Name: In vitro Induktion von menschlichen Zellpulpa-Stammzellen in Pankreaslinien (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-25T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Erfahren Sie die in vitro Induktion von menschlichen Zellpulpa-Stammzellen zu insulinproduzierenden Zellen mittels integrativer und nicht-integrativer Protokolle. Diese Methode ermöglicht funktionale insulinproduzierende Zellen für die Diabetesforschung.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

SK, WR und QDL wurden von der Veterinary Stem Cell and Bioengineering Research Unit, Ratchadaphiseksomphot Endowment Fund, Chulalongkorn University, unterstützt. TO und PP wurden von Chulalongkorn Academic Advancement in Its2nd Century Project unterstützt. CS wurde durch ein forschungsunterstützendes Stipendium der Fakultät für Veterinärwissenschaften, Chulalongkorn Academic Advancement into Its 2nd Century Project, Veterinary Stem Cell and Bioengineering Research Unit, Ratchadaphiseksomphot Endowment Fund, Chulalongkorn University und Government Research Fund unterstützt.

Diese Arbeit wurde in Übereinstimmung mit der Deklaration von Helsinki durchgeführt und von der Ethikkommission für Humanforschung, Fakultät für Zahnmedizin, Chulalongkorn University genehmigt. Humane DPSCs (hDPSCs) wurden aus menschlichem Zahnpulpagewebe isoliert, das aufgrund von Weisheitszähnenproblemen sowohl aus Prämolaren als auch aus Backenzähnen extrahiert wurde. Die Einwilligung nach Aufklärung wurde von den Patienten im Rahmen eines genehmigten Protokolls eingeholt (HREC-DCU 2018/054).
1. Integratives Induktionsprotokoll
<ol><li>Herstellung von lentiviralen Vektoren, die PDX1 tragen
	<ol>
<li>Verwenden Sie menschliche embryonale Nierenzellen (HEK) 293FT für die virale Verpackung. Kultivieren und pflegen Sie diese Zellen in Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM), ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum (FBS), 1% L-Glutamin und 1% Antibiotikum-Antimykotika.</li>
		<li>Erzeugen Sie PDX1-Lentivirus-Vektoren durch Co-Transfektion von jeweils 10 μg der Verpackungs- und Hüllplasmide und 20 μg des zielgerichteten Genplasmids in HEK293FT-Zellen unter Verwendung eines Calciumphosphat-Transfektionssystems, z. B. psPAX2, pMD2. G und human pWPT-PDX111. Stellen Sie sicher, dass die Zellen während der Zeit der Infektion zu 80% bis 90% konfluent sind.</li>
		<li>Sammeln Sie das Medium, das lentivirale Partikel enthält, 48 und 72 h nach der Transfektion.</li>
		<li>Filtern Sie das gesammelte Medium durch einen 0,45 μm-Filter; konzentrieren die Viren mit einem Zentrifugalfilter bei 100 kDa nominaler Molekulargewichts-Cut-off (NMWCO).</li>
	</ol></li>
	<li>PDX1-Überexpression <ol>
<li>Verwenden Sie Passage 3-5 hDPSC, die zu 70-80% konfluent sind. Trypsinisieren und zählen Sie die Zellen mit einem Zellzähler. 1 x 106 hDPSCs auf eine 60 mm Gewebekultur behandelte Schale aufsäen und über Nacht inkubieren.</li>
		<li>24 h später werden frische Viruspartikel aus Schritt 1.1.4 hinzugefügt, um vorbehandelte Polybrenzellen (4 μg/ml Polybren, 30 min unter 37 °C und 5 % CO2)bei der gewünschten Infektionsmultizität (MOI) zu transduzieren. In diesem Fall ist der verwendete MOI beispielsweise 20. Halten Sie die Zellen im Zellkulturinkubator 24 h bei 37 °C mit 5% CO2.</li>
		<li>Nach der 24- h-Infektionsphase das Medium, das Viruspartikel enthält, verwerfen. Fügen Sie frische Nährmedien hinzu und züchten Sie die Zellen 48 Stunden lang weiter. Alle Kulturen werden bei 37 °C und 5% CO2gehalten.</li>
		<li>Überprüfen Sie die aggregierte Morphologie der transfizierten Zellen, bevor Sie mit dem Induktionsschritt fortfahren. Die PDX1-Transduktion wird durch Genexpressionsanalyse bestätigt (Ergänzende Abbildung 1). HINWEIS: Überprüfen Sie die Zellmorphologie unter einem Mikroskop, bevor Sie mit den nächsten Schritten fortfahren.</li>
		<li>Ernte und fahren Sie mit einem dreistufigen Induktionsprotokoll (Schritt 1.3) als mikroumweltlichem Induktionsansatz fort.</li>
	</ol></li>
	<li>Dreistufiges Induktionsprotokoll HINWEIS: Das dreistufige Induktionsprotokoll führte zu einer Reihe von Pankreasdifferenzierungen von hDPSCs zu definitivem Endoderm, Pankreasendoderm / endokrinen und Pankreas-Betazellen / IPCs unter Verwendung von serumfreiem Medium (SFM) -A, SFM-B und SFM-C.<ol>
<li>Entsorgen Sie das Kulturmedium und waschen Sie dann die transduced-hDPSCs mit 1x phosphatgepufferter Lösung (PBS).</li>
		<li>0,25% ige Trypsin-EDTA-Lösung in die Zellen geben und 1 min bei 37 °C, 5%CO2inkubieren.</li>
		<li>Fügen Sie das Kulturmedium hinzu, um die Trypsinaktivität zu stoppen, und spülen Sie die Zellen vorsichtig, um die Einzelzellsuspension zu erhalten. Zählen Sie die Zellen und aliquot 1 x 106 Zellen in jedem Sammelröhrchen.</li>
		<li>Zentrifuge die Zellsuspension bei 468 x g (Relative Zentrifugalkraft: RCF), 4 °C, für 5 min. Verwerfen Sie den Überstand und bewahren Sie das Zellpellet auf.</li>
		<li>Resuspendieren Sie das Pellet in 3 mL des ersten Pankreasinduktionsmediums, d.h. serumfreies Medium (SFM)-A. Säen Sie die Zellen auf einer niedrigen Bindungskulturplatte (60 mm). Halten Sie die Zellen bei 37 °C und 5% CO2 für 3 Tage. HINWEIS: Beobachten Sie die Zellmorphologie unter einem invertierten Mikroskop, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren.</li>
		<li>Entfernen Sie SFM-A und fügen Sie 3 ml des zweiten Induktionsmediums, d. H. SFM-B, hinzu. Halten Sie die Zellen für die nächsten 2 Tage bei 37 °C, 5% CO2. HINWEIS: Beobachten Sie die Zellmorphologie unter einem invertierten Mikroskop, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren.</li>
		<li>Entfernen Sie SFM-B und fügen Sie 3 ml des dritten Induktionsmediums, d. H. SFM-C, hinzu. Halten Sie die Zellen für die nächsten 5 Tage in einem Zellkulturinkubator, der bei 37 °C mit 5% CO2gehalten wird. Wechseln Sie das Medium alle 48 h. Beobachten Sie ihre Morphologie nach 5 Tagen. HINWEIS: Jedes Induktionsmedium wird wie beschrieben mit verschiedenen Reagenzien ergänzt; SFM-A: 1% Rinderserumalbumin (BSA), 1x Insulin-Transferrin-Selen (ITS), 4 nM Aktivin A, 1 nM Natriumbutyrat und 50 μM Beta-Mercaptoethanol; SFM-B: 1% BSA, 1x ITS und 0,3 mM Taurin; und SFM C: 1,5% BSA, 1x ITS, 3 mM Taurin, 100 nM Glucagon-ähnliches Peptid (GLP)-1, 1 mM Nicotinamid und 1x nicht-essentielle Aminosäuren (NEAAs).</li>
		<li>Stellen Sie sicher, dass Sie die Zellmorphologie nach jedem Schritt unter einem invertierten Mikroskop überprüfen. Die Zellen werden stärker aggregiert und schwimmen als Kolonien.</li>
		<li>Sammeln Sie Zellkolonien für weitere Analysen. Überprüfen Sie die Morphologie und Größe der Kolonie. Durchführung einer Pankreas-Genmarkerexpressionsanalyse und Funktionsanalyse (Glucose stimulated C-peptide sekretion assay).</li>
	</ol></li>
</ol>2. Nicht-integratives Induktionsprotokoll
HINWEIS: Das nicht-integrative Protokoll ist das Backbone-Protokoll zur Bereitstellung der IPCs mit dem dreistufigen Induktionsprozess als mikroumweltlicher Induktionsansatz8,9.
<ol><li>Verwenden Sie Passage 3-5 hDPSCs bei 70%-80% Konfluenz.</li>
	<li>Entsorgen Sie das Kulturmedium und waschen Sie hDPSCs mit 1x PBS.</li>
	<li>0,25% ige Trypsin-EDTA-Lösung auf die Zellen geben und 1 min bei 37 °C, 5%CO2inkubieren.</li>
	<li>Fügen Sie das Kulturmedium hinzu, um die Trypsinaktivität zu stoppen, und pipetieren Sie die Zellen vorsichtig, um die Einzelzellsuspension zu erhalten. Zählen Sie Zellen und aliquot 1 x 106 Zellen in jedem Sammelröhrchen.<ol>
<li>Zentrifuge die Zellsuspension bei 468 x g (RCF), 4 °C, 5 min. Verwerfen Sie den Überstand.</li>
		<li>Das Pellet in SFM-A wieder auffüllen und auf eine Kulturplatte mit niedrigem Aufsatz (60 mm) aussäen. Die Zellen werden 3 Tage lang bei 37 °C und 5% CO2 kultiviert. Überprüfen Sie die Zellmorphologie unter einem invertierten Mikroskop.</li>
		<li>SFM-A entfernen, SFM-B (Tag 3) hinzufügen und dann die Zellen für die nächsten 2 Tage unter 37 °C, 5% CO2halten.</li>
		<li>SFM-B entfernen, SFM-C (Tag 5) hinzufügen und dann die Zellen für die nächsten 5 Tage unter 37 °C, 5% CO2halten. SFM-C wird alle 48 h gewechselt. HINWEIS: Jedes Induktionsmedium wird wie beschrieben mit verschiedenen Reagenzien ergänzt; SFM-A: 1% BSA, 1x ITS, 4 nM Aktivin A, 1 nM Natriumbutyrat und 50 μM Beta-Mercaptoethanol; SFM-B: 1% BSA, 1x ITS und 0,3 mM Taurin; und SFM C: 1,5% BSA, 1x ITS, 3 mM Taurin, 100 nM GLP-1, 1 mM Nicotinamid und 1x NEAAs.</li>
		<li>Stellen Sie sicher, dass Sie die Zellmorphologie unter dem invertierten Mikroskop nach jedem Schritt und an Tag 10 überprüfen. HINWEIS: Die Zellen werden aggregierter und schweben als Kolonien.</li>
		<li>Sammeln Sie Zellkolonien für weitere Analysen. Überprüfen Sie die Morphologie und Größe der Kolonie. Durchführung einer Pankreas-Genmarkerexpressionsanalyse und Funktionsanalyse (Glucose stimulated C-peptide sekretion assay).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Cho, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IDF+diabetes+atlas%3A+Global+estimates+of+diabetes+prevalence+for+2017+and+projections+for+2045%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Research+and+Clinical+Practice%22%5BJournal%5D)">IDF diabetes atlas: Global estimates of diabetes prevalence for 2017 and projections for 2045.</a> Diabetes Research and Clinical Practice. 138, 271-281 (2018).</li>
<li>Danaei, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((National%2C+regional%2C+and+global+trends+in+fasting+plasma+glucose+and+diabetes+prevalence+since+1980%3A+systematic+analysis+of+health+examination+surveys+and+epidemiological+studies+with+370+country-years+and+2.7+million+participants%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">National, regional, and global trends in fasting plasma glucose and diabetes prevalence since 1980: systematic analysis of health examination surveys and epidemiological studies with 370 country-years and 2.7 million participants.</a> Lancet. 378 (9785), 31-40 (2011).</li>
<li>Diabetes Care. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimizing+hypoglycemia+in+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Care%22%5BJournal%5D)">Minimizing hypoglycemia in diabetes.</a> Diabetes Care. 38 (8), 1583(2015).</li>
<li>Health Quality Ontario. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+transplantation%3A+an+evidence-based+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Ontario+Health+Technology+Assessment+Series%22%5BJournal%5D)">Islet transplantation: an evidence-based analysis.</a> Ontario Health Technology Assessment Series. 3 (4), 1-45 (2003).</li>
<li>Brennan, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+follow-up+of+the+Edmonton+protocol+of+islet+transplantation+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Long-term follow-up of the Edmonton protocol of islet transplantation in the United States.</a> American Journal of Transplantation. 16 (2), 509-517 (2016).</li>
<li>Korsgren, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+encapsulation%3A+Physiological+possibilities+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Islet encapsulation: Physiological possibilities and limitations.</a> Diabetes. 66 (7), 1748-1754 (2017).</li>
<li>Kuncorojakti, S., Srisuwatanasagul, S., Kradangnga, K., Sawangmake, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin-Producing+Cell+Transplantation+Platform+for+Veterinary+Practice%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Veterinary+Science%22%5BJournal%5D)">Insulin-Producing Cell Transplantation Platform for Veterinary Practice.</a> Frontiers in Veterinary Science. 7, 4(2020).</li>
<li>Sawangmake, C., Nowwarote, N., Pavasant, P., Chansiripornchai, P., Osathanon, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+feasibility+study+of+an+in+vitro+differentiation+potential+toward+insulin-producing+cells+by+dental+tissue-derived+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">A feasibility study of an in vitro differentiation potential toward insulin-producing cells by dental tissue-derived mesenchymal stem cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 452 (3), 581-587 (2014).</li>
<li>Sawangmake, C., Rodprasert, W., Osathanon, T., Pavasant, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+protocols+for+an+in+vitro+generation+of+pancreatic+progenitors+from+human+dental+pulp+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Integrative protocols for an in vitro generation of pancreatic progenitors from human dental pulp stem cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 530 (1), 222-229 (2020).</li>
<li>Kuncorojakti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alginate%2FPluronic+F127-based+encapsulation+supports+viability+and+functionality+of+human+dental+pulp+stem+cell-derived+insulin-producing+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Engineering%22%5BJournal%5D)">Alginate/Pluronic F127-based encapsulation supports viability and functionality of human dental pulp stem cell-derived insulin-producing cells.</a> Journal of Biological Engineering. 14, 23(2020).</li>
<li>Ritz-Laser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ectopic+expression+of+the+beta-cell+specific+transcription+factor+Pdx1+inhibits+glucagon+gene+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Ectopic expression of the beta-cell specific transcription factor Pdx1 inhibits glucagon gene transcription.</a> Diabetologia. 46 (6), 810-821 (2003).</li>
<li>Pampusch, M. S., Skinner, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transduction+and+expansion+of+primary+T+cells+in+nine+days+with+maintenance+of+central+memory+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Transduction and expansion of primary T cells in nine days with maintenance of central memory phenotype.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (157), (2020).</li>
<li>Fraga, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+influencing+transfection+efficiency+of+pIDUA%2Fnanoemulsion+complexes+in+a+mucopolysaccharidosis+type+I+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Factors influencing transfection efficiency of pIDUA/nanoemulsion complexes in a mucopolysaccharidosis type I murine model.</a> International Journal of Nanomedicine. 12, 2061-2067 (2017).</li>
<li>Balak, J. R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+ex+vivo+lentiviral+transduction+of+primary+human+pancreatic+exocrine+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Highly efficient ex vivo lentiviral transduction of primary human pancreatic exocrine cells.</a> Scientific Reports. 9 (1), 15870(2019).</li>
<li>Balaji, S., Zhou, Y., Opara, E. C., Soker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinations+of+Activin+A+or+nicotinamide+with+the+pancreatic+transcription+factor+PDX1+support+differentiation+of+human+amnion+epithelial+cells+toward+a+pancreatic+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Reprogramming%22%5BJournal%5D)">Combinations of Activin A or nicotinamide with the pancreatic transcription factor PDX1 support differentiation of human amnion epithelial cells toward a pancreatic lineage.</a> Cellular Reprogramming. 19 (4), 255-262 (2017).</li>
<li>Spaeth, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+a+novel+role+for+the+Pdx1+transcription+factor+in+islet+%CE%B2-Cell+maturation+and+proliferation+during+weaning%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Defining a novel role for the Pdx1 transcription factor in islet β-Cell maturation and proliferation during weaning.</a> Diabetes. 66 (11), 2830-2839 (2017).</li>
<li>Bastidas-Ponce, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foxa2+and+Pdx1+cooperatively+regulate+postnatal+maturation+of+pancreatic+%CE%B2-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Foxa2 and Pdx1 cooperatively regulate postnatal maturation of pancreatic β-cells.</a> Molecular Metabolism. 6 (6), 524-534 (2017).</li>
<li>Zhu, Y., Liu, Q., Zhou, Z., Ikeda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDX1%2C+Neurogenin-3%2C+and+MAFA%3A+critical+transcription+regulators+for+beta+cell+development+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">PDX1, Neurogenin-3, and MAFA: critical transcription regulators for beta cell development and regeneration.</a> Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 240(2017).</li>
<li>Ma, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+and+transcriptome+profiling+of+progenitor-like+colonies+derived+from+adult+mouse+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Culturing and transcriptome profiling of progenitor-like colonies derived from adult mouse pancreas.</a> Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 172(2017).</li>
<li>Tiedemann, H. B., Schneltzer, E., Beckers, J., Przemeck, G. K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hrabe+de+Angelis%2C+M.+Modeling+coexistence+of+oscillation+and+Delta%2FNotch-mediated+lateral+inhibition+in+pancreas+development+and+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Theoretical+Biology%22%5BJournal%5D)">Hrabe de Angelis, M. Modeling coexistence of oscillation and Delta/Notch-mediated lateral inhibition in pancreas development and neurogenesis.</a> Journal of Theoretical Biology. 430, 32-44 (2017).</li>
<li>Xu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+culture+promotes+the+differentiation+of+human+dental+pulp+mesenchymal+stem+cells+into+insulin-producing+cells+for+improving+the+diabetes+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional culture promotes the differentiation of human dental pulp mesenchymal stem cells into insulin-producing cells for improving the diabetes therapy.</a> Frontiers in Pharmacology. 10, 1576(2019).</li>
<li>Grimm, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineering+under+microgravity+conditions-use+of+stem+cells+and+specialized+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Tissue engineering under microgravity conditions-use of stem cells and specialized cells.</a> Stem Cells and Development. 27 (12), 787-804 (2018).</li>
<li>Tran, R., Moraes, C., Hoesli, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+clustering+enhances+PDX1+and+NKX6.1+expression+in+pancreatic+endoderm+cells+derived+from+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Controlled clustering enhances PDX1 and NKX6.1 expression in pancreatic endoderm cells derived from pluripotent stem cells.</a> Scientific Reports. 10 (1), 1190(2020).</li>
<li>Li, X. Y., Zhai, W. J., Teng, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signaling+in+pancreatic+development%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Notch signaling in pancreatic development.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (1), 48(2015).</li>
<li>Motoyama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+with+specific+soluble+factors+promotes+the+functional+maturation+of+transcription+factor-mediated%2C+pancreatic+transdifferentiated+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Treatment with specific soluble factors promotes the functional maturation of transcription factor-mediated, pancreatic transdifferentiated cells.</a> PLoS One. 13 (5), 0197175(2018).</li>
<li>Baldan, J., Houbracken, I., Rooman, I., Bouwens, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+human+pancreatic+acinar+cells+dedifferentiate+into+an+embryonic+progenitor-like+state+in+3D+suspension+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Adult human pancreatic acinar cells dedifferentiate into an embryonic progenitor-like state in 3D suspension culture.</a> Scientific Reports. 9 (1), 4040(2019).</li>
<li>Wedeken, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+murine+pancreatic+progenitors+require+epidermal+growth+factor+and+nicotinamide+for+self-renewal+and+differentiation+in+a+serum-+and+conditioned+medium-free+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Adult murine pancreatic progenitors require epidermal growth factor and nicotinamide for self-renewal and differentiation in a serum- and conditioned medium-free culture.</a> Stem Cells and Development. 26 (8), 599-607 (2017).</li>
<li>Trott, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+culture+of+self-renewing+pancreatic+progenitors+derived+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Long-term culture of self-renewing pancreatic progenitors derived from human pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Reports. 8 (6), 1675-1688 (2017).</li>
<li>Kim, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+EMSC-islet+co-localizing+composites+for+xenogeneic+porcine+islet+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Construction of EMSC-islet co-localizing composites for xenogeneic porcine islet transplantation.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 497 (2), 506-512 (2018).</li>
<li>Gauthaman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extra-embryonic+human+Wharton%27s+jelly+stem+cells+do+not+induce+tumorigenesis%2C+unlike+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+BioMedicine+Online%22%5BJournal%5D)">Extra-embryonic human Wharton's jelly stem cells do not induce tumorigenesis, unlike human embryonic stem cells.</a> Reproductive BioMedicine Online. 24 (2), 235-246 (2012).</li>
<li>Schiesser, J. V., Wells, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+beta+cells+from+human+pluripotent+stem+cells%3A+are+we+there+yet%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Generation of beta cells from human pluripotent stem cells: are we there yet.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1311, 124-137 (2014).</li>
<li>Chmielowiec, J., Borowiak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+differentiation+and+expansion+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+pancreatic+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Review+of+Diabetic+Studies%22%5BJournal%5D)">In vitro differentiation and expansion of human pluripotent stem cell-derived pancreatic progenitors.</a> The Review of Diabetic Studies. 11 (1), 19-34 (2014).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preiszugeben.

Das Erreichen einer höheren IPCs-Produktion aus MSCs spielt eine wesentliche Rolle in der Diabetestherapie. Die kritischen Schritte des integrativen Protokolls hängen von der Qualität der für die Transduktion zu verwendenden Zellen und der Qualität der transduzierten Zellen ab. Einige Zellanforderungen, die auf eine erfolgreiche Transduktion überprüft werden sollten, stellen sicher, dass sich die Zellgesundheit, das Zellbankmanagement und die Zellen in einem mitotisch aktiven Zustand befinden. Darüber hinaus spielt auch ...

Diabetes mellitus ist ein anhaltendes globales Problem. Ein Bericht der International Diabetes Federation (IDF) schätzte, dass die globale Prävalenz von Diabetes von 151 Millionen im Jahr 2000 auf 415 Millionen im Jahr 2015 steigen würde1,2. Die jüngste epidemiologische Studie hat vorhergesagt, dass die geschätzte weltweite Diabetesprävalenz von 451 Millionen im Jahr 2017 auf 693 Millionen im Jahr 2045 steigen wird1. Der Erfolg der Pankreas-Inseltransplantation mit dem Edmonton-Protokoll wurde erstmals im Jahr 2000 nachgewiesen, als gezeigt wurde, dass sie die endogene Insulinproduktion aufrechterhält und den normoglykämischen Zustand bei Typ-I-Diabetikern stabilisiert3. Die Anwendung des Edmonton-Protokolls steht jedoch immer noch vor einem Engpassproblem. Die begrenzte Anzahl von Leichenspendern ist das Hauptproblem, da jeder Patient mit Typ-I-Diabetes mindestens 2-4 Inselspender benötigt. Darüber hinaus kann die langfristige Anwendung von Immunsuppressiva lebensbedrohliche Nebenwirkungen verursachen4,5. Um dies zu beheben, hat sich die Entwicklung einer potenziellen Therapie für Diabetes in den letzten zehn Jahren hauptsächlich auf die Erzeugung wirksamer insulinproduzierender Zellen (IPCs) aus verschiedenen Quellen von Stammzellen konzentriert6.
Stammzellen wurden zu einer alternativen Behandlung bei vielen Krankheiten, einschließlich Diabetes Typ I, der durch den Verlust von Beta-Zellen verursacht wird. Die Transplantation von IPCs ist die neue vielversprechende Methode zur Kontrolle des Blutzuckers bei diesen Patienten7. Zwei Ansätze zur Erzeugung von IPCs, integrative und nicht-integrative Induktionsprotokolle, werden in diesem Artikel vorgestellt. Das Induktionsprotokoll ahmte den natürlichen Entwicklungsprozess der Bauchspeicheldrüse nach, um die ausgereiften und funktionellen IPCs8,9zu erhalten.
Für diese Studie wurden hDPSCs durch Durchflusszytometrie für die MSC-Oberflächenmarkerdetektion, das Multilineage-Differenzierungspotenzial und RT-qPCR charakterisiert, um die Expression der Stemness-Eigenschaft und der proliferativen Genmarker zu bestimmen (Daten nicht gezeigt)8,9,10. hDPSCs wurden zu definitiven Endoderm-, Pankreasendoderm-, endokrinen Pankreas- und Pankreas-Betazellen oder IPCs induziert (Abbildung 1) bzw.7. Um die Zellen zu induzieren, wurde ein dreistufiger Induktionsansatz als Backbone-Protokoll verwendet. Dieses Protokoll wurde als nicht-integratives Protokoll bezeichnet. Im Falle des integrativen Protokolls wurde der essentielle Pankreas-Transkriptionsfaktor PDX1in hDPSCs überexprimiert, gefolgt von der Induktion von überexprimiertem PDX1 in hDPSCs unter Verwendung eines dreistufigen Differenzierungsprotokolls. Der Unterschied zwischen nicht-integrativem und integrativem Protokoll ist die Überexpression von PDX1 im integrativen Protokoll und nicht im nicht-integrativen Protokoll. Die Pankreasdifferenzierung wurde in dieser Studie zwischen den integrativen und nicht-integrativen Protokollen verglichen.

<table><tbody><tr><td>Zellkultur</td>Antibiotikum-Antimykotikum <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher Scientific Corporation, USA</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>Corning&reg; 60 mm TC-behandelte Kulturschale</td><td>Corning&reg;</td><td></td><td></td>430166</tr><tr><td>Dulbecco' s Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Thermo Fisher Scientific Corporation</td><td>12800017</td><td></td></tr><tr><td>fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific Corporation</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX&trade;</td><td>Thermo Fisher Scientific Corporation</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepuffertes Kochsalzpulver (PBS), pH 7,4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3813-10PAK</td><td>Eine Packung wird zur Herstellung von 1 l PBS-Lösung mit sterilem</td></tr><tr><td>DDI Trypsin-EDTA (0,25 %)</td><td>Thermo Fisher Scientific Corporation</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td><stark>Lentiviraler Vektor mit PDX1 Zubereitung</stark></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amicon&reg; Ultra-15 Zentrifugalfilter</td><td>Merck Millipore, USA</td><td>UFC910024</td><td></td></tr><tr><td>Mensch pWPT-PDX1 Plasmid</td><td>Addgene</td><td>12256</td><td>Geschenk von Didier Trono; http://n2t.net/addgene:12256; RRID: Addgene_12256</td></tr><tr><td>Millex-HV Spritzenvorsatz-Filtereinheit, 0,45&nbsp; &Mikro; m</td><td>Merck Millipore</td><td>SLHV033RB</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G Plasmid</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td>Geschenk von Didier Trono; http://n2t.net/addgene:12259; RRID: Addgene_12259</td></tr><tr><td>Polybrene Infektion / Transfektion Reagenz</td><td>Merck Millipore</td><td>TR-1003-G</td><td></td></tr><tr><td>psPAX2 plasmid</td><td>Addgene</td><td>12260</td><td>Geschenk von Didier Trono; http://n2t.net/addgene:12260; RRID: Addgene_12260</td></tr><tr><td>Dreistufiges Induktionsprotokoll</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Activin A rekombinantes humanes Protein</td><td>Merck Millipore</td><td>GF300</td><td></td></tr><tr><td>Beta-Mercaptoethanol</td><td>Thermo Fisher Scientific Corporation</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin (BSA, Cohn-Fraktion V, fettsäurefrei)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6003</td><td></td></tr><tr><td>Glucagon-like peptide (GLP)-1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G3265</td><td></td></tr><tr><td>Insulin-Transferrin-Selen (ITS)</td><td>Invitrogen</td><td>41400-045</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>nicht-essentielle Aminosäuren (NEAAs)</td><td>Thermo Fisher Scientific Corporation</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Unbehandelte Zellkulturschale, 60 mm</td><td>Eppendorf</td><td>30701011</td><td></td></tr><tr><td>Natriumbutyrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B5887</td><td></td></tr><tr><td>Taurin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0625</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro induktion von menschlichen zellpulpa-stammzellen in pankreaslinien

In vitro Induction of Human Dental Pulp Stem Cells Toward Pancreatic Lineages

Ab dem Jahr 2000 stand der Erfolg der Pankreas-Inseltransplantation mit dem Edmonton-Protokoll zur Behandlung von Typ-I-Diabetes mellitus immer noch vor einigen Hindernissen. Dazu gehören die begrenzte Anzahl von Leichenspendern und die langfristige Verwendung von Immunsuppressiva. Mesenchymale Stammzellen (MSCs) wurden als potenzieller Kandidat als alternative Quelle für inselähnliche Zellgenerierung angesehen. Unsere früheren Berichte haben erfolgreich die Etablierung von Induktionsprotokollen zur Unterscheidung von menschlichen Zellpulpa-Stammzellen (hDPSCs) zu insulinproduzierenden Zellen (IPCs) veranschaulicht. Die Induktionseffizienz variierte jedoch stark. In diesem Artikel demonstrieren wir den Vergleich der Pankreasinduktionseffizienz von hDPSCs über integrative (mikroökumweltliche und genetische Manipulation) und nicht-integrative (mikroökumvimentale Manipulation) Induktionsprotokolle zur Bereitstellung von hDPSC-abgeleiteten IPCs (hDPSC-IPCs). Die Ergebnisse deuten auf eine unterschiedliche Induktionseffizienz für beide Induktionsansätze in Bezug auf 3-dimensionale Koloniestruktur, Ausbeute, Pankreas-mRNA-Marker und funktionelle Eigenschaften bei Multidosis-Glukose-Herausforderung hin. Diese Ergebnisse werden die zukünftige Etablierung einer klinisch anwendbaren IPCs und einer Produktionsplattform für Pankreaslinien unterstützen.

In diesem Artikel wurden die Ergebnisse beider Induktionsprotokolle verglichen. Die Diagramme beider Induktionsprotokolle sind in Abbildung 2A,Cdargestellt. In beiden Protokollen wurde die Auswertung unter einem Lichtmikroskop durchgeführt und die Bilder mit ImageJ analysiert. hDPSCs waren in der Lage, kolonieähnliche Strukturen vom ersten Tag der Induktion in beiden Induktionsprotokollen zu bilden. Die Morphologie der Kolonie war rund und dicht, und alle Kolonien schwebten ...

Dieses Protokoll stellt einen Vergleich zwischen zwei verschiedenen Induktionsprotokollen zur Differenzierung menschlicher Zellpulpa-Stammzellen (hDPSCs) gegenüber Pankreaslinien in vitrodar: dem integrativen Protokoll und dem nicht-integrativen Protokoll. Das integrative Protokoll erzeugt mehr insulinproduzierende Zellen (IPCs).

In vitro Induktion von menschlichen Zellpulpa-Stammzellen in Pankreaslinien

As of 2000, the success of pancreatic islet transplantation using the Edmonton protocol to treat type I diabetes mellitus still faced some obstacles. ...

Dieses Video zeigt die In-vitro-Induktion menschlicher Zahnpulpa-Stammzellen in Richtung Pankreaslinien. Stammzellen bieten eine alternative Behandlung bei vielen Krankheiten, einschließlich Diabetes Typ I, die Biolaging von Betazellen verursachen. Die Transplantation von insulinproduzierenden Zellen wird die neue vielversprechende Methode sein, um lebenslang zu verursachen.In diesem Video werden zwei Ansätze zur Erzeugung insulinproduzierender Zellen, einschließlich des integrativen und nicht-integrativen Induktionsprotokolls, beschrieben. Und in diesem Teil wird das Integrationsprotokoll zur Induktion insulinproduzierender Zellen aus menschlichen Zellpulpa-Stammzellen erklärt. Für das Induktionsprotokoll ist das zum Mischen des natürlichen Pankreasentwicklungsprozesses.Um die natürlichen und die funktionellen insulinproduzierenden Zellen zu erhalten. Zur Erzeugung von insulinproduzierenden Zellen aus mesenchymalen Stammzellen wie Dentalpulpa-Stammzellen wird das mehrstufige Induktionsprotokoll verwendet. Mesenchymale Stammzellen werden in den Wörtern definitives Endoderm, Pankreasendoderm, endokrine Pankreaszellen und dann Pankreas-Betazellen bzw. Insulin produzierende Zellen ver

in-vitro-induction-human-dental-pulp-stem-cells-toward-pancreatic

Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Die aktuelle Studie beschreibt eine gerichtete Differenzierung Ansatz bei der Induktion von Pankreas-Differenzierung von humanen embryonalen Stammzellen. Von großer Bedeutung ist der Befund, dass Endothelzellen Co-Kultur vermittelt Reifung von humanen embryonalen Stammzellen abgeleiteten Pankreas-Vorläuferzellen in Insulin exprimierenden Zellen.

Endothelial Cell Co-Kultur Vermittelt Reifung von humanen embryonalen Stammzellen zu Pankreas-Insulin-produzierenden Zellen in einer gerichteten Differenzierung Ansatz

Das beschriebene Verfahren Isolierung und Charakterisierung von menschlichen Zahnpulpa Stammzellen (hDPSCs) unter Verwendung...

Isolation, Charakterisierung und vergleichende Differenzierung humaner Dental Pulp Stammzellen aus bleibenden Zähne mit zwei verschiedenen Methoden abgeleitet

Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Reinigung von differenzierten humanen embryonalen Stammzellen, die in Richtung der endgültigen Endoderm zur Verbesserung der Downstream-Anwendungen und weitere Differenzierungen begangen werden.

Eine schnelle und effiziente Methode zur Reinigung von Entodermzellen generiert aus humanen embryonalen Stammzellen

Hier beschreiben wir eine 4-Stufen - Protokoll an humanen embryonalen Stammzellen zu NKX6-1 + Pankreas - Vorläufern in vitro zu differenzieren. Dieses Protokoll kann auf einer Vielzahl von menschlichen pluripotenten Stammzelllinien angewendet werden.

Effiziente Differenzierung von pluripotenten Stammzellen zu NKX6-1<sup&gt; +</sup&gt; Pancreatic Vorläufern

Hier präsentieren wir ein detailliertes Protokoll zur Unterscheidung von menschlicher pluripotenter Stammzellen (hPSCs) in Bauchspeicheldrüse/Zwölffingerdarm Homeobox Protein 1+ (PDX1+) Zellen für die Erzeugung von Pankreas Linien auf Basis des-Kolonie Typ Monolage Wachstums der einzelne Zellen zu trennen. Diese Methode ist geeignet für die Herstellung von homogenen hPSC-abgeleitete Zellen, Genmanipulation und Überprüfung.

Effiziente Generation der Bauchspeicheldrüse/Zwölffingerdarm Homeobox Protein 1+ Posterior Foregut/Bauchspeicheldrüsen-Vorfahren aus hPSCs in Haftung Kulturen

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die menschlichen Dental Pulp Stammzellen isoliert und Vermehrung um das Prion-Protein-Expression bei neuronalen Differenzierungsprozess zu bewerten.

Isolation, Vermehrung und Prion-Protein-Expression während neuronaler Differenzierung von Stammzellen menschlichen Zahnpulpa

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine verbesserte Methode zur Erhöhung der Koexpression von PDX1- und NKX6.1-Transkriptionsfaktoren in Pankreas-Vorläuferzellen aus humanen pluripotenten Stammzellen (hPS-Zellen) in planaren Monoschichten. Dies wird erreicht, indem die frische Matrix aufgefüllt, die Zelldichte manipuliert und die endodermalen Zellen dissoziiert werden.

Differenzierung humaner pluripotenter Stammzellen zu Betazellvorläufern der Bauchspeicheldrüse in einem 2D-Kultursystem

Dieser Artikel enthält eine schrittweise Anleitung zur Etablierung einer Primärkultur von Zahnpulpa-Stammzellen unter Verwendung der Explantatkulturmethode und zur Charakterisierung dieser Zellen auf der Grundlage der ICSCRT-Richtlinien. Die durch dieses Protokoll isolierten Zellen können als mesenchymale Stammzellen für weitere Anwendungen betrachtet werden.

Primärkultur von Stammzellen der Zahnpulpa

Dieser Artikel stellt ein Protokoll für die gerichtete Differenzierung und funktionelle Analyse von β-zellähnlichen Zellen vor. Wir beschreiben optimale Kulturbedingungen und Passagen für humane pluripotente Stammzellen, bevor insulinproduzierende Pankreaszellen erzeugt werden. Die sechsstufige Differenzierung schreitet von der endgültigen Endodermbildung bis hin zu funktionellen β-Zell-ähnlichen Zellen fort, die Insulin als Reaktion auf Glukose absondern.

Optimiertes Protokoll zur Erzeugung funktioneller Insulin-sezernierender Zellen der Bauchspeicheldrüse aus humanen pluripotenten Stammzellen

Dieses Protokoll konzentriert sich auf die Extraktion, Kultivierung und Konservierung von multipotenten Stammzellen aus Zahnpulpa durch enzymatischen Verdau. Darüber hinaus demonstriert es ihr Potenzial, sich in Osteoblasten, Adipozyten und Chondrozyten zu differenzieren, was die Bedeutung von Präzision und Konsistenz in diesem Prozess unterstreicht.

Isolierung, Kultivierung und Charakterisierung von Stammzellen der Zahnpulpa aus menschlichen Milchzähnen und bleibenden Zähnen

Erfahren Sie die in vitro Induktion von menschlichen Zellpulpa-Stammzellen zu insulinproduzierenden Zellen mittels integrativer und nicht-integrativer Protokolle. Diese Methode ermöglicht funktionale insulinproduzierende Zellen für die Diabetesforschung.

In vitro Induktion von menschlichen Zellpulpa-Stammzellen in Pankreaslinien

Weitere Videos entdecken