBD-Domäne ab, indem es ein biolumineszierendes Reportersystem verwendet, das HiBiT enthält, das mit der RBD-Domäne fusioniert ist.

Bioreporter-Assay: Eine empfindliche Technik mit einem biolumineszierenden Reportersystem zum Nachweis von SARS-CoV-2-Antikörpern

Das hier beschriebene Protokoll skizziert eine schnelle und effektive Methode zur Messung neutralisierender Antikörper gegen das SARS-CoV-2-Spike-Protein, indem die Fähigkeit rekonvaleszenter Serumproben bewertet wird, die Infektion durch ein verbessertes grün fluoreszierendes proteinmarkiertes vesikuläres Stomatitisvirus zu hemmen, das mit Spike-Glykoprotein pseudotypisiert ist.

Nachweis von SARS-CoV-2 neutralisierenden Antikörpern mittels Hochdurchsatz-Fluoreszenzbildgebung von Pseudovirus-Infektionen

Ein Flow-Analysesystem für perlenbasierte Multiplex-Assays, das eine Zwei-Reporter-Ablesung ermöglicht, wurde für die Entwicklung von multiplex-serologischen und Antikörper-Neutralisationsassays verwendet, die gleichzeitig neutralisierende IgG- und IgM-Antikörper für SARS-CoV-2 messen können.

Ein schneller Multiplex-Dual-Reporter-IgG- und IgM-SARS-CoV-2-Neutralisationsassay für ein multiplexed Bead-basiertes Durchflussanalysesystem

In diesem Protokoll ermöglichen Quantenpunkte, die an rekombinante SARS-CoV-2-Spike konjugiert sind, zellbasierte Assays, die Spike-Bindung an hACE2 an der Plasmamembran und die anschließende Endozytose der gebundenen Proteine in das Zytoplasma zu überwachen.

Konfokale Hochdurchsatz-Bildgebung von quantenpunktkonjugierten SARS-CoV-2-Spike-Trimern zur Verfolgung von Bindung und Endozytose in HEK293T-Zellen

Dieser Artikel beschreibt eine geeignete Methode zur gleichzeitigen Überwachung dynamischer Veränderungen in Antikörpertitern für zwei Immunglobulin-Isotypen (entweder IgA, IgM oder IgG), die sich aus einer Immunantwort auf eine SARS-CoV-2-Infektion oder -Impfung ergeben. Dieses "Multianalyte Covid-19 Immune Response Panel" verwendet drei indirekte Immunoassays, die auf codierten Mikrosphären basieren und mit einem flussbasierten Multiplex-Leser mit "Dual-Channel"-Fähigkeit gelesen werden.

Dynamisches Monitoring der Serokonversion mittels Multianalyte Immunobead Assay für Covid-19

Das vorliegende Protokoll beschreibt neue Werkzeuge für SPR-Bindungsassays zur Untersuchung der CV-N-Bindung an HA, S-Glykoprotein, verwandte Hybrid-Glykane und High-Mannose-Oligosaccharide. SPR wird verwendet, um das KD für die Bindung von entweder dimerem oder monomerem CV-N an diese Glykane zu bestimmen.

Entwicklung antiviraler Wirkstoffe mittels Oberflächenplasmonenresonanz

Hier beschreiben wir einen neu entwickelten Multiplex-Fluoreszenz-Immunoassay, der ein durchflusszytometrisches System mit zwei Reportern verwendet, um gleichzeitig zwei einzigartige Spike-Protein-Epitope auf intakten Viruspartikeln des schweren akuten respiratorischen Syndroms Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) zu detektieren, die von Angiotensin-konvertierenden Enzym-2-gekoppelten magnetischen Mikrosphären eingefangen wurden.

Profilierung von Oberflächenprotein-Epitopen auf viralen Partikeln mittels Multiplex-Dual-Reporter-Strategie

Wir beschreiben eine kürzlich entwickelte Immunoassay-Plattform, die auf den Prinzipien der zellfreien synthetischen Biologie und der Dot-Blot-Technik zum individualisierbaren Nachweis der Antikörperantwort in menschlichen und tierischen Seren basiert.

Zellfreier Dot-Blot als praktische und anpassungsfähige Immunoassay-Plattform zum Nachweis der Antikörperantwort in humanen und tierischen Seren

Erfahren Sie einen hochdurchsatzfähigen HiBiT-basierten Assay zum Nachweis von SARS-CoV-2-Antikörpern in Patientenserum. Diese Methode kombiniert Schnelligkeit und Sensitivität für die serologische Diagnostik.

Nachweis eines SARS-CoV-2-Rezeptor-bindenden Domänenantikörpers mit einem HiBiT-basierten Bioreporter

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