Name: Proplatbildungsdynamik von mausfrischen Knochenmark-Explantaten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 58 s
Description: Erfahren Sie eine schnelle Explantatmethode zur Echtzeitbeobachtung der Proplattenbildung aus nativen Maus-Megakaryozyten im Knochenmark. Dieses Protokoll ermöglicht qualitative und quantitative Analysen für hämatologische Forschung.

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Die Autoren danken Jean-Yves Rinckel, Julie Boscher, Patricia Laeuffer, Monique Freund, Ketty Knez-Hippert für die technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde von ANR (Agence National de la Recherche) Grant ANR-17-CE14-0001-01 und ANR-18-CE14-0037 unterstützt.

Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den europäischen Normen 2010/63/EU und dem CREMEAS-Ausschuss für die Ethik von Tierversuchen der Universität Straßburg (Comité Régional d'Ethique en Matière d'Expérimentation Animale Strasbourg) durchgeführt.
1. Herstellung von Reagenzien
<ol><li>Reagenzien wie in Tabelle 1beschrieben vorbereiten.<ol>
<li>Für die Brühe I jedes Pulver separat auflösen. Stellen Sie sicher, dass die Osmolarität der Zubereitung höher als 295 mOsm/L ist. Diese Lösung kann bei 4 °C für ein Jahr gelagert werden.</li>
		<li>Für die Tyrode-Puffervorbereitung die Lösung wie in Tabelle 1beschrieben herstellen, das Volumen mit destilliertem Wasser auf 100 ml einstellen und 0,1 g wasserfreie D (+)-Saccharose zugeben. Stellen Sie bei Bedarf mit 1 N HCl auf pH 7,3 und die Osmolarität auf 295 mOsm/L ein. Um das Bakterienwachstum zu verhindern, fügen Sie Penicillin G in 10 U / ml Endkonzentration und Streptomycinsulfat in 0,29 mg / ml Endkonzentration hinzu. Die endgültige Lösung wird durch Poren von 0,22 μm filtriert.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Vorbereitung des Versuchsaufbaus
<ol><li>Erwärmen Sie am Tag des Experiments den Tyrode-Puffer auf 37 ° C und schalten Sie die Heizkammer des Mikroskops ein, um die Temperatur auf 37 ° C zu bringen.</li>
	<li>Bereiten Sie alle notwendigen Werkzeuge vor, wie z. B. einen Timer, Inkubationskammern, 5-ml-Spritzen, 21 G, eine Pinzette, eine Rasierklinge, Pasteurpipetten, Glasobjektträger und ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen (Abbildung 1A).</li>
</ol>3. Isolierung des Knochenmarks der Maus
<ol><li>Euthanasie C57BL/6-Mäuse im Alter von 8-12 Wochen durch CO 2-Erstickung und zervikale Luxation. Dies sollte schnell von einer kompetenten und qualifizierten Person erledigt werden.</li>
	<li>Um eine mikrobielle Kontamination zu vermeiden, tränken Sie den Mauskörper in 70% (v / v) Ethanol, bevor Sie die Femuren entfernen. Verwenden Sie instrumente, die in 70% Ethanol desinfiziert sind, für die Dissektion. Sammeln Sie die beiden Femuren und reinigen Sie sie, indem Sie anhaftendes Gewebe entfernen. Nach schnellem Eintauchen in Ethanol werden sie in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen mit 2 ml Tyrode-Puffer gegeben.</li>
	<li>Schneiden Sie die Epiphysen mit einer scharfen Rasierklinge weg und spülen Sie das Knochenmark mit einer 5 ml Spritze, die mit 2 ml Tyrode-Puffer gefüllt ist. Um dies zu erreichen, führen Sie eine 21 G Nadel in die Öffnung des Femurs (auf der Knieseite) ein und drücken Sie langsam auf den Kolben, um einen intakten Markzylinder zu entnehmen (Abbildung 1B,C). Halten Sie die Knochenmarkentnahme so kurz wie möglich (unter 10 Min.).</li>
</ol>4. Schneiden des Knochenmarks und Einsetzen in die Inkubationskammer
<ol><li>Verwenden Sie eine 3 ml Kunststoffpipette, um das intakte Knochenmark vorsichtig und vorsichtig auf einen Glasobjektträger zu übertragen. Es ist wichtig, dass die Proben mit Puffer bedeckt sind, um ein Austrocknen zu verhindern (Abbildung 1D). HINWEIS: Vermeiden Sie Flow-Reflow, um Scheren zu minimieren, die das Gewebe dissoziieren könnten.</li>
	<li>Schneiden Sie unter einem Stereomikroskop (10x) die Enden des Knochenmarks ab, die zum Zeitpunkt der Spülung möglicherweise komprimiert wurden. Dann schneiden Sie Querabschnitte mit einer scharfen Rasierklinge. Abschnitte sollten dünn genug sein, um eine detaillierte Beobachtung zu ermöglichen, aber sicherstellen, dass Megakaryozyten nicht durch Kompression beschädigt werden (normalerweise Dicke um 0,5 mm)(Abbildung 1E,F). HINWEIS: Die Abschnitte werden mit einer scharfen Rasierklinge und unter einer Lupe hergestellt, um ihre Dicke auf etwa 0,5 mm einzustellen. Es werden nur die Abschnitte mit gleichmäßiger Dicke ausgewählt. Dieses Verfahren ist nicht kompliziert, aber seine Standardisierung erfordert einige Erfahrung.</li>
	<li>Sammeln Sie mit einer Kunststoffpipette 10 Abschnitte in einem 1-ml-Röhrchen, das Tyrodes Puffer enthält (Abbildung 1G).</li>
	<li>Vorsichtig werden die Abschnitte in eine Inkubationskammer mit einem Durchmesser von 13 mm überführt (Abbildung 1H).</li>
	<li>Aspirieren Sie den Puffer und stellen Sie das Volumen auf 30 μL des Tyrode-Puffers ein, der mit 5 % Mausserum ergänzt wird. HINWEIS: In diesem Stadium können pharmakologische Wirkstoffe hinzugefügt werden, um ihren Einfluss auf die Proplatletbildung zu bewerten.</li>
	<li>Positionieren Sie die Abschnitte im Abstand. Versiegeln Sie die Selbstklebekammer mit einem Deckglas im Format 22 x 55 mm. Neigen Sie den Deckstab beim Kleben an, um die Bildung von Luftblasen zu vermeiden (Abbildung 1I).</li>
	<li>Stellen Sie die Kammer bei 37 °C in die Heizkammer. Ab diesem Moment wird der Chronometer gestartet (T= 0 h). Das Experiment läuft 6 h bei 37 °C (T= 6 h).</li>
</ol>5. Echtzeitbeobachtung von Knochenmark-Explantaten
<ol><li>Verwenden Sie ein invertiertes Phasenkontrastmikroskop (40-fache Linse zur Vergrößerung), das mit einer Videokamera gekoppelt ist, um die Knochenmark-Explantate zu beobachten. Lassen Sie die Zellen 30 Minuten lang inkubieren, bevor Sie mit der Beobachtung beginnen. Während der Beobachtung ist es notwendig, den Fokus anzupassen, da sich Megakaryozyten bewegen. HINWEIS: Andere Beobachtungsmodi sind möglich (z. B. DIC, Fluoreszenz mit Mäusen, deren Megakaryozyten einen endogenen fluoreszierenden Marker exprimieren), aber die Phasenkontrastmikroskopie ist optimal, um die langen und dünnen Megakaryozytenerweiterungen klar sichtbar zu machen, was eine präzise Quantifizierung ermöglicht. Nach 30 min wandern die Markzellen allmählich an die Peripherie der Explant und bilden eine Monoschicht. Nach 1 h Inkubation können Megakaryozyten durch ihre große Größe und polylobulierte Kerne identifiziert werden (Abbildung 1J, K). Nach 3 h Inkubation nimmt die Anzahl der Megakaryozyten zu und einige haben lange Verlängerungen.</li>
	<li>Machen Sie Videos, um die Transformation der Megakaryozyten aufzuzeichnen.</li>
</ol>6. Quantifizierung der Proplatlet-verlängernden Megakaryozyten
<ol><li>Zeichnen Sie eine Karte, um jeden Abschnitt in der Inkubationskammer zu lokalisieren (Abbildung 1K).</li>
	<li>Identifizieren Sie nach 1 h die sichtbaren Megakaryozyten (dh riesige polylobulierte Zellen) an der Peripherie jedes Abschnitts und zeichnen Sie ihre Positionen auf der Zeichnung auf. Wiederholen Sie diesen Vorgang nach 3 und 6 Stunden. HINWEIS: Auf der Grundlage der Zeichnung kann jeder Megakaryozyt im Laufe der Zeit leicht lokalisiert und die Entwicklung seiner Morphologie analysiert werden (z. B. Größe, Verformung, Proplatenerweiterung usw.). Eine weitere Möglichkeit ist die Verwendung einer speziellen Navigationssoftware.</li>
</ol>

<ol><li>Thiery, J. P., Bessis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+platelet+genesis%3B+in+vitro+study+by+cinemicrophotography%5BTitle%5D)+AND+%22Reviews+in+Hematology%22%5BJournal%5D)">Mechanism of platelet genesis; in vitro study by cinemicrophotography.</a> Reviews in Hematology. 11 (2), 162-174 (1956).</li>
<li>Becker, R. P., De Bruyn, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transmural+passage+of+blood+cells+into+myeloid+sinusoids+and+the+entry+of+platelets+into+the+sinusoidal+circulation%3A+A+scanning+electron+microscopic+investigation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">The transmural passage of blood cells into myeloid sinusoids and the entry of platelets into the sinusoidal circulation: A scanning electron microscopic investigation.</a> American Journal of Anatomy. 145 (2), 183-205 (1976).</li>
<li>Muto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+scanning+and+transmission+electron+microscopic+study+on+rat+bone+marrow+sinuses+and+transmural+migration+of+blood+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Archivum+Histologicum+Japonicum%22%5BJournal%5D)">A scanning and transmission electron microscopic study on rat bone marrow sinuses and transmural migration of blood cells.</a> Archivum Histologicum Japonicum. 39 (1), 51-66 (1976).</li>
<li>Cramer, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructure+of+platelet+formation+by+human+megakaryocytes+cultured+with+the+Mpl+ligand%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Ultrastructure of platelet formation by human megakaryocytes cultured with the Mpl ligand.</a> Blood. 89 (7), 2336-2346 (1997).</li>
<li>Kaushansky, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promotion+of+megakaryocyte+progenitor+expansion+and+differentiation+by+the+c-Mpl+ligand+thrombopoietin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Promotion of megakaryocyte progenitor expansion and differentiation by the c-Mpl ligand thrombopoietin.</a> Nature. 369 (6481), 568-571 (1994).</li>
<li>Strassel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hirudin+and+heparin+enable+efficient+megakaryocyte+differentiation+of+mouse+bone+marrow+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Hirudin and heparin enable efficient megakaryocyte differentiation of mouse bone marrow progenitors.</a> Experimental Cell Research. 318 (1), 25-32 (2012).</li>
<li>Aguilar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importance+of+environmental+stiffness+for+megakaryocyte+differentiation+and+proplatelet+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Importance of environmental stiffness for megakaryocyte differentiation and proplatelet formation.</a> Blood. 128 (16), 2022-2032 (2016).</li>
<li>Scandola, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+electron+microscopy+to+study+megakaryocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Platelets%22%5BJournal%5D)">Use of electron microscopy to study megakaryocytes.</a> Platelets. 31 (5), 589-598 (2020).</li>
<li>Eckly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+megakaryocyte+development+in+the+native+bone+marrow+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Characterization of megakaryocyte development in the native bone marrow environment.</a> Methods in Molecular Biology. 788, 175-192 (2012).</li>
<li>Eckly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+megakaryocyte+morphology+and+proplatelet+formation+in+mice+with+megakaryocyte-restricted+MYH9+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Abnormal megakaryocyte morphology and proplatelet formation in mice with megakaryocyte-restricted MYH9 inactivation.</a> Blood. 113 (14), 3182-3189 (2009).</li>
<li>Eckly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proplatelet+formation+deficit+and+megakaryocyte+death+contribute+to+thrombocytopenia+in+Myh9+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Proplatelet formation deficit and megakaryocyte death contribute to thrombocytopenia in Myh9 knockout mice.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 8 (10), 2243-2251 (2010).</li>
<li>Ortiz-Rivero, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C3G%2C+through+its+GEF+activity%2C+induces+megakaryocytic+differentiation+and+proplatelet+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Communication+and+Signaling%22%5BJournal%5D)">C3G, through its GEF activity, induces megakaryocytic differentiation and proplatelet formation.</a> Cell Communication and Signaling. 16 (1), 101(2018).</li>
<li>Junt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+visualization+of+thrombopoiesis+within+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Dynamic visualization of thrombopoiesis within bone marrow.</a> Science. 317 (5845), 1767-1770 (2007).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+MYH9-related+disease%3A+mutations+in+nonmuscle+myosin+II-A%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Mouse models of MYH9-related disease: mutations in nonmuscle myosin II-A.</a> Blood. 119 (1), 238-250 (2012).</li>
<li>Malara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+structure+and+nano-mechanics+determine+megakaryocyte+function%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix structure and nano-mechanics determine megakaryocyte function.</a> Blood. 118 (16), 4449-4453 (2011).</li>
<li>Balduini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesive+receptors%2C+extracellular+proteins+and+myosin+IIA+orchestrate+proplatelet+formation+by+human+megakaryocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Adhesive receptors, extracellular proteins and myosin IIA orchestrate proplatelet formation by human megakaryocytes.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 6 (11), 1900-1907 (2008).</li>
</ol>

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Hier beschreiben wir eine einfache und kostengünstige In-vitro-Methode zur Bewertung der Effizienz von Megakaryozyten zur Erweiterung von Proplaten, die im Knochenmark gewachsen sind. Das Knochenmark-Explantat-Modell für Die Maus hat vier Hauptvorteile. Erstens sind keine fortgeschrittenen technischen Fähigkeiten erforderlich. Zweitens ist die Zeit, die benötigt wird, um Megakaryozyten-verlängernde Proplatelets zu erhalten, ziemlich kurz, nur 6 Stunden für die Explantat-Methode, verglichen mit einem Minimum von ...

Die Knochenmark-Explantationstechnik wurde erstmals 1956 von Thiéry und Bessis entwickelt, um die Bildung von zytoplasmatischen Erweiterungen von Megakaryozyten bei Ratten als erstes Ereignis bei der Thrombozytenbildung zu beschreiben1. Mit Hilfe von Phasenkontrast und kinematografischen Techniken charakterisierten diese Autoren die Umwandlung reifer runder Megakaryozyten in "tintenfischartige" thrombozytogene Zellen mit zytoplasmatischen Erweiterungen, die dynamische Bewegungen der Dehnung und Kontraktion zeigen. Diese Arme werden zunehmend dünner, bis sie mit kleinen Schwellungen entlang der Arme und an den Spitzen filiform werden. Diese typischen Megakaryozytendehnungen, die in vitro und in flüssigen Medien erhalten werden, weisen bestimmte Ähnlichkeiten mit Blutplättchen auf, die im festsitzenden Knochenmark beobachtet wurden, wo Megakaryozyten lange Ausdehnungen durch die Sinuswände in den Blutkreislauf ragen2,3. Die Entdeckung und Klonierung von TPO im Jahr 1994 ermöglichte es, Megakaryozyten in Kultur zu differenzieren, die in der Lage sind, Proplatleterweiterungen zu bilden, die denen ähneln, die in den Knochenmark-Explantaten4,5,6beschrieben sind. Die Megakaryozytenreifung ist jedoch unter Kulturbedingungen weit weniger effizient, insbesondere das ausgedehnte interne Membrannetzwerk von knochenmarkgereiften Megakaryozyten ist in kultivierten Megakaryozyten unterentwickelt, was Studien über die Mechanismen der Thrombozytenbiogenese behindert7,8.
Wir beschreiben hier das Knochenmark-Explantatmodell, das auf Thiéry und Bessis basiert, um in Echtzeit die Proplatletbildung von Maus-Megakaryozyten zu verfolgen, die in ihrer nativen Umgebung vollständig gereift sind und so mögliche In-vitro-Artefakte und Fehlinterpretationen umgehen. Ergebnisse, die an erwachsenen Wildtyp-Mäusen gewonnen wurden, werden vorgestellt, um die Fähigkeit von Megakaryozyten zur Erweiterung von Proplaten, ihre Morphologie und die Komplexität von Proplaten zu veranschaulichen. Wir führen auch eine schnelle Quantifizierungsstrategie für die Qualitätsvalidierung ein, um die Genauigkeit und Robustheit der Daten während des Megakaryozyten-Aufzeichnungsprozesses sicherzustellen. Das hier vorgestellte Protokoll ist die neueste Version der Methode, die als Buch kapitel zuvor9veröffentlicht wurde.

<table><tbody><tr><td>5 mL Spritzen</td><td>Terumo</td><td>SS+05S1</td><td></td></tr><tr><td>21-Gauge Nadeln</td><td>BD Microlance</td><td>301155</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2.6H2O</td><td>Sigma</td><td>21108</td><td></td></tr><tr><td>Deckwand-Inkubationskammern</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>70324-02</td><td>Tiefe : 0,2 mm</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H-3375</td><td>pH eingestellt bis 7,5</td></tr><tr><td>Humanserumalbumin</td><td>VIALEBEX</td><td>zugelassene Medikamente: n&deg; 3400956446995</td><td>20% (200mg/mL -100mL)</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2.6H2O</td><td>Sigma</td><td>BVBW8448</td><td></td></tr><tr><td>Micro Cover Glas</td><td>Elektronenmikroskopie</td><td>Sciences 72200-40</td><td>22 mm x 55 mm</td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Leica Microsystems SA, Westlar, Deutschland</td><td>DMI8 - 514341</td><td>Luftobjektiv-Mikroskopkamera</td></tr><tr><td></td><td>Leica Microsystems SA, Westlar, Deutschland</td><td>K5 CMS GmbH -14401137</td><td>Bildauflösung: 4,2 Megapixel</td></tr><tr><td>Mausserum</td><td>BioWest</td><td>S2160-010</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4. H2O</td><td>Sigma</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>PSG 100x</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>1037-016</td><td>10.000 Einheiten/ml Penicillin, 10.000 &mu; g/mL Streptomycin und 29,2 mg/mL Glutamin</td></tr><tr><td>Rasierklinge</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>72000</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose D (+)</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr></tbody></table>

proplatbildungsdynamik von mausfrischen knochenmark-explantaten

Proplatelet Formation Dynamics of Mouse Fresh Bone Marrow Explants

Das letzte Stadium der Megakaryopoese führt zu zytoplasmatischen Erweiterungen aus reifen Megakaryozyten, den sogenannten Proplaten. Es wurde viel über die Proplatbildung unter Verwendung von in vitro-differenziertenMegakaryozyten gelernt; Es gibt jedoch immer mehr Hinweise darauf, dass herkömmliche Kultursysteme den Differenzierungs- / Reifungsprozess, der im Knochenmark stattfindet, nicht getreu rekapitulieren. In diesem Manuskript stellen wir eine explantierte Methode vor, die ursprünglich 1956 von Thiéry und Bessis beschrieben wurde, um Megakaryozyten zu visualisieren, die in ihrer natürlichen Umgebung gereift sind, wodurch potenzielle Artefakte und Fehlinterpretationen umgangen werden. Frische Knochenmarke werden durch Spülen der Oberschenkelknochen von Mäusen gesammelt, in 0,5 mm Querschnitte geschnitten und in eine Inkubationskammer bei 37 °C gegeben, die einen physiologischen Puffer enthält. Megakaryozyten werden allmählich an der explantaten Peripherie sichtbar und werden bis zu 6 Stunden unter einem inversen Mikroskop in Verbindung mit einer Videokamera beobachtet. Im Laufe der Zeit ändern Megakaryozyten ihre Form, wobei einige Zellen eine kugelförmige Form haben und andere dicke Erweiterungen entwickeln oder viele dünne Proplateletten mit ausgedehnter Verzweigung verlängern. Es werden sowohl qualitative als auch quantitative Untersuchungen durchgeführt. Diese Methode hat den Vorteil, dass sie einfach, reproduzierbar und schnell ist, da zahlreiche Megakaryozyten vorhanden sind, und klassischerweise bildet die Hälfte von ihnen Proplatelette in 6 Stunden im Vergleich zu 4 Tagen für kultivierte Maus-Megakaryozyten. Neben der Untersuchung von mutierten Mäusen ist eine interessante Anwendung dieser Methode die einfache Bewertung der pharmakologischen Wirkstoffe auf dem Proplatlet-Erweiterungsprozess, ohne den Differenzierungsprozess, der in Kulturen auftreten kann, zu stören.

Qualitative Ergebnisse. Zu Beginn des Experiments werden alle Zellen im Knochenmarkabschnitt verdichtet. Es dauert 30 Minuten, bis die Zellen an der Peripherie der Explantate deutlich sichtbar werden. Die Megakaryozyten sind dann an ihrer Größe erkennbar und ihre Entwicklung kann dann im Laufe der Zeit untersucht werden (Größe, Form, Dynamik, Proplatletverlängerung und Thrombozytenfreisetzung) (Abbildung 2A). Kleine Megakaryozyten haben einen Durchmesser zwischen 20 und 30 μ...

Hier beschreiben wir die Knochenmark-Explantationsmethode, von der Probenvorbereitung bis zur mikroskopischen Objektträgeranalyse, um die Fähigkeit von Megakaryozyten, die sich in ihrer physiologischen Umgebung differenziert haben, zu bewerten, Proplatelette zu bilden.

Proplatbildungsdynamik von mausfrischen Knochenmark-Explantaten

The last stage of megakaryopoiesis leads to cytoplasmic extensions from mature megakaryocytes, the so-called proplatelets. Much has been learned about the ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, in Echtzeit die Bildung von Proplatelett aus Megakaryozyten der Maus zu verfolgen, die in ihrer natürlichen Umgebung gereift sind. Diese Methode hat den Vorteil, dass sie einfach, reproduzierbar und schnell ist. Man kann viele Megakaryozyten analysieren und die Bildung von Proplaten in nur sechs Stunden visualisieren, anstatt auf den ersten Tag der Kultur zu warten, wie bei Maus-Megakaryozyten in vitro.Eine interessante Anwendung dieser Methode ist die Möglichkeit, die Wirkung der pharmazeutischen Behandlung oder genetischen Mutation zu untersuchen, insbesondere im Schritt der Proplatatadierung. Hier gibt es keinen Eingriff in den Differenzierungsprozess, wie im Fall der In-vitro-Kultur. Dieses Video hilft, diese wichtigen Schritte des Spülens und Schneidens des Knochenmarks sicherzustellen.Es wird auch erklärt, wie man die Morphologie und Megakaryozyten klassifiziert, was für die Charakterisierung von Defekten bei thrombophilen Erkrankungen wirklich nützlich ist. Erwärmen Sie zunächst Tyrodes Puffer auf 37 Grad Celsius und schalten Sie die Heizkammer des Mikroskops ein, um die Temperatur auf 37 Grad Celsius zu bringen. Bereiten Sie alle notwendigen Werkzeuge wie einen Timer, Inkubationskammern, fünf Milliliter 21 Gauge Spritzen, Pinzette, eine Rasierklinge, Pasteur pipetten, Glasobjektträger und 15 Milliliter Zentrifugenröhrchen vor.Spülen Sie das Knochenmark mit zwei Millilitern Tyrodes Puffer, indem Sie eine 21-Gauge-Nadel in die Öffnung des Femurs auf der Knieseite einführen, und drücken Sie langsam auf den Kolben, um einen intakten Markzylinder zu entnehmen. Verwenden Sie eine Drei-Minuten-Liter-Kunststoffpipette, um das intakte Knochenmark vorsichtig und vorsichtig auf einen Glasträger zu übertragen. Schneiden Sie die Enden des Knochenmarks ab, die zum Zeitpunkt der Spülung möglicherweise komprimiert wurden.Schneiden Sie dann dünne Querschnitte von 0,5 Millimeter Dicke mit einer scharfen Rasierklinge, um eine Beschädigung der Megakaryozyten zu vermeiden. Sammeln Sie mit einer Kunststoffpipette 10 Abschnitte in einem Ein-Milliliter-Röhrchen, das Tyrodes Puffer enthält. Die Abschnitte werden vorsichtig in eine Inkubationskammer mit einem Durchmesser von 13 Millimetern überführt.Saugen Sie den Puffer ab und stellen Sie das Volumen auf 30 Mikroliter tyrodes Puffer ein, der mit 5% Mausserum ergänzt wird. Positionieren Sie die Abschnitte in einiger Entfernung. Versiegeln Sie die selbstklebende Kammer mit einem 22 x 55 Millimeter großen Abdeckschlupf und neigen Sie den Abdeckschlitten an, um die Bildung von Luftblasen zu vermeiden.Stellen Sie die Kammer bei 37 Grad Celsius in die Heizkammer. Starten Sie den Chronometer und führen Sie das Experiment sechs Stunden lang bei 37 Grad Celsius durch, Machen Sie Videos, um die Transformation der Megakaryozyten aufzuzeichnen. Nach 30 Minuten wandern die Markzellen allmählich an die Peripherie der Explantation und bilden eine Monoschicht.Nach einer Stunde Inkubation können Megakaryozyten anhand ihrer größe und polylobulierten Kerne identifiziert werden. Die Anzahl der Megakaryozyten nimmt nach drei Stunden Inkubation zu, und einige haben lange Verlängerungen. Zeichnen Sie eine Karte, um jeden Abschnitt in der Inkubationskammer zu lokalisieren.Identifizieren Sie nach einer Stunde die sichtbaren Megakaryozyten, bei denen es sich um riesige polylobulierte Zellen an der Peripherie jedes Abschnitts handelt, und zeichnen Sie ihre Positionen auf der Zeichnung auf. Wiederholen Sie diesen Vorgang nach drei und sechs Stunden. Megakaryozyten werden manuell gezählt und drei und sechs Stunden nach dem Versiegeln der Inkubationskammer nach ihrer Morphologie klassifiziert.Sie werden als klein, groß mit dicker Absicht und Proplatlet-Erweiterung klassifiziert. Mit Hilfe der Kartierung kann ihre Entwicklung im Laufe der Zeit verfolgt werden. Die Ergebnisse werden als Prozentsatz jeder Klasse zu jedem Beobachtungszeitpunkt ausgedrückt.Klassischerweise erstreckt sich die Hälfte der an der Peripherie sichtbaren Megakaryozyten nach sechs Stunden für das Knochenmark der Wildtyp-Maus. Dem Schicksal der runden Megakaryozyten folgte die Aufnahme sequenzieller Bilder im Laufe der Zeit, um abzubilden, wie sie Proplatelette bilden. Eine wichtige Sache, an die Sie sich erinnern sollten, wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist, die Explantate für die Dauer des Experiments bei 37 Grad Celsius zu halten.Eine andere Temperatur kann die Ergebnisse verändern. Interessanterweise kann das Explantatprotokoll nach introvertierten Mikroskopieexperimenten verwendet werden. Am Ende werden die Megakaryozyten in den Explantraten des Knochenmarks von Natur aus fluoreszierend sein, und ihr Verhalten kann leicht untersucht werden.Dies ermöglicht es, verschiedene Behandlungen an denselben Tieren zu kombinieren und so die Anzahl der Mäuse zu reduzieren. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Explantatmethode schnell und einfach ist und viele Informationen über die Kapazität natürlicher Megakaryozyten zu externen Proplaten liefert. Die daraus resultierenden qualitativen und quantitativen Befunde sind der Schlüssel zu unserem Verständnis thrombophiler Erkrankungen.in einem physiologischen oder pathologischen Kontext.

proplatelet-formation-dynamics-of-mouse-fresh-bone-marrow-explants

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieses Video zeigt eine Technik zur Differenzierung von Megakaryozyten und zur Bildung von Blutplättchen. Hämatopoetische Stammvorläuferzellen – isoliert aus menschlichem Nabelschnurblut – differenzieren sich in Gegenwart von Thrombopoietin zu reifen Megakaryozyten. Die reifen Megakaryozyten produzieren zytoplasmatische Fortsätze, die als Proplättchen bezeichnet werden und aus denen einzelne Blutplättchen hervorgehen.

Eine in vitro Methode zur Differenzierung von Megakaryozyten und zur Thrombozytenbildung

In diesem Video demonstrieren wir die Aktivierung von aus Knochenmark gewonnenen Makrophagen als Reaktion auf bakterielle Lipopolysaccharide und intravenöses Immunglobulin.

Aktivierung von Makrophagen aus dem Knochenmark der Maus als Reaktion auf Antikörper

Hier berichten wir über eine experimentelle Technik der Fluoreszenz-Intravitalmikroskopie um heterotypische Thrombozyten-Neutrophilen-Interaktionen auf dem aktivierten Endothel während der vaskulären Entzündungen und Thrombusbildung in lebenden Mäusen sichtbar zu machen. Diese mikroskopische Technik wird wertvoll sein, um die molekularen Mechanismen der vaskulären Erkrankungen zu studieren und pharmakologische Mittel unter pathophysiologischen Bedingungen zu testen.

Real-time Imaging der heterotypische Platelet-Neutrophilen-Interaktionen auf aktiviertem Endothel Während Vascular Entzündung und Thrombusbildung in lebenden Mäusen

Eine hochreine Bevölkerung von Megakaryozyten erhalten Sie bei Kabel Blut stammenden CD34+ Zellen. Eine Methode für die CD34+ Isolation und Megakaryocyte Zelldifferenzierung wird hier beschrieben.

Megakaryocyte Differenzierung und Thrombozyten-Formation von Human Cord Blood abgeleitet CD34 Zellen+

Dieses Manuskript beschreibt ein Protokoll zum isolieren und Kultur Osteoklasten in Vitro aus Maus Knochenmark und zur Untersuchung der Rolle von Säugetieren/mechanistischen Ziel von Rapamycin Komplex 1 in Osteoklasten-Formation.

Ein RANKL-basierte Osteoklasten Kultur Assay der Maus Knochenmark zu untersuchen, die Rolle von mTORC1 in Osteoklasten Bildung

Leukozyten Interaktion eifrig mit vaskulären Zellen und Blutplättchen nach Schiff Wand Unfall oder während einer Entzündung. Hier beschreiben wir einen unkomplizierten Laminar-Flow-based Assay zur Charakterisierung der molekularen Mechanismen, die die Wechselwirkungen zwischen Leukozyten und ihre zellulären Partner zugrunde liegen.

Laminar-Flow-based Assays, Rekrutierung von Leukozyten auf kultivierten vaskuläre Zellen und adhärenten Thrombozyten zu untersuchen

Diese Methode beschreibt die durch Durchflusszytometrie gereinigte Reinigung von MEP und MKp von Mäuse femuren, Tibias und Beckenknochen.

Isolierung von Maus-Megakaryozyten-Vorläufern

Wir beschreiben hier die Methode zur Abbildung von Megakaryozyten und Blutplättchen im Knochenmark des Schädelknochens lebender Mäuse mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie.

In Vivo Zwei-Photonen-Bildgebung von Megakaryozyten und Blutplättchen im Knochenmark des Mausschädels

In dieser Arbeit beschreiben wir ein einfaches Protokoll für die Isolierung und Färbung von murinen Knochenmarkzellen zum Phänotyp hämopoetischer Stamm- und Vorläuferzellen zusammen mit den unterstützenden endothelialen und mesenchymalen Stammzellen der Nische. Eine Methode zur Anreicherung von Zellen, die sich im endostealen und zentralen Knochenmarkbereich befinden, ist ebenfalls enthalten.

Durchflusszytometrische Analyse von hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen des murinen Knochenmarks und stromalen Nischenzellen

Hier beschreiben wir ein einfach zu implementierendes, standardisiertes, mikrophysiologisches System, das die Komplexität der in vivo-Struktur des menschlichen Knochenmarks widerspiegelt und ein relevantes Modell zur feinen Untersuchung eines breiten Spektrums normaler und pathologischer Ereignisse bietet.

Ein menschliches Knochenmark-3D-Modell zur Untersuchung der Dynamik und Interaktionen zwischen residenten Zellen in physiologischen oder tumoralen Kontexten

Das vorliegende Protokoll beschreibt ein kostengünstiges Verfahren zur Reinigung, Erweiterung und Charakterisierung von hochhomogenen mesenchymalen Stammzellen (BMSCs) des Knochenmarks von Mäusen. Dieser Ansatz ermöglicht die Gewinnung großer Mengen von BMSCs mit hohem Proliferations- und Differenzierungspotenzial, unterstützt Mausmodelle und fördert die präklinische Forschung.

Aufreinigung, Expansion und durchflusszytometrische Phänotypisierung von mesenchymalen Stammzellen aus dem Knochenmark der Maus

Erfahren Sie eine schnelle Explantatmethode zur Echtzeitbeobachtung der Proplattenbildung aus nativen Maus-Megakaryozyten im Knochenmark. Dieses Protokoll ermöglicht qualitative und quantitative Analysen für hämatologische Forschung.

Proplatbildungsdynamik von mausfrischen Knochenmark-Explantaten

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