Name: Isolierung von Maus-Megakaryozyten-Vorläufern (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: Lernen Sie die effiziente Isolierung von Megakaryozyten-Vorläufern (MEP und MKp) aus Maus-Knochenmark mittels magnetischer Depletion und Durchflusszytometrie. Diese ethisch optimierte Methode maximiert die Zellausbeute und ermöglicht funktionelle Analysen.

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Die Autoren danken Monique Freund, Catherine Ziessel und Ketty für die technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde von ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique) und von Grant ANR-17-CE14-0001-01 an Henri.de la unterstützt. Salle.

Die Protokolle mit Tieren wurden in Übereinstimmung mit dem CREMEAS-Ausschuss für die Ethik von Tierversuchen der Universität Straßburg (Comité Régional d'Ethique en Matière d'Expérimentation Animale Strasbourg) durchgeführt. Genehmigungsnummer: E67-482-10).
1. Sammlung von Mausknochen
<ol><li>Opfern Sie das Tier in Übereinstimmung mit den institutionellen Richtlinien. HINWEIS: Die in diesem Manuskript präsentierten Daten stammen von C57Bl/6-Mäusen im Alter von 8 bis 12 Wochen. Die Anzahl der erhaltenen Zellen und die Häufigkeit der zitierten Populationen können je nach Alter und Mausstamm variieren.</li>
	<li>Besprühen Sie den Körper mit 70% Ethanol.</li>
	<li>Machen Sie mit einer Schere einen 0,5-1 cm langen Schnitt der Haut senkrecht zur Wirbelsäule und reißen Sie die Haut um den ganzen Körper herum. Ziehen Sie die Haut vom Unterkörper herunter und entfernen Sie die Haut.</li>
	<li>Legen Sie das Tier mit dem Gesicht nach unten auf das Sezierpad. Lokalisieren Sie die Beckenknochen, indem Sie Ihre Finger entlang der freiliegenden Wirbelsäule von oben nach unten gleiten lassen. Um den Beckenkamm zu lokalisieren, identifizieren Sie die kleine Beule in der Lendengegend in der Nähe der Hinterbeine (die anterosuperiorische Region des Beckenknochens). Abbildung 1A,B zeigt eine schematische Darstellung der Anatomie der Maus.</li>
</ol><img alt="Röntgenaufnahme und Diagramm der Anatomie des Beckenknochens, des Oberschenkelknochens und des Schienbeins der Maus für die Skelettforschung und -analyse." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62498/62498fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Abbildung 1: Anatomie der Maus. (A) Röntgenaufnahme der Maus, die die Hinterbeinknochen zeigt. Beachten Sie den Raum zwischen dem Beckenknochen und der Wirbelsäule (gelber Pfeil), wo die Schere eingeführt werden muss, um die Hinterbeine richtig vom Körper der Maus zu trennen (gelbe gepunktete Linie). (B) Schematische Darstellung der knochenmarkreichen Knochen von Interesse. Die Beckenknochen sind rot, die Oberschenkelknochen lila und die Tibias grün dargestellt. (C) Schematische Darstellung des Beckenknochens der Maus. Das Darmbein entspricht dem markreichen Teil des Beckenknochens und ist rot hervorgehoben. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62498/62498fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<ol start="5"><li>Legen Sie die Schere parallel zur Wirbelsäule gegen die Wirbel und in die Nähe der Beckenkammbeule. Fahren Sie fort, die Muskeln entlang der Seite der Wirbelsäule über dem Beckenknochen zu schneiden, indem Sie die Schere entlang der Wirbel bis zum Schwanz gleiten lassen. HINWEIS: Dieser erste Muskelabschnitt kann auch mit einer Skalpellklinge durchgeführt werden.</li>
	<li>Legen Sie die Schere parallel zur Wirbelsäule und schneiden Sie zwischen den Wirbeln und dem Beckenkamm, wie durch die gelb gepunktete Linie in Abbildung 1Aangezeigt . Achten Sie darauf, so nah wie möglich an den Wirbeln zu bleiben. Schneiden Sie die verbleibenden Muskeln ab, um die Extremität vom Körper zu lösen. HINWEIS: Es sollte wenig bis gar keinen Widerstand geben.</li>
	<li>Wiederholen Sie dies auf der anderen Seite, um das zweite Glied zu lösen.</li>
	<li>Übertragen Sie die Gliedmaßen auf eine saubere Oberfläche und entsorgen Sie den Rest des Körpers in Übereinstimmung mit den institutionellen Richtlinien.</li>
	<li>Legen Sie die Becken-, Oberschenkel- und Tibiaknochen frei, indem Sie so viel umgebendes Gewebe wie möglich mit der Pinzette und den Skalpellen entfernen.</li>
	<li>Fahren Sie fort, den Hüftkopf vorsichtig vom Beckenknochen zu entfernen, indem Sie das distale Ende des Femurs mit der Pinzette halten, während Sie die Muskeln um die Artikulation mit den Skalpellen sanft schneiden. Wackeln Sie die Knochen, um die Luxation zu erleichtern.</li>
	<li>Kratzen Sie den verbleibenden Muskel vom Beckenknochen ab und schneiden Sie mit einem Skalpell in der Mitte der Höhle, die den Femurkopf hielt. Das Darmbein wird gehalten, da es reich an hämatopoetischen Vorläufern ist, während die dreieckige, sehr dünne Seite des Knochens verworfen wird, wie in Abbildung 1Cgezeigt.</li>
	<li>Entfernen Sie die Restgewebe um das Darmbein mit dem Skalpell und legen Sie den gereinigten Knochen in steriles PBS, ergänzt mit 2% Newborn Calf Serum (PBS-2% NBCS).</li>
	<li>Schneiden Sie mit einer Schere den Fuß vom Bein am Knöchel ab.</li>
	<li>Halten Sie den unteren Teil der Tibia mit der Pinzette und kratzen Sie den Muskel in Richtung Knie. Entsorgen Sie die Fibeln und schneiden Sie mit dem Skalpell über das Tibiaplateau. Legen Sie die Tibia in steriles PBS-2% NBCS.</li>
	<li>Entfernen Sie die Restgewebe um den Femur mit Skalpellen.</li>
	<li>Halten Sie die Oberseite des Femurs mit einer Pinzette; Legen Sie die Skalpellklinge an die Basis der Kniescheibe. Wenden Sie eine Kraft in Richtung der Kniescheibe parallel zum Femur bis zur Ablösung der Kniescheibe an. Legen Sie den Femur in steriles PBS-2% NBCS. Das Entfernen der Kniescheibe bietet einen sauberen Zugang zum Einführen der Nadel für die Markspülung.</li>
</ol>2. Magnetische Erschöpfung von linienpositiven Zellen
<ol><li>Übertragen Sie die Knochen in einem Laminar-Flow-Schrank in eine sterile Petrischale, die mit sterilem PBS-2% NBCS gefüllt ist.</li>
	<li>Mit einem Skalpell den Kopf der Oberschenkelknochen abschneiden.</li>
	<li>Füllen Sie eine 1 ml Spritze mit sterilem PBS-2% NBCS und befestigen Sie eine 21 G Nadel am Auslass.</li>
	<li>Füllen Sie ein 5-ml-Polypropylenröhrchen mit 2 ml sterilem PBS-2% NBCS.</li>
	<li>Halten Sie den Femur mit der Pinzette; Führen Sie die Nadel vorsichtig in die nach der Entfernung der Kniescheibe linke Rille ein. Wenden Sie während des Einführens eine Rotation auf die Nadel an, um ein Verstopfen der Nadel zu vermeiden. Stellen Sie sicher, dass die Nadel bis zur Fase vollständig in den Knochen eingeführt ist.</li>
	<li>Übertragen Sie den Knochen mit der Nadel in das Röhrchen, das 2 ml PBS-2% NBCS enthält. Geben Sie das PBS-2% NBCS aus der Spritze ab und aspirieren Sie es, bis der Knochen klar ist.</li>
	<li>Entfernen Sie die Nadel vom Femur und führen Sie sie in das Loch auf der gegenüberliegenden Seite ein, wo sich der Femurkopf befand. Den Puffer wieder abgeben und absaugen und den Knochen entsorgen.</li>
	<li>Für den Beckenkamm und die Tibia halten Sie den Knochen mit der Pinzette; Führen Sie die Nadel vorsichtig in die offene Seite ein. Wenden Sie während des Einführens eine Rotation auf die Nadel an, um ein Verstopfen der Nadel zu vermeiden. Stellen Sie sicher, dass die Nadel bis zur Fase vollständig in den Knochen eingeführt ist. Übertragen Sie den Knochen mit der Nadel in das Röhrchen, das 2 ml PBS-2% NBCS enthält. Geben Sie das PBS-2% NBCS aus der Spritze ab und aspirieren Sie es, bis der Knochen klar ist. Entsorgen Sie die Knochen. HINWEIS: Knochen von bis zu drei Mäusen können in dieselbe Röhre gespült werden. Poolen Sie die Zellsuspensionen.</li>
	<li>Führen Sie die gepoolte Zellsuspension durch eine 40 μm Zellsiebkappe, die auf ein steriles 5 ml Polystyrolröhrchen aufgetragen wird.</li>
	<li>Fahren Sie mit dem Zählen der Zellen fort. HINWEIS: Die Zellzahl kann mit jedem Hämozytometer, mit Trypan Blue zur Beurteilung der Lebensfähigkeit oder mit jedem automatisierten Zellzähler durchgeführt werden. Eine Maus liefert typischerweise 105 ± 7 x 106 Zellen.</li>
	<li>Nehmen Sie 100 μL der Zellsuspension als Gesamtknochenmark beiseite, fügen Sie 500 μL PBS-2% NBCS hinzu und bewahren Sie es für das Färbeverfahren auf Eis auf.</li>
	<li>Die filtrierte Suspension wird durch Zentrifugieren bei 400 x g für 5 min bei 4 °C pelletiert und der Überstand entsorgt. HINWEIS: Rote Blutkörperchen können lysiert werden, indem das Pellet in frisch zubereiteter Lyselösung (1/10in dH2O) wiederverwendet wird. 5 min inkubieren, bis die Suspension klar und leuchtend rot wird, und 10 Volumen steriles PBS hinzufügen. Fahren Sie fort, die Zellen in PBS-2% NBCS durch Zentrifugation bei 400 x g für 5 Minuten bei 4 °C zu waschen. Seien Sie vorsichtig, wenn Sie den Überstand entfernen, da das Zellpellet sehr locker ist. Führen Sie eine zweite Wäsche mit PBS-2% NBCS durch Zentrifugation bei 400 x g für 5 min bei 4 °C durch und fahren Sie mit Schritt 2.13 fort.</li>
	<li>Resuspendieren Sie das Zellpellet in frisch zubereiteten primären Antikörpercocktail mit einem Verhältnis von 100 μL pro 1 x 107 Zellen. 30-45 Min. auf Eis inkubieren.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Antikörper</td>
			<td>Verdünnung</td>
		</tr>
<tr>
<td>Gr-1-Biotin</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
<tr>
<td>B220-Biotin</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mac-1-Biotin</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD3-Biotin</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD4-Biotin</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD5-Biotin</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD8-Biotin</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
<tr>
<td>TER119-Biotin</td>
			<td>1:1000</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD127-Biotin</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1.
<ol start="14"><li>10 μL der Zellsuspension in ein steriles 5 mL Polystyrolröhrchen mit der Bezeichnung Lin-Pos Fraction geben. Fügen Sie 90 μL PBS-2% NBCS hinzu und bewahren Sie es für das Färbeverfahren auf Eis auf.</li>
	<li>Fahren Sie fort, die Zellen zweimal mit sterilem PBS-2% NBCS durch Zentrifugation bei 400 x g für 5 min bei 4 °C zu waschen. Stellen Sie sicher, dass Sie die letzte Wäsche in einem sterilen 5-ml-Polypropylenröhrchen durchführen.</li>
	<li>Bereiten Sie während der Waschschritte die Perlen auf die magnetische Erschöpfung vor.<ol>
<li>Resuspendieren Sie die Perlen in der Durchstechflasche, indem Sie 30 s lang gründlich wirbeln.</li>
		<li>Übertragen Sie ein Volumen von Perlen, das zwei Perlen pro Zielzelle entspricht, in ein 5 ml Polypropylenröhrchen.</li>
		<li>Waschen Sie die Perlen zweimal mit PBS-2% NBCS, indem Sie das Röhrchen auf den Magneten legen und den Waschpuffer mit einer sterilen Pasteurpipette aus Glas entfernen.</li>
		<li>Resuspendieren Sie die Kügelchen in 500 μL sterilem PBS-2NBCS%.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Resuspendieren Sie das Pellet der markierten Zellen in 250 μL Perlen und mischen Sie vorsichtig für 5 min auf Eis. Fügen Sie 2 ml steriles PBS-2% NBCS hinzu und mischen Sie es vorsichtig. Schütteln Sie das Röhrchen nicht.</li>
	<li>Legen Sie das Rohr für 2 min auf den Magneten.</li>
	<li>Sammeln Sie die nichtmagnetische Fraktion mit einer sterilen Pasteurpipette aus Glas und geben Sie sie auf die verbleibenden 250 μL Magnetperlen. Verschließen Sie das Röhrchen mit Parafilm.</li>
	<li>Legen Sie das Rohr für 20 min bei 4 °C auf eine Rohrwalze.</li>
	<li>Fügen Sie 2 ml steriles PBS-2% NBCS hinzu und mischen Sie es vorsichtig. Schütteln Sie das Röhrchen nicht.</li>
	<li>Legen Sie das Rohr für 2 min in den Magneten.</li>
	<li>Sammeln Sie die nichtmagnetische Fraktion in einem sterilen 5-ml-Polypropylenröhrchen mit der Bezeichnung Lin-Neg-Fraktion mit einer sterilen Pasteurpipette aus Glas.</li>
	<li>Die Zellen durch Zentrifugation bei 400 x g für 5 min bei 4 °C pelletieren und den Überstand entfernen.</li>
	<li>Resuspendieren Sie die nichtmagnetischen Zellen in 500 μL sterilem PBS-2% NBCS.</li>
	<li>Fahren Sie mit dem Zählen der Zellen fort. HINWEIS: Eine Maus liefert typischerweise 3,9 ± 1,1 x 106 Zellen. Typische Abstammungsfärbungen vor und nach der Depletion sind in Abbildung 2B dargestellt.</li>
</ol>3. Zellsortierung von Megakaryozyten-Vorläufern mittels Durchflusszytometrie
<ol><li>Nehmen Sie die Röhrchen mit der Bezeichnung Total Bone Marrow, Lin-Pos Fraction und Lin-Neg Fraction.</li>
	<li>Fahren Sie fort, den Inhalt des Röhrchens Total Bone Marrow gleichmäßig in sechs sterile 5 ml Polystyrolröhrchen aufzuteilen. Beschriften Sie die Tuben mit den Zahlen 1-6.</li>
	<li>Fahren Sie fort, die Tube Lin-Pos Fraction mit der Zahl 7 zu beschriften.</li>
	<li>Fahren Sie fort, den Inhalt der Tube Lin-Neg Fraction wie folgt aufzuteilen.<ol>
<li>50 μL in ein steriles 5 mL Polystyrolröhrchen mit 250 μL sterilem PBS-2%NBCS überführen. Dann teilen Sie seinen Inhalt gleichmäßig in 3 sterile 5 ml Polystyrolröhrchen auf. Beschriften Sie diese Tuben mit den Nummern 8-10.</li>
		<li>Die restlichen 450 μL der Lin-Neg Fraction Zellsuspension entsprechen dem Röhrchen mit der Nummer 11.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Die Antikörper werden wie in Tabelle 2beschrieben in die Röhrchen gegeben.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Rohr</td>
			<td>Etikett</td>
			<td>Antikörper-Cocktail</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">Knochenmark gesamt</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>Unbefleckte Kontrolle</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>Einzelne gefärbte Steuerung</td>
			<td>CD45-FITC (1/200)</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>Einzelne gefärbte Steuerung</td>
			<td>CD45-PE (1/200)</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>Einzelne gefärbte Steuerung</td>
			<td>TER119-APC (1/200)</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>Einzelne gefärbte Steuerung</td>
			<td>CD45-PECy7 (1/200)</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td>Einzelne gefärbte Steuerung</td>
			<td>CD45-APC-Cy7 Biotin (1/200)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">Lin-Pos Fraktion</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>Einzelne gefärbte Steuerung</td>
			<td>Einzelne gefärbte Kontrolle. Streptavidin-APC-Cy7 (1:500)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">Lin-Neg-Fraktion</td>
		</tr>
<tr>
<td>8</td>
			<td>FMO FITC Steuerung</td>
			<td>c-kit-APC (1/200) + Sca-1-PE (1/200) + CD16/32-PE (1/200) + CD150-PECy7 (1/200) + Streptavidin-APC-Cy7 (1/500)</td>
		</tr>
<tr>
<td>9</td>
			<td>FMO PE-Steuerung</td>
			<td>CD9-FITC (1/200) + c-kit-APC (1/200) + CD150-PECy7 (1/200) + Streptavidin-APC-Cy7 (1/500)</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>FMO PECy7 Steuerung</td>
			<td>CD9-FITC (1/200) + C-Kit-APC (1/200) + Sca-1-PE (1/200) + CD16/32-PE (1/200) + Streptavidin-APC-Cy7 (1/500)</td>
		</tr>
<tr>
<td>11</td>
			<td>Positives Röhrchen zum Sortieren</td>
			<td>CD9-FITC (1/200) + C-Kit-APC (1/200) + Sca-1-PE (1/200) + CD16/32-PE (1/200) + CD150-PECy7 (1/200) + Streptavidin-APC-Cy7 (1/500)</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 2.
<ol start="6"><li>Inkubieren Sie auf Eis für 30-45 min im Dunkeln.</li>
	<li>Waschen Sie die Zellen mit sterilem PBS-2% NBCS durch Zentrifugation bei 400 x g für 5 min bei 4 °C.</li>
	<li>Resuspendieren Sie die Zellpellets wie folgt.<ol>
<li>Für die Röhrchen 1 bis 10 wird das Pellet in 300 μL sterilem PBS-2%NBCS, ergänzt mit 7AAD (2,5 μg/ml endg) (PBS-7AAD), resuspendiert. ACHTUNG: 7AAD ist ein DNA-Interkalans und muss daher mit entsprechender PSA (Handschuhe) gehandhabt werden.</li>
		<li>Für Röhrchen 11 wird das Pellet in sterilem PBS-7AAD in einer maximalen Konzentration von 5 x 10 6 Zellen pro ml undeinem Mindestvolumen von 1 ml resuspendiert.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiten Sie zwei Polypropylen-Sammelröhrchen mit der Bezeichnung MEP und MKp vor, die 2 ml PBS-2% NBCS enthalten. HINWEIS: Alternativ können Zellen in Abhängigkeit von der anschließenden Anwendung für die sortierten Zellen in Kulturmedium oder Zelllysepuffer gesammelt werden. Die Verwendung von Polystyrolröhrchen wird wegen möglicher Interferenzen mit den geladenen Tröpfchen, die die interessierenden Zellen enthalten, nicht empfohlen.</li>
	<li>Halten Sie alle Röhren im Dunkeln auf Eis.</li>
	<li>Fahren Sie mit der Einrichtung des Zellensortierers fort.<ol>
<li>Verwenden Sie die Röhren 1-7, um Spannung und Kompensation einzurichten, die Röhren 7-10, um die Sortiergatter für die Zellpopulationen von Interesse zu bestimmen, und Röhre 11 für die Zellsortierung.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Die ersten Schritte der Gating-Strategie zielen darauf ab, Dubletten und tote Zellen von der Analyse auszuschließen, wie in Abbildung 3beschrieben. Identifizieren Sie einzelne lebensfähige Zellen und zeigen Sie das SSC-vs Lin-APC-Cy7-Punktdiagramm an, um die Effizienz der Abstammungsverarmung zu bestätigen. Aus denLin-Zellen wird ein Gate gesetzt, um Zellen auszuwählen, die positiv für C-Kit und negativ oder dim für Sca-1 und CD16/32 sind. Ein CD9 vs CD150 Expression Dot Plot für die ausgewählten Zellen ermöglicht die Identifizierung von vier Populationen. HINWEIS: MEP- und MKp-Zellen sind beide positiv für CD150. Für CD9 können drei Ausdrucksebenen definiert werden (neg, dim und high). MKp exprimiert einen hohen CD9-Gehalt und MEP-Express-CD9 bei einer mittleren Fluoreszenzintensität. MEP Population entspricht Lin- c-Kit+ Sca-1-CD16/32-/dim CD150+ CD9dim und MKp Population entspricht Lin- c-Kit+ Sca-1-CD16/32-/dim CD150+ CD9hell. Die Unterscheidung zwischen CD9 high und CD9 dim Populationen für die CD150 positiven Zellen wird basierend auf dem maximalen Niveau der CD9-Expression in der CD150 negativen Population festgelegt. Eine Maus liefert typischerweise 5,3 ± 0,6 x 103 MKp und 27,2 ± 2,4 x 103 MEP.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Die in diesem Artikel beschriebene Methode ermöglicht die Extraktion und Reinigung von Maus-MEP und MKp. Ein wichtiger Parameter bei der Optimierung des Protokolls war es, eine ausreichende Anzahl von Zellen zu erhalten, die mit den meisten molekularen und zellulären Assays kompatibel sind. Die allgemeine Praxis der Mausknochenentnahme für die hämatopoetische Zellextraktion besteht normalerweise darin, sowohl die Femuren als auch die Tibien jeder Maus zu ernten. Der Beckenknochen, eine weitere Quelle für hämatopoetisches...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/t/62498">Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors</a>. A figure was updated.
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<img alt="Hematopoietic cell separation diagram with flow cytometry result, showing Lin+ and Lin- fractions." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62498/62498fig02.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Figure 2"> 
Figure 2: Magnetic depletion of lineage committed (Lin) cells. (A) Schematic representation of the magnetic depletion protocol. First, unsorted bone marrow cells are labeled with the biotin-conjugated rat anti-mouse antibody cocktail. Cells are then incubated with anti-rat Ig coated magnetic beads and subsequently subjected to the magnetic depletion using a strong magnet. The magnet will retain the labeled magnetic Lin+ fraction against the tube walls, while the unlabeled non-magnetic Lin- negative fraction will be collected in a new tube. (B) Lineage committed cells can be identified using fluorescent conjugated streptavidin. Typical analysis of the lineage expression in cells prior to magnetic depletion (total bone marrow) and after magnetic depletion (Lin- Fraction) N = 21. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62498/62498fig02large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
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<img alt="Hematopoietic cell separation process diagram with antibody labeling and magnet use, flow cytometry results." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62498/62498fig2v2.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Figure 2"> 
Figure 2: Magnetic depletion of lineage committed (Lin) cells. (A) Schematic representation of the magnetic depletion protocol. First, unsorted bone marrow cells are labeled with the biotin-conjugated rat anti-mouse antibody cocktail. Cells are then incubated with anti-rat Ig coated magnetic beads and subsequently subjected to the magnetic depletion using a strong magnet. The magnet will retain the labeled magnetic Lin+ fraction against the tube walls, while the unlabeled non-magnetic Lin- negative fraction will be collected in a new tube. (B) Lineage committed cells can be identified using fluorescent conjugated streptavidin. Typical analysis of the lineage expression in cells prior to magnetic depletion (total bone marrow) and after magnetic depletion (Lin- Fraction) N = 21. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62498/62498fig2v2large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62498">Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors</a>. A figure was updated.

Erratum: Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors

Blutplättchen werden von Megakaryozyten produziert. Diese großen polyploiden Zellen befinden sich im Knochenmark und stammen wie alle Blutzellen aus hämatopoetischen Stammzellen (HSC)1. Der klassische Weg der Produktion von Megakaryozyten im Knochenmark stammt von HSC und beinhaltet die Erzeugung verschiedener Vorläufer, die ihr Differenzierungspotenzial progressiv einschränken2. Der erste Vorläufer, der das Engagement für die megakaryozytäre Linie unterzeichnet, ist der Megakaryocyte-Erythrocyte Progenitor (MEP), ein bipotenter Vorläufer, der sowohl erythroide Zellen als auch Megakaryozyten produzieren kann3,4,5. Der MEP produziert dann einen unipotenten Vorläufer / Vorläufer (MKp), der sich zu einem reifen Megakaryozyten differenziert, der in der Lage ist, Blutplättchen zu produzieren. Die Mechanismen, die an der Erzeugung dieser Vorläufer beteiligt sind, sowie ihre Differenzierung und Reifung zu Megakaryozyten sind komplex und nur teilweise verstanden. Darüber hinaus sind die Heterogenität der MEP-Population in Bezug auf das Differenzierungspotenzial und das intrinsische Engagement dieser Zellen noch unklar. Um diese Prozesse zu entschlüsseln, ist es wichtig, gereinigte Populationen von MEP und MKp für feine molekulare und Einzelzellanalysen zu erhalten (oder Zugang zu ihnen zu haben).
Mehrere Studien haben bestimmte Kombinationen von Zelloberflächenmarkern für die Identifizierung von Vorläufern gezeigt, die der megakaryozytären Linie in der Maus zugesetzt sind6,7,8. Aus diesen wurde eine Methode entwickelt, die die Reinigung von MEP und MKp von Mäusen ermöglicht. Diese Methode wurde optimiert, um Zellen in ausreichender Anzahl und Qualität für eine große Anzahl von Assays zu erhalten. Aus ethischen Gründen und um die Anzahl der an den Experimenten beteiligten Tiere zu minimieren, haben wir die Entnahme des Knochenmarks aus dem Femur und der Tibia sowie aus dem Beckenkamm veranlasst. Dieser Knochen enthält eine hohe Häufigkeit und Anzahl von hämatopoetischen Vorläufern und wird die meiste Zeit während der langen Knochenentnahme beschädigt. Hier wird eine detaillierte Methode zur zuverlässigen Sammlung dieses Knochens vorgestellt.
Das zweite Optimierungskriterium ist die Herstellung hochreiner Zellpopulationen. Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS) ist eine Methode der Wahl, um gereinigte Populationen von Zellen von Interesse zu erhalten. Niedrige Erträge werden jedoch erreicht, wenn die Zellpopulation von Interesse sehr selten ist. Anreicherungsverfahren sind daher notwendig. In diesem Protokoll wurde ein negatives Selektionsverfahren unter Verwendung von Magnetperlen gewählt.

<table><tbody><tr><td>21-Gauge-Nadeln</td><td>BD Microlance</td><td>301155</td><td></td></tr><tr><td>7AAD</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9400</td><td></td></tr><tr><td>Antikörper Gr-1-biotin</td><td>eBioscience</td><td>13-5931-85</td><td>Magnetischer Abbau</td></tr><tr><td>Antikörper B220-biotin</td><td>eBioscience</td><td>13-0452-85</td><td></td></tr><tr><td>Magnetischer Abbau Antikörper Mac-1-biotin</td><td>eBioscience</td><td>13-0112-85</td><td>Magnetisch Depletion</td></tr><tr><td>Antikörper CD3e-biotin</td><td>eBioscience</td><td>13-0031-85</td><td>Magnetische Depletion</td></tr><tr><td>Antikörper CD4-biotin</td><td>eBioscience</td><td>13-9766-82</td><td>Magnetische Depletion</td></tr><tr><td>Antikörper CD5-biotin</td><td>eBioscience</td><td>13-0051-85</td><td>Magnetische Depletion</td></tr><tr><td>Antikörper CD8a-biotin</td><td>eBioscience</td><td>13-0081-85</td><td>Magnetische Depletion</td></tr> Antikörper <tr><td> TER119-biotin</td><td>eBioscience</td><td>13-5921-85</td><td>Magnetischer Abbau</td></tr><tr><td>Antikörper CD127-biotin</td><td>eBioscience</td><td>13-1271-85</td><td>Magnetischer Abbau</td></tr><tr><td>Antikörper CD45-FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-0451-85</td><td>Zellsortierung</td></tr><tr><td>Antikörper CD45-PE</td><td>eBioscience</td><td>12-0451-83</td><td>Zellsortierung</td></tr><tr><td>Antikörper TER119-APC</td><td>eBioscience</td><td>17-5921-83</td><td>Sortierung der Zellen</td></tr><tr><td>Antikörper CD45-PECy7</td><td>eBioscience</td><td>25-0451-82</td><td>Zellsortierung</td></tr><tr><td>Antikörper CD45-biotin</td><td>eBioscience</td><td>13-0451-85</td><td>Zellsortierung</td></tr><tr><td>Antikörper CD9-FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-0091-82</td><td>Zellsortierung</td></tr><tr><td>Antikörper&nbsp; c-kit-APC</td><td>eBioscience</td><td>17-1171-83</td><td>Zellsortierung</td></tr><tr><td>Antikörper Sca-1-PE</td><td>eBioscience</td><td>12-5981-83</td><td>Zellsortierung</td></tr><tr><td>Antikörper CD16/32-PE</td><td>eBioscience</td><td>12-0161-83</td><td>Zellsortierung</td></tr><tr><td>Antikörper CD150-PECy7</td><td>eBioscience</td><td>25-1502-82</td><td>Zellsortierung</td></tr><tr><td>Kulturmedium StemSpan-SFEM</td><td>Stemcell technologies</td><td>#09650</td><td></td></tr><tr><td>Dissektionskissen</td><td>Fisher Scientific</td><td>10452395</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>vWR Chemie</td><td>83813.360</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>Euronexia</td><td>P-120-AS</td><td></td></tr><tr><td>Glaspasteurpipette</td><td>Dutscher</td><td>42011</td><td></td></tr><tr><td>Magnet :&nbsp; DynaMag-5</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12303D</td><td></td></tr><tr><td>Magnetische Kügelchen: Dynabeads Schafe Anti-Ratte</td><td>IgG Thermo Fisher Scientific</td><td>11035</td><td></td></tr><tr><td>Megacult</td><td>Stemcell technologies</td><td>#04970</td><td></td></tr><tr><td>MethoCult SF M3436</td><td>Stemcell technologies</td><td>#03436</td><td></td></tr><tr><td>Neugeborenen-Kälberserum</td><td>Dutscher</td><td>50750-500</td><td></td></tr><tr><td>Lyse roter Blutkörperchen Lösung</td><td>BD Bioscience</td><td>555899</td><td></td></tr><tr><td>Skalpelle</td><td>Fisher Scientific</td><td>12308009</td><td></td></tr><tr><td>Schere</td><td>Euronexia</td><td>C-165-ASB</td><td></td></tr><tr><td>Sterile 1 mL Spritzen</td><td>BD Bioscience</td><td>303172</td><td></td></tr><tr><td>Sterile 15 ml Röhrchen</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.502</td><td></td></tr><tr><td>Sterile 5 mL Polypropylen Röhrchen</td><td>Falcon</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>Sterile 5-ml-Polystyrol-Röhrchen</td><td>Falcon</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Röhrchen mit 70 μm; m cell Siebkappe</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Petrischale</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin-APC-Cy7</td><td>BD Biosciences</td><td>554063</td><td>Zellsortierung</td></tr><tr><td>Röhrchenrolle</td><td>Benchmark Scientific</td><td>R3005</td><td></td></tr></tbody></table>

isolierung von maus-megakaryozyten-vorläufern

Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors

Knochenmark-Megakaryozyten sind große polyploide Zellen, die die Produktion von Blutplättchen sicherstellen. Sie entstehen aus hämatopoetischen Stammzellen durch Megakaryopoese. Die Endstadien dieses Prozesses sind komplex und umfassen klassischerweise die bipotenten Megakaryozyten-Erythrozyten-Vorläufer (MEP) und die unipotenten Megakaryozyten-Vorläufer (MKp). Diese Populationen gehen der Bildung von echten Megakaryozyten voraus, und als solche könnte ihre Isolierung und Charakterisierung eine robuste und unvoreingenommene Analyse der Megakaryozytenbildung ermöglichen. Dieses Protokoll stellt detailliert das Verfahren zur Sammlung hämatopoetischer Zellen aus dem Knochenmark der Maus, die Anreicherung hämatopoetischer Vorläufer durch magnetische Depletion und schließlich eine Zellsortierungsstrategie vor, die hochreine MEP- und MKp-Populationen ergibt. Zuerst werden Knochenmarkzellen aus dem Femur, der Tibia und auch dem Beckenkamm, einem Knochen, der eine hohe Anzahl hämatopoetischer Vorläufer enthält, gesammelt. Die Verwendung von Beckenkammknochen erhöht drastisch die Gesamtzellzahl pro Maus und trägt somit zu einer ethischeren Verwendung von Tieren bei. Eine magnetische Linienverarmung wurde unter Verwendung von 450 nm magnetischen Kügelchen optimiert, was eine sehr effiziente Zellsortierung mittels Durchflusszytometrie ermöglicht. Schließlich präsentiert das Protokoll die Markierungs- und Gating-Strategie für die Sortierung der beiden hochreinen Megakaryozyten-Vorläuferpopulationen: MEP (Lin-Sca-1-c-Kit+CD16/32-CD150+CD9dim) und MKp (Lin- Sca-1-c-Kit+CD16/32-CD150+CD9hell ). Diese Technik ist einfach zu implementieren und liefert genügend zelluläres Material, um i) molekulare Charakterisierung für ein tieferes Wissen über ihre Identität und Biologie, ii) In-vitro-Differenzierungsassays, die ein besseres Verständnis der Mechanismen der Reifung von Megakaryozyten liefern, oder iii) In-vitro-Modelle der Interaktion mit ihrer Mikroumgebung durchzuführen.

Die phänotypische Analyse der als MEP und MKp identifizierten Zellen wurde mittels Durchflusszytometrie durchgeführt. Die Zellen wurden mit fluoreszenzkonjugierten Antikörpern gegen CD41a und CD42c, klassische Marker der megakaryozytären und Thrombozytenlinien, markiert. Beide Marker wurden von den Zellen der MKp-Population exprimiert, während diese Marker an der Oberfläche der Zellen der MEP-Population noch nicht nachgewiesen sind (Abbildung 4Ai,4Aii). Polyploidie ist ein K...

Diese Methode beschreibt die durch Durchflusszytometrie gereinigte Reinigung von MEP und MKp von Mäuse femuren, Tibias und Beckenknochen.

Isolierung von Maus-Megakaryozyten-Vorläufern

Bone marrow megakaryocytes are large polyploid cells that ensure the production of blood platelets. They arise from hematopoietic stem cells through ...

Die Isolierung wichtiger Megakaryozyten-Vorläuferpopulationen ermöglicht die feinen Analyse der Abstammungshierarchie in der Zellkultur auf molekularen Assays bis hin zur Einzelzellebene. Dieses Protokoll kombiniert eine ethischere Praxis, indem es die Anzahl der benötigten Tiere minimiert, in einem effizienten Prozess für die Zellsortierung von MEP- und MKP-Populationen. Für Knochen sprühen Sie den Körper einer acht bis 12 Wochen alten C57 Black Six Mouse mit 70% Ethanol auf.Verwenden Sie eine Schere, um einen Punkt fünf bis einen Zentimeter Schnitt der Haut, senkrecht zur Wirbelsäule zu machen. Und reißen Sie die Haut um den ganzen Körper, indem Sie sie nach unten ziehen. Legen Sie die Maus mit dem Gesicht nach unten auf das Sezierpad und lokalisieren Sie dann die Beckenknochen, indem Sie mit den Fingern oder einer Schere entlang der freiliegenden Wirbelsäule von oben nach unten gleiten.Um den Beckenkamm zu lokalisieren, identifizieren Sie die kleine Beule in der Lendengegend in der Nähe der Hintergliedmaßen. Nachdem Sie die Schere parallel zur Wirbelsäule, gegen die Wirbel und in der Nähe der Beckenkammbeule platziert haben, schneiden Sie die Muskeln entlang der Seite der Wirbelsäule über dem Beckenknochen ab, indem Sie die Schere entlang der Wirbel bis zum Schwanz gleiten lassen. Schneiden Sie dann zwischen den Wirbeln und dem Beckenkamm und bleiben Sie so nah wie möglich an den Wirbeln.Und schneiden Sie die verbleibenden Muskeln ab, um die Extremität vom Körper zu lösen. Übertragen Sie die abgelösten Gliedmaßen auf eine saubere Oberfläche. Nachdem Sie den Rest des Körpers in Übereinstimmung mit den institutionellen Richtlinien verworfen haben, verwenden Sie Pinzette und Skalpelle, um die Becken-, Oberschenkel- und Tibiaknochen freizulegen, indem Sie das umgebende Gewebe entfernen.Verwenden Sie eine Pinzette, um das distale Ende des Femurs zu halten, und dislozieren Sie vorsichtig den Hüftkopf vom Beckenknochen, indem Sie die Muskeln um die Artikulation mit einem Skalpell sanft schneiden. Kratzen Sie den verbleibenden Muskel vom Beckenknochen ab und schneiden Sie in die Mitte der Höhle, die den Hüftkopf hielt. Bewahren Sie das Darmbein auf und verwerfen Sie die dreieckige dünne Seite des Knochens.Entfernen Sie mit einem Skalpell die Restgewebe um das Darmbein und legen Sie den gereinigten Knochen in steriles PBS, ergänzt mit 2% Newborn Calf Serum. Dann verwenden Sie eine Schere, um den Fuß vom Bein am Knöchel abzuschneiden. Halten Sie den unteren Teil der Tibia mit der Pinzette und kratzen Sie den Muskel in Richtung Knie.Entsorgen Sie das Wadenbein. Machen Sie dann mit dem Skalpell einen Schnitt über das Tibiaplateau und legen Sie die Tibia in steriles PBS 2% NBCS. Nachdem Sie die Restgewebe um den Femur entfernt haben, halten Sie die Oberseite des Femurs mit einer Pinzette fest und legen Sie die Skalpellklinge an die Basis der Kniescheibe.Wenden Sie eine Kraft in Richtung der Kniescheibe an, parallel zum Femur, um die Kniescheibe zu lösen. Dann legen Sie den Femur in steriles PBS 2% NBCS. In einem Laminar-Flow-Schrank die Knochen in eine sterile Petrischale geben, die mit sterilem PBS 2% NBCS gefüllt ist.Verwenden Sie ein Skalpell, um den Kopf der Femuren abzuschneiden. Füllen Sie eine Ein-Milliliter-Spritze mit sterilem PBS 2% NBCS und befestigen Sie eine 21-Gauge-Nadel am Auslass. Füllen Sie dann ein Fünf-Milliliter-Polypropylenröhrchen mit zwei Millilitern sterilem PBS 2% NBCS.Halten Sie den Femur mit einer Pinzette, führen Sie die Nadel nach der Kniescheibenentfernung durch Rotation in die Rille links ein, um sicherzustellen, dass die Nadel vollständig in den Knochen eingeführt wird, bis zur Fase. Nach dem Einführen der Nadel wird der Knochen mit der Nadel in das Röhrchen mit zwei Millilitern PBS 2% NBCS übertragen. Geben Sie dann das PBS 2% NBCS aus der Spritze ab und aspirieren Sie es, bis der Knochen klar ist.Entfernen Sie die Nadel vom Femur und führen Sie sie in das Loch auf der gegenüberliegenden Seite ein, wo sich der Femurkopf befand. Nach dem Dosieren und Absaugen des Puffers entsorgen Sie den Knochen. Verwenden Sie für den Beckenkamm und die Tibia eine Pinzette, um den Knochen zu halten, und führen Sie die Nadel vorsichtig in die offene Seite ein, indem Sie eine Rotation anwenden.Sicherstellen, dass die Nadel vollständig in den Knochen eingeführt wird, bis zur Fase. Dann übertragen Sie den Knochen mit der Nadel in das Röhrchen, das zwei Milliliter PBS 2% NBCS enthält. Verteilen und aspirieren Sie das PBS 2% NBCS aus der Spritze, bis der Knochen klar ist.Führen Sie die gesamte Zellsuspension durch eine 40-Mikron-Zellsiebkappe, legen Sie sie auf ein steriles Fünf-Milliliter-Polystyrolröhrchen und fügen Sie 500 Mikroliter PBS 2% NBCS hinzu. 100 Mikroliter der Zellsuspension als Gesamtknochenmark beiseite legen. Dann lagern Sie es auf Eis für den Färbevorgang.Pellet die gefilterte Suspension durch Zentrifugation. Nachdem Sie den Überstand verworfen haben, resuspen sie das Pellet in einem frisch zubereiteten primären Antikörpercocktail mit der Inkubation auf Eis für 30 bis 45 Minuten. 10 Mikroliter der Zellsuspension in ein steriles Fünf-Milliliter-Polystyrolröhrchen mit der Bezeichnung Lin Pores Fraction geben und 90 Mikroliter PBS 2% NBCS hinzufügen.Bereiten Sie in der Zwischenzeit eine Perle für die magnetische Erschöpfung vor, indem Sie sie in der Durchstechflasche mit gründlichem Wirbeln für 30 Sekunden wiederverwenden. Übertragen Sie ein Volumen von Perlen, das zwei Perlen pro Zielzelle entspricht, in ein Fünf-Milliliter-Polypropylenrohr und waschen Sie die Perlen zweimal mit PBS 2% NBCS, indem Sie das Rohr auf den Magneten legen. Nach dem Entfernen des Waschpuffers mit einer sterilen Glaspasteurpipette werden die Perlen in 500 Mikroliter sterilem PBS 2%NBCS resuspendiert.Für den ersten Schritt der magnetischen Erschöpfung fügen Sie 250 Mikroliter Perlen auf das Pellet der gewaschenen Zellen auf und inkubieren Sie mit sanftem Mischen für fünf Minuten auf Eis. Dann fügen Sie zwei Milliliter steriles PBS 2% NBCS mit schonendem Mischen hinzu und legen Sie das Röhrchen für zwei Minuten in den Magneten. Sammeln Sie die nichtmagnetische Fraktion mit einer sterilen Glaspasteurpipette.Und für den zweiten Schritt der magnetischen Erschöpfung fügen Sie es zu den verbleibenden 250 Mikrolitern magnetischer Perlen hinzu. Legen Sie das mit Paraffin versiegelte Rohr für 20 Minuten bei vier Grad Celsius auf eine Rohrwalze. Dann fügen Sie zwei Milliliter steriles PBS 2% NBCS mit sanfter Mischung hinzu.Und legen Sie die Röhre mit dem Magneten für zwei Minuten. Sammeln Sie die nichtmagnetische Fraktion in einem sterilen Fünf-Milliliter-Polypropylenröhrchen, beschriftet, nichtmagnetische Lin Neg Fraction, mit einer sterilen Glaspasterpipette, und fahren Sie mit der Zellsortierung von Megakaryozyten-Vorläufern fort, wie im Textmanuskript beschrieben. Für die Gating-Strategie zur Zellsortierung werden in der Lin Neg-Population die Zellen ausgewählt, die C-Kit exprimieren, und ein niedriges bis gar kein Expression von Sca-1- oder CD16/32-Antigen.In dieser Population werden MEP als CD150-positive und CD9-dime Zellen identifiziert. Das MKP als CD150 positive und CD9 helle Zellen. In der repräsentativen Durchflusszytometrie-Analyse wurden Zellen, die als MEP und Mkp identifiziert wurden, mit fluoreszenzkonjugierten Antikörpern für CD41a und CD42c klassische Marker der megakaryozytären und Thrombozytenlinien markiert.Beide Marker wurden von den Zellen der MKp-Population exprimiert und nicht an der Oberfläche der Zellen der MEP-Population nachgewiesen. Der DNA-Gehalt der sortierten Megakaryozyten zeigte, dass die Zellen für die MEP-Population meist 2n sind. Und ein kleiner Teil der MKp-Zellen ist fremd.Höhere Ploidiezellen wurden in diesen Populationen nicht signifikant nachgewiesen. In halbfesten klonogenen Assays wurde CFU-MK sowohl in MEP- als auch in MKp-Populationen nachgewiesen. BFU-E wurde nicht in der MKp-Population nachgewiesen, sondern in MEP und der CD150-negativen CD9 dim Progenitor-Zellpopulation.Mikroskopische Beobachtungen am dritten Tag der Differenzierung zeigen, dass MEP und MKp hauptsächlich Megakaryozyten produzierten, die als große Zellen identifiziert wurden. Megakaryozyten, die nach drei Tagen Kultur gewonnen wurden, wurden mittels CD41- und CD42c-Expression identifiziert und repräsentieren 54 bzw. 82% der Zellen, die aus MEP- bzw. MKp-Zellpopulationen hergestellt wurden. Die Ploidie der produzierten Megakaryozyten war aus den Megakaryozyten, die aus der MKp-Population stammen, im Vergleich zur MEP-Population größer.Nur die Zellen, die aus der MKp-Population stammten, waren in der Lage, Proplatelet-Emissionen durchzuführen, was auf ein fortgeschritteneres Reifestadium für die MKp-Population hindeutet. Die Verwendung des Beckenknochens erhöht sich drastisch auf die Zellzahl, während die zweistufige magnetische Depletion die Wirksamkeit der Lineage-Depletion verbessert. Dieses Protokoll ermöglicht die anschließende Kultur von MEP- und MKP-Populationen einzelner Zellen, die zusammen mit der transkriptomischen und proteomischen Analyse sicherlich die beteiligten Mechanismen entschlüsseln und die Biogenese implementiert haben.

isolation-of-mouse-megakaryocyte-progenitors

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Verfahren zur enzymatischen Dissoziation Oberfläche Kennzeichnung und Reinigung mittels Durchflusszytometrie von fibro / adipogene und myogenen Vorläuferzellen aus murinen Skelettmuskel.

Reinigung von Vorläufern aus Skelettmuskeln

Verfahren, um die Verteilung von Knochenmark hämatopoietischen Vorläuferzellen in Durchflusszytometrie sowie effizient zu isolieren hochgereinigten hämatopoetischen Stammzellen (HSC) Analyse beschrieben. Die Isolierung Verfahren im wesentlichen auf magnetische Anreicherung von c-Kit +-Zellen und Zell-Sortierung, um HSK für zelluläre und molekulare Studien zu reinigen bezogen.

Phänotypische Analyse und Isolierung von murinen hämatopoetischen Stammzellen und Lineage-festgelegte Vorläuferzellen

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das große Mengen an murinen Monozyten aus heterogenem Knochenmark für translationale Anwendungen erzeugt. Im Vergleich zu anderen trägt diese neue Methode dazu bei, die Anzahl der getöteten Tiere zu reduzieren und die Kosten zu senken, indem teure Methoden wie die magnetische Zelltrennung mit hohem Gradienten (MACS) vermieden werden.

Isolierung und intravenöse Injektion von Maus-Knochenmark stammenden Monozyten

Hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen (HSPC) leiten sich von spezialisierten (hemogenic) Endothelzellen während der Entwicklung, noch wenig über das Verfahren bekannt, von denen einige Endothelzellen angeben zu werden Blut bilden. Wir zeigen eine Durchflusszytometrie basierende Methode ermöglicht die gleichzeitige Isolierung von hemogenic Endothelzellen und HSPC aus murinen embryonalen Geweben.

Isolierung von murinen embryonalen Hemogenic Endothelial Cells

Hier beschreiben wir ein optimiertes, hochreproduzierbares Protokoll zur Isolierung von mesodermalen Vorläuferzellen (MPCs) aus menschlichem Knochenmark (hBM). MPCs wurden mittels Durchflusszytometrie und Nestin-Expression charakterisiert. Sie zeigten die Fähigkeit, exponentiell wachsende MSC-ähnliche Zellkulturen hervorzubringen und gleichzeitig ihr angiogenes Potenzial zu erhalten.

Isolieren von Mesangiogenic Progenitorzellen (MPL) aus menschlichem Knochenmark

Wir beschreiben die Immunomagnetic Isolierung der primäre Maustaste Oligodendrozyten, ermöglicht die schnelle und spezielle Isolierung der Zellen für in-vitro- Kultur.

Schnelle und spezifische Immunomagnetic Isolierung der Maus primären Oligodendrozyten

Wir zeigen, wie zu identifizieren und zu isolieren 6 Teilmengen der myeloischen Vorläuferzellen aus murinen Knochenmark mit einer Kombination von magnetischen und Fluoreszenz (MACS und FACS) sortieren. Dieses Protokoll kann für in-vitro- Kultur-Assays (Methylcellulose oder Flüssigkeit Kulturen), in Vivo Adoptiv Transfer Experimente und RNS/Protein-Analysen verwendet werden.

Identifizierung und Isolierung von Oligopotent und Lineage-committed myeloischen Vorläuferzellen aus Maus Knochenmark

Hier beschreiben wir die Knochenmark-Explantationsmethode, von der Probenvorbereitung bis zur mikroskopischen Objektträgeranalyse, um die Fähigkeit von Megakaryozyten, die sich in ihrer physiologischen Umgebung differenziert haben, zu bewerten, Proplatelette zu bilden.

Proplatbildungsdynamik von mausfrischen Knochenmark-Explantaten

Es ist jetzt anerkannt, dass die dreidimensionale Umgebung von Zellen eine wichtige Rolle bei ihrem Verhalten, ihrer Reifung und / oder Differenzierung spielen kann. Dieses Protokoll beschreibt ein dreidimensionales Zellkulturmodell, das entwickelt wurde, um die Auswirkungen von physikalischer Eindämmung und mechanischen Einschränkungen auf Megakaryozyten zu untersuchen.

Megakaryozytenkultur in 3D-Methylcellulose-basiertem Hydrogel zur Verbesserung der Zellreifung und Untersuchung der Auswirkungen von Steifigkeit und Einschluss

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Isolierung und Reinigung primärer Mikroglia in Tiermodellen demyelinisierender Krankheiten unter Verwendung der säulenförmigen magnetisch aktivierten Zellsortierung.

Isolierung von primären Mausmikroglia durch magnetisch aktivierte Zellsortierung in Tiermodellen der Demyelinisierung

Diese Studie hat eine stabile und effiziente Methode zur Isolierung, Kultivierung und funktionellen Bestimmung von in der Gefäßwand ansässigen CD34+ -Stammzellen (CD34+ VW-SCs) etabliert. Diese leicht verständliche und zeitsparende Isolationsmethode kann von anderen Forschern genutzt werden, um die möglichen Mechanismen zu untersuchen, die an Herz-Kreislauf-Erkrankungen beteiligt sind.

Immunmagnetische Isolierung von in der Gefäßwand ansässigen CD34+ -Stammzellen aus Mäusen

Lernen Sie die effiziente Isolierung von Megakaryozyten-Vorläufern (MEP und MKp) aus Maus-Knochenmark mittels magnetischer Depletion und Durchflusszytometrie. Diese ethisch optimierte Methode maximiert die Zellausbeute und ermöglicht funktionelle Analysen.

Isolierung von Maus-Megakaryozyten-Vorläufern

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