Name: In situ Erforschung der murinen Megakaryopoese mittels Transmissionselektronenmikroskopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-08T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: Lernen Sie die Untersuchung der Megakaryozyten-Ultrastruktur in murinem Knochenmark mittels Transmissionselektronenmikroskopie. Diese Methode ermöglicht die präzise Quantifizierung verschiedener Reifungsstadien in situ.

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Die Autoren danken Fabienne Proamer, Jean-Yves Rinckel, David Hoffmann, Monique Freund für die technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde von ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique), der Europäischen Union über den Europäischen Fonds für regionale Entwicklung (EFRE) und durch den Zuschuss ANR-17-CE14-0001-01 an H.d.S. unterstützt.

Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den europäischen Normen 2010/63/EU und dem CREMEAS-Ausschuss für die Ethik von Tierversuchen der Universität Straßburg (Comité Régional d'Ethique en Matière d'Expérimentation Animale Strasbourg) durchgeführt. Das Protokoll ist in Abbildung 1schematisch dargestellt.
1. Knochenmarkentnahme und -fixierung ( Abbildung 1A)
VORSICHT: Dieses Verfahren umfasst krebserzeugende, erbgutverändernde und/oder toxische Substanzen und wird unter einer chemischen Extraktionshaube durchgeführt. Tragen Sie geeignete Schutzausrüstung wie Handschuhe und Schutzbrillen.
<ol><li>Die fixierende Lösung bestehend aus 2,5% Glutaraldehyd in Cacodylatpuffer herstellen (siehe Ergänzungsdatei).</li>
	<li>Knochenmarksammlung<ol>
<li>Verwenden Sie erwachsene C57BL/6-Mäuse beiderlei Geschlechts im Alter von 12 bis 18 Wochen. Euthanasierung der Mäuse durch CO2-Erstickung und zervikale Luxation.</li>
		<li>Schneiden Sie mit einer dünnen Schere die Haut um den Oberschenkel und schälen Sie die Haut mit einer Pinzette ab. Entfernen Sie die Extremität der Pfote und schneiden Sie dann zwischen Hüfte und Oberschenkel. Lösen Sie die Tibia vom Femur, indem Sie an der Knieartikulation schneiden und adhärentes Gewebe an Tibias und Femuren mit einem Skalpell entfernen.</li>
		<li>Entfernen Sie die Epiphysen mit einer scharfen Rasierklinge. Während Sie den Femur mit einer Pinzette halten, verwenden Sie eine 5 ml Spritze, die mit Cacodylatpuffer mit einer 21 G Nadel gefüllt ist, um das Knochenmark in ein 15 ml Röhrchen zu spülen, das mit 2 ml Cacodylatpuffer gefüllt ist. Führen Sie dazu die Abschrägung der Nadel in die Knochenmarköffnung ein und drücken Sie langsam auf den Kolben, bis das Mark ausgestoßen ist.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Knochenmarkfixierung durch schnelles Eintauchen in Fixiermittel.<ol>
<li>Unmittelbar nach dem Spülen wird der Knochenmarkzylinder mit einer Kunststoffpipette für 60 min bei Raumtemperatur in 1 ml frische Glutaraldehyd-Fixierlösung (zuvor in 1.1 hergestellt) überführt. HINWEIS: Um das Gewebe zu erhalten, stellen Sie sicher, dass der gesamte Prozess, von der Knochendissektion bis zum Fixationsschritt, in weniger als 10 Minuten abgeschlossen ist. Stellen Sie für die Fixierung sicher, dass die Fixierlösung Raumtemperatur hat, um einen Hitzeschock zu vermeiden.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Einbetten von Knochenmark in Agarose
HINWEIS: Knochenmarkgewebe ist nicht ausreichend kohäsiv, um seine Integrität während der verschiedenen Waschschritte aufrechtzuerhalten, und Material kann leicht verloren gehen. Um dieses Problem zu überwinden, wird das Mark vor der Austrocknung mit einem Agargel bedeckt.
<ol><li>Bereiten Sie die Agaroselösung wie in der Ergänzungsdateibeschrieben vor.</li>
	<li>Waschen Sie das feste Mark aus Abschnitt 1.3 in Cacodylatpuffer und geben Sie es vorsichtig mit einer Kunststoffpipette auf einen Glasträger. Tragen Sie mit einer warmen Pipette schnell einen Tropfen 2% flüssiges Agar auf den Knochenmarkzylinder auf. HINWEIS: Das Agar erstarrt beim Abkühlen schnell. Um eine homogene Abdeckung des Knochenmarks zu gewährleisten, muss die Agarlösung warm gehalten werden, bis sie sich auf dem Objektträger ablagert.</li>
	<li>Legen Sie die Rutsche schnell schnell auf Eis, bis sich das Agar erstarrt (1-2 min).</li>
	<li>Verwenden Sie unter einem Mikroskop eine scharfe Rasierklinge, um die Extremitäten des Knochenmarkzylinders wegen der möglichen Gewebekompression in diesen Bereichen zu schneiden und zu verwerfen. Übertragen Sie die Markblöcke in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, die 1 ml Cacodylatpuffer enthalten.</li>
</ol>3. Einbetten von Knochenmark in Harz
VORSICHT: Harzbestandteile sind giftig; einige sind krebserregend und müssen vorsichtig unter einer chemischen Absaugung gehandhabt werden. Verwenden Sie geeignete Schutzausrüstung wie Handschuhe und Schutzbrillen. Osmiumtetroxid ist bei Raumtemperatur sehr flüchtig und seine Dämpfe sind sehr schädlich für Augen, Nase und Rachen. Vor der Entsorgung müssen 2% Osmiumtetroxid durch Zugabe des doppelten Volumens an Pflanzenöl neutralisiert werden.
<ol><li>Bereiten Sie das Epoxidharz wie in der Ergänzungsdateibeschrieben vor.</li>
	<li>Harzeinbettung HINWEIS: Bewahren Sie die Proben während der Inkubationen in aufeinanderfolgenden Bädern von Osmium, Uranylacetat und Ethanol in denselben Mikrozentrifugenröhrchen auf. Aspirieren Sie die Überstände mit einer Pasteurpipette. Das Volumen der für jedes Bad verwendeten Lösung muss mindestens dem 10-fachen volumen der Probe entsprechen.<ol>
<li>Die Blöcke mit 1% Osmium im Cacodylatpuffer für 1 h bei 4 °C fixieren, einmal im Cacodylatpuffer und dann einmal in destilliertem Wasser waschen.</li>
		<li>Mit 4% Uranylacetat in destilliertem Wasser für 1 h färben, zweimal in destilliertem Wasser waschen.</li>
		<li>Dehydrieren Sie durch eine abgestufte Reihe von Ethanol in destilliertem Wasser: 4 mal in 75% Ethanol für 5 min, gefolgt von 3 mal in 95% Ethanol für 20 min und dann 3 mal in 100% Ethanol für 20 min. Nehmen Sie bei diesem Schritt eine Spritze Epoxidharz aus dem Gefrierschrank. HINWEIS: Das Protokoll kann in 100% Ethanol für 1 h pausiert werden.</li>
		<li>Um eine gleichmäßige Infiltration und Polymerisation von Epoxidharz im Mark zu erhalten, inkubieren Sie zuerst die Blöcke in 2 aufeinanderfolgenden Propylenoxidbädern für 15 min.</li>
		<li>Fügen Sie eine 1: 1-Mischung aus 100% Propylenoxid und Epoxidharz hinzu und inkubieren Sie für 1 h. Legen Sie die Proben auf einen langsamen Rotationsschüttler bei Raumtemperatur.</li>
		<li>Fügen Sie 100% Epoxidharz hinzu und lassen Sie die Probe über Nacht unter Rühren inkubieren.</li>
		<li>Fügen Sie 100% Epoxidharz für 2 h Inkubation hinzu, noch unter Rühren.</li>
		<li>Legen Sie die Markblöcke unter einem Mikroskop in flache Silikonformen. Orientieren Sie die Proben so, dass eine anschließende Querschnittung des gesamten Knochenmarks möglich ist. Füllen Sie die Formen mit Epoxidharz und stellen Sie sie 48 h lang bei 60 °C ab. HINWEIS: Alle Lösungen (außer Ethanol und Propylenoxid) werden durch einen 0,22-μm-Filter filtriert, um eine Kontamination der Proben zu vermeiden. Um eine ausreichende Polymerisation des Harzes zu gewährleisten, vermeiden Sie Blasen beim Füllen der Formen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Ultradünne Schnitte (Abbildung 1B)
HINWEIS: Die Transmissions-EM erfordert dünne Gewebeschnitte, durch die Elektronen hindurchgehen können, um ein Projektionsbild des Inneren von Zellen, der Struktur und Organisation der inneren Organellen (Granula, endoplasmatisches Retikulum, Golgi) und der Anordnung der intrazellulären Zellmembranen zu erzeugen.
<ol><li>Montieren Sie den Probenblock in einer Ultra-Mikrotomstütze. Legen Sie es auf den Probenhalter. Schneiden Sie die Proben auf 45° ab, um den Überschuss an Harz um das Gewebe mit einem rotierenden Diamant- oder Wolframfräser zu entfernen.</li>
	<li>Montieren Sie die Proben auf dem Ultramikrotom mit einer Diamantmesserklinge, die mit einem Wassertank ausgestattet ist. Schneiden Sie Querschnitte von 500 nm bzw. 100 nm Dicke für histologische bzw. TEM-Analysen. Sammeln Sie schwimmende Abschnitte auf der Wasseroberfläche mit einer Schlaufe.</li>
	<li>Legen Sie den 500 nm dicken Abschnitt auf einem Glasobjektträger und die 100 nm dicken Abschnitte auf 200-mesh-Dünnstab-Kupfergittern mit einem Papierfilter darunter ab. Bereiten Sie fünf Gitter für eine Bedingung vor: Färben Sie zuerst zwei Gitter und behalten Sie die drei verbleibenden Gitter bei Bedarf als Backup.</li>
</ol>5. Toluidinblaufärbung für die Histologie
HINWEIS: Das Färben von Abschnitten für die Histologie ist aus drei Gründen wichtig: 1) um sicherzustellen, dass das Gewebe tatsächlich geschnitten wird und nicht das Harz, 2) um die Qualität des Einschlusses zu überprüfen, und 3) um die Knochenmarkprobe schnell zu bewerten. Wenn dies nicht korrekt ist, schneiden Sie tiefer in den Block.
<ol><li>Trocknen Sie die halbdünnen Schnitte auf einer Heizplatte (60 °C).</li>
	<li>Filtriertes 1% Toluidinblau/1 % Natriumborat in destilliertem Wasser auf die Objektträger geben und auf einer Heizplatte (60 °C) für 1-2 min erhitzen. Waschen Sie die Objektträger mit destilliertem Wasser und lassen Sie sie auf der Wärmeplatte trocknen.</li>
	<li>Befestigen Sie Abschnitte auf Deckgläsern mit einem Tropfen Poly(butylmethacrylat-co-methylmethacrylat) Montagemedium und untersuchen Sie unter einem Lichtmikroskop.</li>
</ol>6. Schwermetallfärbung zur TEM-Beobachtung (Abbildung 1C)
HINWEIS: Für den Kontrast wird die Oberseite der Gitter auf 100 μL Tropfen jedes nachfolgenden Bades mit einer Schlaufe invertiert. Vor der Verwendung wird jede Lösung 0,22 μm gefiltert. Entfernen Sie den Flüssigkeitsüberschuss zwischen den einzelnen Bädern, indem Sie vorsichtig die Gitterseite auf einem Filterpapier berühren.
<ol><li>Färbung mit 4% Uranylacetat in destilliertem Wasser für 5 min.</li>
	<li>3 mal in destilliertem Wasser für 5 min waschen.</li>
	<li>3 min mit Bleicitrat färben.</li>
	<li>3 mal in destilliertem Wasser für 5 min waschen.</li>
	<li>Legen Sie die Gitter an der Unterseite in Kontakt mit dem Filterpapier ab, um sie trocknen zu lassen. HINWEIS: Schwermetalle reagieren in Gegenwart von Kohlendioxid. Um die Ausscheidungen zu minimieren, vermeiden Sie Luftverschiebungen während des Kontrasts, sprechen Sie nicht, halten Sie die Umgebung ruhig und schalten Sie die Klimaanlage aus.</li>
</ol>7. TEM (Abbildung 1E)
HINWEIS: Die Schnitte werden in ein TEM-Mikroskop eingebracht und bei 120 kV untersucht.
<ol><li>Untersuchen Sie zunächst die Abschnitte bei geringer Vergrößerung (< 500x), um den allgemeinen Aspekt der Vorbereitung zu würdigen (Fehlen eines Lochs im Harz, Falten / Kompression in den Abschnitten, Ausscheidungen aufgrund von Flecken).</li>
	<li>Untersuchen Sie dann die Abschnitte mit höherer Vergrößerung (~ 2000x, um das Reifestadium zu unterscheiden). Zählen Sie manuell die Megakaryozyten aus jedem Stadium der Reifung über ganze Transversalabschnitte (siehe Repräsentative Ergebnisse zur visuellen Identifizierung jedes Stadiums). HINWEIS: Jedes Quadrat der Gitter ist als untersuchungsbedürftiger Bereich definiert (was 16000 μm2 für 200 Mesh Kupfergitter entspricht).</li>
	<li>Um die Anzahl der Megakaryozyten zu beurteilen, quantifizieren Sie nur die Quadrate, die vollständig mit einem Abschnitt bedeckt sind. Verwenden Sie dazu ein Modell, das auf dem Screening von Bereichen basiert. Beobachten Sie einen ersten Bereich von Quadraten von einem Ende des Abschnitts zu einem anderen, dann einen anderen Bereich auf die gleiche Weise usw. Mit diesem Verfahren sieben Sie den gesamten Querschnitt des Knochenmarks vollständig und systematisch Quadrat für Quadrat.</li>
	<li>Bewerten Sie für jedes Quadrat die Anzahl der Megakaryozyten der Stufe I, II oder III. HINWEIS: Höhere Vergrößerungen sind erforderlich, um die Granula, die DMS-Organisation, die Größe der zytoplasmatischen Territorien und den polylobulierten Kern zu analysieren.</li>
</ol>

<ol><li>Machlus, K. R., Italiano, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+incredible+journey%3A+From+megakaryocyte+development+to+platelet+formation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The incredible journey: From megakaryocyte development to platelet formation.</a> The Journal of Cell Biology. 201 (6), 785-796 (2013).</li>
<li>Zucker-Franklin, D., Termin, C. S., Cooper, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+changes+in+the+megakaryocytes+of+patients+infected+with+the+human+immune+deficiency+virus+%28HIV-1%29%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Structural changes in the megakaryocytes of patients infected with the human immune deficiency virus (HIV-1).</a> American Journal of Pathology. 134 (6), 9(1989).</li>
<li>Eckly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis+of+the+demarcation+membrane+system+%28DMS%29+in+megakaryocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Biogenesis of the demarcation membrane system (DMS) in megakaryocytes.</a> Blood. 123 (6), 921-930 (2014).</li>
<li>Scandola, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+electron+microscopy+to+study+megakaryocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Platelets%22%5BJournal%5D)">Use of electron microscopy to study megakaryocytes.</a> Platelets. , 1-10 (2020).</li>
<li>Behnke, O., Forer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+megakaryocytes+to+platelets%3A+platelet+morphogenesis+takes+place+in+the+bloodstream%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Haematology%22%5BJournal%5D)">From megakaryocytes to platelets: platelet morphogenesis takes place in the bloodstream.</a> European Journal of Haematology. 60, 3-23 (2009).</li>
<li>Eckly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+megakaryocyte+development+in+the+native+bone+marrow+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Platelets+and+Megakaryocytes%22%5BJournal%5D)">Characterization of megakaryocyte development in the native bone marrow environment.</a> Platelets and Megakaryocytes. 788, 175-192 (2012).</li>
<li>Brown, E., Carlin, L. M., Nerlov, C., Lo Celso, C., Poole, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+membrane+extrusion+sites+drive+megakaryocyte+migration+into+bone+marrow+blood+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Science+Alliance%22%5BJournal%5D)">Multiple membrane extrusion sites drive megakaryocyte migration into bone marrow blood vessels.</a> Life Science Alliance. 1 (2), 201800061(2018).</li>
<li>Eckly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Megakaryocytes+use+in+vivo+podosome-like+structures+working+collectively+to+penetrate+the+endothelial+barrier+of+bone+marrow+sinusoids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Megakaryocytes use in vivo podosome-like structures working collectively to penetrate the endothelial barrier of bone marrow sinusoids.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. , 15024(2020).</li>
<li>Cramer, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructure+of+platelet+formation+by+human+megakaryocytes+cultured+with+the+Mpl+ligand%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Ultrastructure of platelet formation by human megakaryocytes cultured with the Mpl ligand.</a> Blood. 89 (7), 2336-2346 (1997).</li>
<li>Heijnen, H. F. G., Debili, N., Vainchencker, W., Breton-Gorius, J., Geuze, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multivesicular+Bodies+Are+an+Intermediate+Stage+in+the+Formation+of+Platelet+%CE%B1-Granules%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Multivesicular Bodies Are an Intermediate Stage in the Formation of Platelet α-Granules.</a> Blood. 7 (7), 2313-2325 (1998).</li>
<li>Gupta, N., Jadhav, K., Shah, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emperipolesis%2C+entosis+and+cell+cannibalism%3A+Demystifying+the+cloud%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Oral+and+Maxillofacial+Pathology%22%5BJournal%5D)">Emperipolesis, entosis and cell cannibalism: Demystifying the cloud.</a> Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 21 (1), 92(2017).</li>
<li>Centurione, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+and+pathologic+emperipolesis+of+neutrophils+within+megakaryocytes+associated+with+marrow+fibrosis+in+GATA-1low+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Increased and pathologic emperipolesis of neutrophils within megakaryocytes associated with marrow fibrosis in GATA-1low mice.</a> Blood. 104 (12), 3573-3580 (2004).</li>
<li>Ellis, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relationship+between+bone%2C+hemopoietic+stem+cells%2C+and+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The relationship between bone, hemopoietic stem cells, and vasculature.</a> Blood. 118 (6), 1516-1524 (2011).</li>
<li>Bornert, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoskeletal-based+mechanisms+differently+regulate+in+vivo+and+in+vitro+proplatelet+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Cytoskeletal-based mechanisms differently regulate in vivo and in vitro proplatelet formation.</a> Haematologica. , (2020).</li>
</ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.

Die direkte Untersuchung von Megakaryozyten in ihrer natürlichen Umgebung ist unerlässlich, um Megakaryopoese und Thrombozytenbildung zu verstehen. In diesem Manuskript stellen wir eine Transmissionselektronenmikroskopie-Methode zur Verfügung, die Knochenmarkspülung und Fixierung durch Eintauchen kombiniert und es ermöglicht, die morphologischen Eigenschaften des gesamten Prozesses der Megakaryozytenmorphogenese im Knochenmark in situ zu sezieren.
Die Spülung des Knochenmarks ist ein ...

Megakaryozyten sind spezialisierte große polyploide Zellen, die im Knochenmark lokalisiert sind und für die Thrombozytenproduktion verantwortlich sind1. Sie stammen aus hämatopoetischen Stammzellen durch einen komplizierten Reifungsprozess, bei dem Megakaryozytenvorläufer zunehmend an Größe zunehmen, während sie gleichzeitig umfangreiche morphologische Veränderungen im Zytoplasma und im Zellkern erfahren2. Während der Reifung entwickeln Megakaryozyten eine Reihe von unterscheidbaren Strukturelementen, darunter: ein polylobulierter Kern, Einfärbungen der Oberflächenmembran, die das Demarkationsmembransystem (DMS) bilden, eine periphere Zone ohne Organellen, die vom Aktin-basierten Zytoskelettnetzwerk umgeben ist, und zahlreiche Organellen, darunter α-Granula, dichte Granula, Lysosomen und mehrere Golgi-Komplexe. Auf der ultrastrukturellen Ebene ist eine wesentliche Beobachtete Modifikation die zytoplasmatische Kompartimentierung in diskrete Regionen, die durch das DMS3begrenzt werden. Diese umfangreiche Versorgung mit Membranen wird die Verlängerung langer zytoplasmatischer Prozesse in der Anfangsphase der Thrombozytenproduktion vorantreiben, die sich dann im Kreislauf in Blutplättchen umwandeln. Jeder Defekt während der Megakaryozytendifferenzierung und -reifung kann die Thrombozytenproduktion in Bezug auf die Thrombozytenzahl und / oder die Thrombozytenfunktion beeinflussen. 
Die Dünnschichttransmissionselektronenmikroskopie (TEM) ist seit Jahrzehnten der bildgebende Ansatz der Wahl und bietet eine qualitativ hochwertige Ultrastruktur von Megakaryozyten, die unser Verständnis der Physiologie der Thrombopoese geprägt haben4,5. Diese Arbeit konzentriert sich auf eine standardisierte TEM-Methode, die es ermöglicht, den Prozess der Thrombozytenbiogenese in situ innerhalb der nativen Knochenmark-Mikroumgebung zu erfassen, die auch als Grundlage für die Analyse eines beliebigen Knochenmarkzelltyps dienen könnte. Wir liefern ultrastrukturelle Beispiele für die Entwicklung von Megakaryozyten von unreif bis voll ausgereift, die zytoplasmatische Prozesse in die Mikrozirkulation von Sinusoiden ausdehnen6. Wir beschreiben auch ein einfaches Verfahren zur Quantifizierung der verschiedenen Megakaryozyten-Reifungsstadien, das die Regenerations- und Thrombozytenproduktionskapazität des Knochenmarks anleitet.

<table><tbody><tr><td>2,4,6-Tri(dimethylaminomethyl)phenol (DMP-30)</td><td>Ladd Research Industries, USA</td><td>21310</td><td></td></tr><tr><td>Agarose Typ LM-3 Agar</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td> mit niedrigem Schmelzpunkt, USA <td>1670-B</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 Calciumchlorid-Hexahydrat</td><td>Merck, Deutschland</td><td>2083</td><td></td></tr><tr><td>Kupfergitter 200 Mesh Dünnstab</td><td>Oxford Instrument, Agar Scientifics, England</td><td>T200-CU</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylarsinsäure-Natriumsalz-Trihydrat</td><td>Merck, Deutschland</td><td>8.20670.0250</td><td></td></tr><tr><td>Dodecenyl-Bernsteinsäureanhydrid (DDSA)</td><td>Ladd Research Industries, USA</td><td>21340</td><td></td></tr><tr><td>Doppelschneidige rostfreie Rasierklinge</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences-EMS, USA</td><td>EM-72000</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol absolut</td><td>VWR International, Frankreich</td><td>20821296</td><td></td></tr><tr><td>Filter Papier, 90 mm Durchmesser</td><td>Whatman, England</td><td>512-0326</td><td></td></tr><tr><td>Flacheinbettende Silikonform</td><td>Oxford Instrument, Agar Scientific, England</td><td>G3533</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyd 25%</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences-EMS, USA</td><td>16210</td><td></td></tr><tr><td>Heizplatte Leica EMMP</td><td>Leica Microsystems GmbH, Österreich</td><td>705402</td><td></td></tr><tr><td>Histo Diamond Knife 45"</td><td>Kieselalge, Schweiz</td><td>1044797</td><td></td></tr><tr><td>JEOL 2100 Plus TEM Mikroskop</td><td>JEOL, Japan</td><td>EM-21001BU</td><td></td></tr><tr><td>Bleicitrat - Ultrostain 2</td><td>Leica Microsystems GmbH, Österreich</td><td>70 55 30 22</td><td></td></tr><tr><td>LX-112 Harz</td><td>Ladd Research Industries, USA</td><td>21310</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 Magnesiumchlorid-Hexahydrat</td><td>Sigma, Frankreich</td><td>M2393-100g</td><td></td></tr><tr><td>Eindeckmedium - Poly(butylmethacrylat-co-methylmethacrylat)</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences-EMS, USA</td><td>15320</td><td></td></tr><tr><td>Nadic Methylanhydrid (NMA)</td><td>Ladd Research Industries, USA</td><td>21350</td><td></td></tr><tr><td>Osmiumtetroxid 2%</td><td>Merck, Deutschland</td><td>19172</td><td></td></tr><tr><td>Propylenoxid (1,2-epoxypropan)</td><td>Sigma, Frankreich</td><td>82320-250ML</td><td></td></tr><tr><td>Kochsalzlösung injizierbare Lösung 0,9% NaCl</td><td>C.D.M Lavoisier, Frankreich</td><td>MA 575 420 6</td><td></td></tr><tr><td>Skalpell Klinge aus Chirurgenstahl</td><td>Swann-Morton,</td> <td>England.0508</td><td></td></tr><tr><td>Natriumtetraborat - Borax</td><td>Sigma, Frankreich</td><td>B-9876</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Merck, Deutschland</td><td>84100-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Spritzenfilter 0,2&Mikro; m</td><td>Pall Corporation, USA</td><td>514-4126</td><td></td></tr><tr><td>Toluidinblau</td><td>Ladd Research Industries, USA</td><td>N10-70975</td><td></td></tr><tr><td>Trimmer EM TRIM2</td><td>Leica Microsystems GmbH, Österreich</td><td>702801</td><td></td></tr><tr><td>Ultramikrotom Ultracut UCT</td><td>Leica Microsystems GmbH, Österreich</td><td>656201</td><td></td></tr><tr><td>Uranylacetat</td><td>Ladd Research Industries, USA</td><td>23620</td><td></td></tr></tbody></table>

in situ erforschung der murinen megakaryopoese mittels transmissionselektronenmikroskopie

In Situ Exploration of Murine Megakaryopoiesis using Transmission Electron Microscopy

Differenzierung und Reifung von Megakaryozyten erfolgen in enger Verbindung mit den zellulären und extrazellulären Komponenten des Knochenmarks. Diese Prozesse sind durch das allmähliche Auftreten essentieller Strukturen im Megakaryozytenzytoplasma wie einem polyploiden und polylobulierten Kern, einem internen Membrannetzwerk namens Demarkationsmembransystem (DMS) und den dichten und Alpha-Granula, die in zirkulierenden Blutplättchen gefunden werden, gekennzeichnet. In diesem Artikel beschreiben wir ein standardisiertes Protokoll für die in situ ultrastrukturelle Untersuchung von murinen Megakaryozyten mittels Transmissionselektronenmikroskopie (TEM), das die Identifizierung von Schlüsselmerkmalen ermöglicht, die ihr Reifestadium und ihre Zelldichte im Knochenmark definieren. Knochenmark wird gespült, fixiert, in Ethanol dehydriert, in Kunststoffharz eingebettet und zur Erzeugung von Querschnitten montiert. Halbdünne und dünne Schnitte werden für histologische bzw. TEM-Beobachtungen hergestellt. Diese Methode kann für jede Knochenmarkzelle in jeder EM-Einrichtung verwendet werden und hat den Vorteil, dass kleine Stichprobengrößen verwendet werden, die die Kombination mehrerer Bildgebungsansätze auf derselben Maus ermöglichen.

Histologie des Knochenmarks Die Beobachtung der Knochenmark-Toluidin-Blau-Histologie unter einem Lichtmikroskop ist der Schlüssel zur schnellen Analyse der gesamten Gewebearchitektur in Bezug auf z.B. Gewebekompaktheit, Mikrogefäßkontinuität und die Größe und Form von Megakaryozyten (Abbildung 1D). Es wird vor ultradünnen Abschnitten durchgeführt, um die Notwendigkeit zu bestimmen, tiefer in den Knochenmarkblock zu schneiden. Aufgrund ihrer riesigen Größe...

Hier stellen wir ein Protokoll zur Analyse der Ultrastruktur der Megakaryozyten in situ mittels Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) vor. Murine Knochenmarke werden gesammelt, fixiert, in Epoxidharz eingebettet und in ultradünnen Abschnitten geschnitten. Nach der Kontrastfärbung wird das Knochenmark unter einem TEM-Mikroskop bei 120 kV beobachtet.

In situ Erforschung der murinen Megakaryopoese mittels Transmissionselektronenmikroskopie

Differentiation and maturation of megakaryocytes occur in close association with the cellular and extracellular components of the bone marrow. These ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Ultrastruktur von Megakaryozyten im Knochenmark der Maus zu beobachten und die verschiedenen Reifestadien mittels hochauflösender Transmissionselektronenmikroskopie zu quantifizieren. Der Hauptvorteil ist die direkte Untersuchung von Megakaryozyten in der nativen Umgebung, die sich von in vitro kultivierten Megakaryozyten unterscheidet, die, wie wir wissen, nicht den vollständigen Reifegrad erreichen. Nachdem Sie die Tibia und die Femuren von 12 bis 18 Wochen alten C57BL / 6-Mäusen gemäß Standardprotokollen geerntet haben, verwenden Sie eine scharfe Rasierklinge, um die Epiphysen von jedem Knochen zu entfernen.Halten Sie jeden Knochen mit einer Pinzette, führen Sie eine 21-Gauge-Nadel, die an einer mit Cacodylatpuffer gefüllten Fünf-Milliliter-Spritze befestigt ist, in ein Ende des Knochens ein und spülen Sie das Knochenmark in ein 15-Milliliter-Auffangröhrchen mit zwei Millilitern frischem Cacodylatpuffer. Verwenden Sie unmittelbar nach dem Spülen eine Kunststoffpipette, um die Knochenmarkzylinder für eine 60-minütige Inkubation bei Raumtemperatur in einen Milliliter frischer Glutaraldehyd-Fixierlösung zu überführen. Um das Knochenmark in Agarose einzubetten, waschen Sie die fixierten Proben in frischem Cacodylatpuffer und verwenden Sie eine Kunststoffpipette, um das Knochenmark vorsichtig auf einen Glasobjektträger zu übertragen.Tragen Sie mit einer warmen Pipette schnell einen Tropfen 2% flüssiges Agar auf die Knochenmarkzylinder auf und legen Sie den Objektträger sofort für ein bis zwei Minuten auf Eis. Wenn das Agar erstarrt ist, verwenden Sie ein Stereomikroskop und eine scharfe Rasierklinge, um die Extremitäten jedes Knochenmarkzylinders zu verwerfen und die getrimmten Markblöcke in ein 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenröhrchen mit einem Milliliter Cacodylatpuffer zu übertragen. Für die Harzeinbettung fixieren Sie die Blöcke mit 1% Osmiumtetroxid in Cacodylatpuffer in einer chemischen Haube für eine Stunde bei vier Grad Celsius, bevor Sie die Blöcke einmal mit Cacodylatpuffer und einmal mit destilliertem Wasser waschen.Nach der Wasserwäsche färben Sie die Blöcke mit 4% Uranylacetat in destilliertem Wasser für eine Stunde, gefolgt von zwei Wäschen in destilliertem Wasser, wie gezeigt. Nach der letzten Wäsche dehydrieren Sie die Blöcke durch eine aufsteigende Reihe von Ethanol-Immersionen und destilliertem Wasser wie angegeben. Um eine gleichmäßige Infiltration und Polymerisation des Epoxidharzes im Mark zu erhalten, inkubieren Sie die Blöcke in zwei aufeinanderfolgenden Propylenoxidbädern für 15 Minuten, bevor Sie die Proben in einer Eins-zu-Eins-Mischung aus 100% Propylenoxid und Epoxidharz für eine Stunde auf einem langsamen Rotationsschüttler bei Raumtemperatur inkubieren.Am Ende der Inkubation fügen Sie 100% Epoxidharz zu den Markblöcken für eine nächtliche Inkubation unter den gleichen Bedingungen hinzu und fügen Sie dann 100% Epoxidharz für eine weitere Inkubation von zwei Stunden hinzu. Am Ende der Inkubation richten Sie die Markblöcke mit einem Mikroskop in flachen Silikonformen aus, um ihren anschließenden Querschnitt zu ermöglichen, und füllen Sie die Formen mit Epoxidharz, bevor Sie sie für 48 Stunden bei 60 Grad Celsius platzieren. Für ultradünne Schnitte montieren Sie den Probenblock auf einer Ultramikrotomstütze und montieren Sie die Halterung auf dem Probenhalter.Verwenden Sie einen Diamantfräser, um die Proben in einem Winkel von 45 Grad zu trimmen, um das überschüssige Harz um das Gewebe zu entfernen, bevor Sie eine Diamantmesserklinge mit einem Wassertank verwenden, um quer verlaufende 500 bzw. 100 Nanometer dicke Abschnitte für histologische bzw. TEM-Analysen zu schneiden, dann verwenden Sie eine Schleife, um die 500 Nanometer dicken Abschnitte, die auf der Wasseroberfläche schwimmen, auf einen Glasobjektträger zu übertragen und die 100 Nanometer dicken 100 Nanometer dicken Abschnitte abzuscheiden Schnitte auf 200 Mesh dünne Stabkupfergitter mit einem Papierfilter darunter. Für die Toluidinblaufärbung, nachdem Sie die 500 Nanometer dicken Abschnitte auf einer 60-Grad-Heizplatte gezogen haben, fügen Sie gefiltertes 1% Toluidinblau in destilliertem Wasser zu den Abschnitten für eine ein- bis zweiminütige Inkubation hinzu. Am Ende der Inkubation waschen Sie die Proben mit destilliertem Wasser.Wenn die Objektträger getrocknet sind, verwenden Sie ein Montagemedium, um die Proben mit einem Deckglas zu befestigen und die Proben durch Lichtmikroskopie zu betrachten. Für die Kontrastfärbung beschriften Sie die 100-Nanometer-Abschnitte fünf Minuten lang mit 4% Uranylacetat, gefolgt von drei fünfminütigen Waschungen mit destilliertem Wasser. Nach der letzten Wäsche die Abschnitte drei Minuten lang mit Bleicitrat einfärben, gefolgt von drei fünfminütigen Waschungen in destilliertem Wasser, wie gezeigt.Legen Sie nach dem letzten Waschen die Unterseite jedes Gitters zuerst mit einem Blatt Filterpapier in Kontakt, damit die Gitter zum Trocknen auf das Filterpapier gelegt werden können. Um die Abschnitte nach TEM zu untersuchen, wählen Sie nach dem Trocknen der Gitter eine geringe Vergrößerung, um die allgemeine Qualität der Zubereitungen zu beurteilen. Um die Anzahl der Megakaryozyten aus jedem Stadium der Reifung in jedem Querschnitt zu bestimmen, wählen Sie eine höhere Vergrößerung und quantifizieren Sie die Anzahl der Megakaryozyten der Stufen I, II oder III nur in Quadraten, die vollständig von Gewebe bedeckt sind.In dieser repräsentativen histologischen Analyse kann die Kompaktheit der Mikrogefäßkontinuität sowie größe und form der Megakaryozyten deutlich beobachtet werden. Murine Megakaryozyten sind in vier Stadien der Reifung unterteilt. Megakaryozyten im Stadium I haben einen großen Kern.Das Vorhandensein des frühesten nachweisbaren Stadiums des Abgrenzungsmembransystems ist ebenfalls ein Schlüsselkriterium dieses Stadiums. Im Stadium II beginnt die Granulatbildung und die Entwicklung des Demarkationsmembransystems wird eingeleitet. Megakaryozyten im Stadium III sind Riesenzellen mit gut entwickelten Abgrenzungsmembransystemen, klar definierten zytoplasmatischen Territorien und peripheren Zonen ohne Organellen und exzentrisch angeordneten Kernen.Das Pyrenozytenstadium der Megakaryozytenreifung ist durch einen nackten Kern gekennzeichnet. Wie dargestellt, werden Megakaryozyten häufig in Kontakt mit Endothelzellen beobachtet. Gelegentlich bilden die Megakaryozyten kurze invasive Vorsprünge, die in das Endothel eindringen, oder sie erstrecken sich in das sinusförmige Lumen.TEM ermöglicht auch die Visualisierung ultrastruktureller Details sowie das Vorhandensein hämatopoetischer Zellen, die von den Megakaryozyten verschlungen wurden. Die Knochenmarkspülung muss sorgfältig und unmittelbar nach der Knochendissektion durchgeführt werden. Um die Integrität des Gewebes zu maximieren, wird das Mark vor der Austrocknung mit einem Agargel umgeben.Nach diesem Verfahren können die Knochenmarkblöcke mit unterschiedlichen Vergrößerungen abgebildet oder für andere 3D-elektronenmikroskopische Analysen, wie z.B. die fokussierte Ionenstrahl-Rasterelektronenmikroskopie, verwendet werden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Das vorliegende Protokoll beschreibt ein neuartiges Verfahren zur Identifizierung einer Bevölkerung von orthochromatischen Erythroblasten enucleating durch multispektrale Bildgebung Durchflusszytometrie, die eine Visualisierung der Erythroblasten Enukleation Prozess.

Identifizierung einer Subpopulation Murine Erythroblast Enriched in Enucleating Veranstaltungen durch multispektrale Imaging Durchflusszytometrie

Kombinatorische 5 fluoreszierenden Proteinen markiert von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen in vivo ermöglicht klonalen Tracking über die konfokale und Zwei-Photonen-Mikroskopie, die einen Einblick in die Knochenmark blutbild Architektur während der Regeneration. Dieses Verfahren ermöglicht nicht-invasive Abbildung von Schicksal spektral kodierten HSPCs abgeleiteten Zellen in intaktem Gewebe für ausgedehnte Zeiträume nach der Transplantation.

In vivo Klonale Verfolgung von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen durch Fünf Fluoreszierende Proteine ​​mit Hilfe der konfokalen und Multiphotonen Mikroskopie Markierte

Monozyten sind Schlüsselregulatoren der angeborenen Immunität und spielen eine entscheidende Rolle bei der Erneuerung des peripheren mononukleären phagozytischen Systems und im Falle von Entzündungen. Dieses Manuskript beschreibt das Verfahren der Echtzeit-Bildgebung des Schädeldachknochenmarks der Maus, um den Mobilisierungsmechanismus der Monozyten zu untersuchen.

Tracking-Maus-Knochenmark-Monozyten<em&gt; In-vivo-</em

Wir beschreiben ein Protokoll zur Überwachung des Verhaltens von Neutrophilen und Monozyten in Mesenterialvenen unter stationären und entzündlichen Bedingungen mittels intravitaler konfokaler Mikroskopie an anästhesierten Mäusen.

Abbilden Neutrophilen und Monozyten in Mesenterialvenen von Intravitalmikroskopie an narkotisierten Ratten in Echtzeit

Intravitalen Fluoreszenz-Mikroskopie (IVFM) von der Calvarium wird in Kombination mit genetischen Tiermodelle zur Untersuchung der Referenzfahrt und Engraftment des blutbildenden Zellen des Knochenmarks (BM) Nischen angewendet.

Kombination von intravitalen Fluoreszenz-Mikroskopie (IVFM) mit genetischen Modellen Engraftment Dynamik der blutbildenden Zellen des Knochenmarks Nischen zu studieren

Monozyten sind wichtige Vermittler des Arteriogenesis im Rahmen der peripheren arteriellen Verschlusskrankheit. Mit einem Basalmembran-wie Matrix und intravitalen Mikroskopie, untersucht dieses Protokoll Monocyte homing und im Zusammenhang mit Tumor-Angiogenese nach Monocyte-Injektion in die Femoral Arterie Ligatur Mausmodell.

Intravitalen Mikroskopie Monocyte Homing und Tumor-bezogene Angiogenese in einem Mausmodell der peripheren arteriellen Verschlusskrankheit

Wir präsentieren ein Protokoll zur Untersuchung der Verteilung von Mitochondrien und endoplasmatischem Retikulum in ganzen Zellen nach genetischer Veränderung mittels korrelativer Licht- und Volumenelektronenmikroskopie einschließlich Ascorbatperoxidase 2 und Meerrettichperoxidase-Färbung, serielle Steilerstellung von Zellen mit und ohne Zielgen im selben Abschnitt und serielle Bildgebung mittels Elektronenmikroskopie.

Mitochondrien und Endoplasmatische Retikulum-Bildgebung durch korrelative Licht- und Volumenelektronenmikroskopie

Diese Methode beschreibt die durch Durchflusszytometrie gereinigte Reinigung von MEP und MKp von Mäuse femuren, Tibias und Beckenknochen.

Isolierung von Maus-Megakaryozyten-Vorläufern

Wir beschreiben hier die Methode zur Abbildung von Megakaryozyten und Blutplättchen im Knochenmark des Schädelknochens lebender Mäuse mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie.

In Vivo Zwei-Photonen-Bildgebung von Megakaryozyten und Blutplättchen im Knochenmark des Mausschädels

Hier stellen wir eine Immunphänotypisierungsstrategie zur Charakterisierung der Megakaryozytendifferenzierung vor und zeigen, wie diese Strategie die Sortierung von Megakaryozyten in verschiedenen Stadien mit einem fluoreszenzaktivierten Zellsortierer ermöglicht. Die Methodik kann auf menschliche Primärgewebe, aber auch auf Megakaryozyten angewendet werden, die in Kultur in vitroerzeugt werden.

Immunphänotypisierung und Zellsortierung von humanen MKs aus menschlichen Primärquellen oder differenziert in vitro von hämatopoetischen Vorläufern

Hier wird ein Verfahren an einer Punktionswunde zur hämostatischen Thrombusbildung vorgestellt. Die gebildeten Thromben sind groß und haben einen Durchmesser von Hunderten von Mikrometern. Daher sind Volumenbildgebungsansätze geeignet. Wir empfehlen die montierte großflächige Transmissionselektronenmikroskopie als hochauflösenden Ansatz, der vielen zur Verfügung steht, und beschreiben ein präparatives Protokoll.

Blutstillung von Punktionswunden und Vorbereitung von Proben für die Montage der großflächigen elektronenmikroskopischen Analyse

Lernen Sie die Untersuchung der Megakaryozyten-Ultrastruktur in murinem Knochenmark mittels Transmissionselektronenmikroskopie. Diese Methode ermöglicht die präzise Quantifizierung verschiedener Reifungsstadien in situ.

In situ Erforschung der murinen Megakaryopoese mittels Transmissionselektronenmikroskopie

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