Name: In Vivo Zwei-Photonen-Bildgebung von Megakaryozyten und Blutplättchen im Knochenmark des Mausschädels (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-28T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: Erfahren Sie die Zwei-Photonen-Mikroskopie zur Echtzeitbildgebung von Megakaryozyten und Proplättchenbildung im Knochenmark der Maus. Diese Methode ermöglicht die Quantifizierung morphologischer und dynamischer Parameter in vivo.

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Die Autoren danken Florian Gaertner (Institute of Science and Technology Austria, Klosterneuburg, Österreich) für seine fachkundige Beratung zu Zwei-Photonen-Mikroskopie-Experimenten zu der Zeit, als wir die Technik im Labor etablierten, und Yves Lutz vom Imaging Center IGBMC /CBI (Illkirch, Frankreich) für seine Expertise und Hilfe beim Zwei-Photonen-Mikroskop. Wir danken auch Jean-Yves Rinkel für seine technische Hilfe und Ines Guinard für die Zeichnung des Schemas in Abbildung 1. Wir danken ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique) für die Unterstützung bei der Anschaffung des Zwei-Photonen-Mikroskops. AB wurde durch Postdoktorandenstipendien des Etablissement Français du Sang (APR2016) und der Agence Nationale de la Recherche (ANR-18-CE14-0037-01) unterstützt.

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<li>Kohler, A., Geiger, H., Gunzer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+hematopoietic+stem+cells+in+the+marrow+of+long+bones+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Imaging hematopoietic stem cells in the marrow of long bones in vivo.</a> Methods in Molecular Biology. 750, 215-224 (2011).</li>
<li>Lewandowski, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+cellular+imaging+pinpoints+the+role+of+reactive+oxygen+species+in+the+early+steps+of+adult+hematopoietic+reconstitution%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">In vivo cellular imaging pinpoints the role of reactive oxygen species in the early steps of adult hematopoietic reconstitution.</a> Blood. 115 (3), 443-452 (2010).</li>
<li>Reismann, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+intravital+imaging+of+the+femoral+bone+marrow+reveals+plasticity+within+marrow+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Longitudinal intravital imaging of the femoral bone marrow reveals plasticity within marrow vasculature.</a> Nature Communications. 8 (1), 2153(2017).</li>
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Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.

Die Mechanismen der Thrombozytenbildung hängen stark von der Knochenmarkumgebung ab. Daher ist die intravitalen Mikroskopie zu einem wichtigen Werkzeug im Feld geworden, um den Prozess in Echtzeit zu visualisieren. Mäuse mit fluoreszierenden Megakaryozyten können durch Kreuzung von Mäusen, die die Cre-Rekombinase in Megakaryozyten exprimieren, mit allen gefloxten Reportermäusen erhalten werden, die eine bedingte fluoreszierende Genexpressionskassette enthalten. Hier wurden mTmG-Reportermäuse (B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sor...

Blutplättchen werden von Megakaryozyten-spezialisierten Zellen im Knochenmark produziert. Wie genau Megakaryozyten Blutplättchen im Kreislauf freisetzen, blieb aufgrund der technischen Herausforderung bei der Beobachtung von Echtzeitereignissen durch den Knochen lange unklar. Die Zwei-Photonen-Mikroskopie hat dazu beigetragen, diese Herausforderung zu meistern und zu großen Fortschritten beim Verständnis des Thrombozytenbildungsprozesses geführt. Die ersten in vivo Megakaryozytenbeobachtungen wurden von Andrian und Kollegen im Jahr 2007 gemacht, mit der Visualisierung von fluoreszierenden Megakaryozyten durch den Schädel1. Dies war möglich, weil die Knochenschicht im frontoparietalen Schädel junger erwachsener Mäuse eine Dicke von einigen zehn Mikrometern aufweist und ausreichend transparent ist, um die Visualisierung fluoreszierender Zellen im darunter liegenden Knochenmark zu ermöglichen2.
Nachfolgende Studien wandten dieses Verfahren an, um die Pro thrombozytenbildung unter verschiedenen Bedingungen zu bewerten und die zugrunde liegenden Mechanismen3,4,5,6zu entschlüsseln . Diese Studien lieferten definitive Beweise dafür, dass Megakaryozyten Protrusionen, sogenannte Pro thrombozyten, dynamisch durch die Endothelbarriere der Sinusgefäße verlängern (Abbildung 1). Diese Proplättchen werden dann als lange Fragmente freigesetzt, die mehrere hundert Blutplättchen im Volumen darstellen. Die Blutplättchen werden nach dem Umbau der Blutplättchen in der Mikrozirkulation der nachgeschalteten Organe, insbesondere in der Lunge, gebildet7. Bis heute sind der genaue Prozess und die molekularen Mechanismen jedoch weiterhin Gegenstand von Diskussionen. Zum Beispiel unterscheidet sich die vorgeschlagene Rolle der Zytoskelettproteine bei der Verlängerung von Blutplättchen zwischen in vitro und in vivo 3, und Unterschiede in der Pro thrombozytenbildung wurden unter entzündlichen Bedingungen nachgewiesen6. Erschwerend kommt hinzu, dass eine kürzlich durchgeführte Studie das prothrombozytengetriebene Konzept in Betracht stellte und vorschlug, dass in vivoBlutplättchen im Wesentlichen durch einen membranbewegenden Mechanismus auf Megakaryozytenebene gebildet werden8.
Dieser Artikel stellt ein Protokoll für die Beobachtung von Megakaryozyten und Blutplättchen im Knochenmark aus dem Schädelknochen bei lebenden Mäusen mit einem minimalinvasiven Verfahren vor. Ähnliche Ansätze wurden bereits beschrieben, um andere Markzellen zu visualisieren, insbesondere hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen9. Der Fokus liegt hier auf der Beobachtung von Megakaryozyten und Blutplättchen, um einige Parameter zu beschreiben, die gemessen werden können, insbesondere Prothrombozytenmorphologien und Thrombozytengeschwindigkeit. Dieses Protokoll zeigt, wie man einen Katheter in die Jugularvene einführt, um fluoreszierende Tracer und Medikamente zu injizieren und durch den Schädelknochen zu beobachten. Der Calvarialknochen wird durch eine kleinere Operation freigelegt, so dass ein Ring auf den Knochen geklebt wird. Dieser Ring dient dazu, den Kopf zu immobilisieren und Bewegungen durch Atmung zu verhindern und eine mit Kochsalzlösung gefüllte Tasse als Tauchmedium der Linse zu bilden. Diese Technik eignet sich gut, um i) in Echtzeit die Sinusgeometrie und Megakaryozyten zu beobachten, die mit der Gefäßwand interagieren; ii) Megakaryozyten im Prozess der Prothrombozytenbildung, -dehnung und -freisetzung zu verfolgen; und iii) Thrombozytenbewegungen messen, um den komplexen sinusförmigen Blutfluss zu überwachen. Daten, die mit diesem Protokoll gewonnen wurden, wurden kürzlich veröffentlicht3.

<table><tbody><tr><td>GNU Octave Software</td><td>GNU Project</td><td></td><td>https://www.gnu.org/software/octave/</td></tr><tr><td>&nbsp; Histoacryl 5 x 0,5 mL</td><td>Braun</td><td>1050052</td><td>injizierbare Lösung von chirurgischem Kleber</td></tr><tr><td>HyD Hybrid-Detektoren Leica Microsystems 4tunes</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>GNU-Projekt Erforderliche</td><td></td><td>Mindestversion</td></tr><tr><td>Imalgen/Ketamin 1000 fl/10 mL</td><td>Boehring</td><td>03661103003199</td><td>Augenschutz</td></tr><tr><td>Leica SP8 MP DIVE Mikroskop ausgestattet mit einem 25-fach Wasserobjektiv, numerischer Apertur von 0,95</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>gleichzeitige Anregung von AlexaFluor-488 und Qtracker-655</td></tr><tr><td>Matlab</td><td>MathWorks</td><td></td><td>https://www.mathworks.com/</td></tr> <tr><td>Ocrygel 10 g</td><td>Laboratoires T.V.M.</td><td>03700454505621</td><td>Silikon-Zahnpasta blau und gelb</td></tr><tr><td>Picodent Twinsin Speed</td><td>Rotec</td><td>13001002</td><td></td></tr><tr><td>Qtracker 655 Gefäßmarkierung Invitrogen</td><td></td><td>Q21021MP</td><td>injizierbare Lösung</td></tr><tr><td>Resonanzscanner, 8 oder 12 kHz</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rompun Xylazin 2% fl/25 mL</td><td>Bayer</td><td>04007221032311</td><td></td></tr><tr><td>Sekundenkleber Gel</td><td></td><td></td><td>zum Verkleben des Rings mit dem Knochen</td></tr><tr><td>Surflo IV Katheter - Blau 22 G</td><td>Terumo</td><td>SR-OX2225C1</td><td></td></tr><tr><td>Ti:Saph Pulslaser (Kohärenz) (Femtosekunde)</td><td>Kohärent</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo zwei-photonen-bildgebung von megakaryozyten und blutplättchen im knochenmark des mausschädels

In Vivo Two-photon Imaging of Megakaryocytes and Proplatelets in the Mouse Skull Bone Marrow

Blutplättchen werden von Megakaryozyten produziert, spezialisierten Zellen im Knochenmark. Die Möglichkeit, Megakaryozyten in Echtzeit und ihre native Umgebung abbilden zu können, wurde vor mehr als 10 Jahren beschrieben und wirft ein neues Licht auf den Prozess der Thrombozytenbildung. Megakaryozyten verlängern längliche Vorsprünge, Pro thrombozyten genannt, durch die Endothelauskleidung von Sinusgefäßen. Dieser Artikel stellt ein Protokoll vor, um gleichzeitig in Echtzeit fluoreszierend markierte Megakaryozyten im Schädelknochenmark und in den Sinusgefäßen abbilden zu können. Diese Technik beruht auf einer kleinen Operation, die den Schädel intakt hält, um Entzündungsreaktionen zu begrenzen. Der Mauskopf wird mit einem Ring immobilisiert, der auf den Schädel geklebt ist, um Bewegungen am Atmen zu hindern.
Mit Hilfe der Zwei-Photonen-Mikroskopie können Megakaryozyten bis zu einigen Stunden visualisiert werden, was die Beobachtung von Zellvorsprüngen und Blutplättchen im Prozess der Dehnung in Sinusgefäßen ermöglicht. Dies ermöglicht die Quantifizierung mehrerer Parameter, die sich auf die Morphologie der Vorsprünge (Breite, Länge, Vorhandensein von Verengungsbereichen) und deren Dehnungsverhalten (Geschwindigkeit, Regelmäßigkeit oder Vorhandensein von Pausen oder Rückzugsphasen) beziehen. Diese Technik ermöglicht auch die gleichzeitige Aufzeichnung von zirkulierenden Blutplättchen in sinusförmigen Gefäßen, um die Thrombozytengeschwindigkeit und die Blutflussrichtung zu bestimmen. Diese Methode ist besonders nützlich, um die Rolle von Genen von Interesse bei der Thrombozytenbildung mit genetisch veränderten Mäusen zu untersuchen und ist auch für pharmakologische Tests (Untersuchung der Mechanismen, Bewertung von Medikamenten bei der Behandlung von Thrombozytenproduktionsstörungen) möglich. Es ist zu einem unschätzbaren Werkzeug geworden, insbesondere zur Ergänzung von In-vitro-Studien, da heute bekannt ist, dass die In-vivo- und In-vitro-Pro thrombozytenbildung auf verschiedenen Mechanismen beruht. Es hat sich beispielsweise gezeigt, dass in vitro Mikrotubuli für die Thrombozytenverlängerung per se benötigt werden. In vivodienen sie jedoch eher als Gerüst, wobei die Dehnung hauptsächlich durch Blutflusskräfte gefördert wird.

Unter Verwendung dieses Protokolls wurde der fluoreszierende Tracer Qtracker-655 intravenös verabreicht, um anastomosierte Knochensinusgefäße im Schädelknochenmark und die Fließrichtung, wie durch die Pfeile dargestellt, abzubilden (Abbildung 4A, links). Mit mTmG-Mäusen wurden eGFP-fluoreszierende Blutplättchen über 20 s in jedem Gefäßzweig aufgezeichnet und ihre Geschwindigkeit mit ImageJ und GNU Octave-Software gemessen(Abbildung 4A,rechts). Beachten Sie die H...

Wir beschreiben hier die Methode zur Abbildung von Megakaryozyten und Blutplättchen im Knochenmark des Schädelknochens lebender Mäuse mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie.

In Vivo Zwei-Photonen-Bildgebung von Megakaryozyten und Blutplättchen im Knochenmark des Mausschädels

Platelets are produced by megakaryocytes, specialized cells located in the bone marrow. The possibility to image megakaryocytes in real time and their ...

Diese Methode ermöglicht die Visualisierung verschiedener Ereignisse, die im Knochenmark der Schädelmaus stattfinden, wie Megakaryozyten, die Sich ausschildern und Pro thrombozyten innerhalb der Sinusgefäße ausdehnen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist eine kleine Operation, die erforderlich ist, um die Entzündungsreaktion zu minimieren, was eine In-vivo-Visualisierung von Ereignissen unter den fast fabrikseitigen Bedingungen ermöglicht. Transportieren Sie zunächst die Maus in den Bildraum.Schalten Sie Mikroskop und Computer ein und richten Sie die erforderlichen Parameter ein. Sobald die Maus vollständig betäubt ist, legen Sie die Maus auf eine beheizte Platte, die für alle folgenden Manipulationen auf 37 Grad Celsius erwärmt wird, rasieren Sie den Kopf und den Hals der Maus und tragen Sie das Gel auf die Augen auf, um Trockenheit zu verhindern. Legen Sie die Maus auf den Rücken und fixieren Sie die vorderen Beine mit chirurgischem Klebeband, um den Hals zu dehnen.Nach der Desinfektion des Rachens mit einer Schere einen Schnitt von 0,7 bis 1 Zentimeter über die rechte oder linke Jugularvene machen und das angrenzende Bindegewebe dehnen, um die äußere Jongliervene auf dem Brustmuskel freizulegen. Füllen Sie den Katheter mit warmer, steriler physiologischer Kochsalzlösung. Dringen Sie in den Katheter durch den Brustmuskel ein und führen Sie den Katheter dann in die Vene ein.Entfernen Sie vorsichtig die Nadel, verbinden Sie die Spritze mit den fluoreszierenden Tracern und injizieren Sie das Totvolumen des Katheters. Legen Sie einen Tropfen chirurgischen Klebers, um den Katheter zu stabilisieren. Bringen Sie die Maus vorsichtig in eine Bauchlage zurück.Desinfizieren Sie die Kopfhaut mit 70% Ethanol mit einem Papiertuch, während Sie die losen Haare entfernen. Verwenden Sie sterile feine Scheren und Pinzetten, um einen T-förmigen Schnitt an der Mittellinie bis zu einem Zentimeter zwischen den Ohren auf der Kopfhaut zu machen, um das Kalvarium freizulegen. Legen Sie den Schädel mit einer Pinzette frei, dann verwenden Sie Schere und Pinzette, um das Periost vorsichtig zu entfernen.Verwenden Sie einen sterilen Wattestäbchen getränkt und physiologische Kochsalzlösung, um das gesamte Periost und alle Ablagerungen oder Haare zu entfernen, die die Bildgebung verändern könnten. Spülen Sie den Schädel mit Kochsalzlösung ab, um Blutspuren zu entfernen, und trocknen Sie den Knochen schnell mit einem Wattestäbchen ab. Tragen Sie das Klebegel auf den Ring auf, legen Sie den Ring auf den freiliegenden Knochen und halten Sie ihn einige Sekunden lang, damit der Ring fest am Schädel befestigt werden kann.Befeuchten Sie den Schädel leicht mit einem salzhaltigen Wattestäbchen. Bereiten Sie die Silizium-Dentalpaste vor, indem Sie die blauen und gelben Komponenten vorsichtig im Verhältnis eins zu eins mischen. Versiegeln Sie den Ring, indem Sie die Zahnpaste auftragen, um ein Auslaufen während der Bildgebung zu verhindern.Entfernen Sie vorsichtig alle Zahnpasten oder Klebstoffe, die möglicherweise in den Ring gelangt sind. Dann füllen Sie den Ring mit Kochsalzlösung, um die Leckage zu überprüfen. Legen Sie die Maus auf die Stütze und legen Sie eine gefaltete Kompresse unter den Kopf des Tieres, um den Kopf anzuheben und zu verhindern, dass sich der Ring vom Schädel löst, wenn er am Halter befestigt wird.Schrauben Sie den Ring an den Blockhalter. Legen Sie die Stütze und die Mausmontage in die beheizte Mikroskopkammer. Stellen Sie die entsprechenden Laserwellenlängen für die ausgewählten vier Vierer und die Rückgewinnung der emittierten Lichter ein.Mit dem Interjongleurkatheter injizieren Sie 50 Mikroliter 0,2 Mikromolarlösung des fluoreszierenden Tracers, um das Gefäß zu kennzeichnen. Platzieren Sie den Mikroskopstand mit der Unterstützung und maus unter das Objektiv des Mikroskops. Stellen Sie sicher, dass der Ring immer mit Kochsalzlösung gefüllt ist und füllen Sie ihn bei Bedarf auf, und tauchen Sie das Ziel und die Kochsalzlösung ein.Verwenden Sie Epifluoreszenz, um die Knochenmarkgefäße zu lokalisieren und die Megakaryozyten entlang der sinusförmigen Gefäße auszurichten. Richten Sie für lange Aufnahmen eine 3D-Raum-Zeit-Erfassung mit einem 384 x 384 Pixel großen Bild mit einem Acht-Kilo-Hertz-Resonanzscanner und einem bidirektionalen Modus ein. Verwenden Sie die Zeilenmittelung mit guter Auflösung, wählen Sie dann die optimierte Z-Schrittgröße und richten Sie das erforderliche Zeitintervall ein, bevor Sie mit der Erfassung beginnen.Wählen Sie für kurze und schnelle Aufnahmen einen Raum- und Zeiterfassungstyp und minimieren Sie die Bildgröße. Passen Sie das Bild bei Bedarf an das Gefäß an, indem Sie das Bildfeld drehen. Verwenden Sie die höchste verfügbare Scangeschwindigkeit und bidirektionales Scannen.Minimieren Sie die Mittelwertbildung der Linie, um den optimalen Kompromiss zwischen Bilddefinition und Geschwindigkeit der Aufnahme zu finden. Erwerben Sie nur einen Z-Plan und minimieren Sie das Zeitintervall für die Erfassung. Für die Messung der Thrombozytengeschwindigkeit sollten 10 bis 20 Sekunden Erfassung ausreichen.Der fluoreszierende Tracer wurde intravenös verabreicht, um die anastomosierten Sinusgefäße des Markes im Schädelknochenmark abzubilden, wobei die Fließrichtung durch den Pfeil dargestellt wurde. Die fluoreszierende Thrombozytengeschwindigkeit wurde in jedem Gefäßzweig aufgezeichnet und Variationen wurden beobachtet. Die sinusförmigen Gefäße präsentieren aufgrund der Anastomosen komplexe Strömungen, mit dem Vorhandensein von Strömungsrückfluss und sogar Stasis.Pfeile zeigten die entgegengesetzte Strömungsrichtung an der Verzweigung an. Die Thrombozytengeschwindigkeit wurde auch für linke und rechte Gefäßäste gemessen, die im Laufe der Zeit in jedem Gefäßzweig mit Phasen der Beschleunigung, Stasis und Verzögerung Unregelmäßigkeiten anzeigten. Verschiedene Morphologien von Proplättchen wurden beobachtet, darunter Proplättchen mit unregelmäßigen Rändern, dann lange Proplättchen und dicke und kurze Proplättchen.Wenn Megakaryozyten die Proplättchen in den Bereichen komplexer Strömungen ausdehnen, wurden die Proplättchen entsprechend der Strömungsrichtung von einem Gefäßzweig zum anderen gewächsigt. Nach dem Stoppen des Blutflusses entspannten sich die Blutplättchen und die Maus erlitt unerwartet einen Herzstillstand, was auf die Bedeutung hydrodynamischer Kräfte bei der Pro thrombozytendehnung hindeutet. Die Breite und Länge der Proplättchen wurde ebenfalls mit einer mittleren Breite von 5,2 Mikrometern gemessen und eine mittlere maximale Länge von etwa 185 Mikrometern beobachtet.Die Darstellung der Prothrombozytenlänge als Funktion der Zeit ermöglicht die Visualisierung des Verhaltens von Proplättchen während Phasen der Dehnung, Stase oder sogar des Rückzugs. Die mittlere Dehnungsgeschwindigkeit von etwa 10 Mikrometern pro Minute wurde beobachtet. Die Installation des Katheters ermöglichte die Injektion von Medikamenten, um die Auswirkungen auf die Thrombozytenbildung oder andere interessante Ereignisse in Echtzeit zu untersuchen.

in-vivo-two-photon-imaging-megakaryocytes-proplatelets-mouse-skull

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

In diesem Video beschreiben wir einen chirurgischen Eingriff, bei dem eine kraniale Ringanordnung auf dem freiliegenden Schädelknochen implantiert und der Kopf der Maus für hochauflösende Bildgebung des Gehirns über einen langen Zeitraum weiter immobilisiert wird.

Installation einer kranialen Ringanordnung im Mausmodell: Ein chirurgisches Verfahren zur Implantation einer Visualisierungsfensteranordnung am Mausschädel für die hochauflösende Bildgebung des Schädelknochenmarks

Zeitraffer-Bildgebung am lebenden Tier liefert wertvolle Informationen über die strukturelle Reorganisation im intakten Gehirn. Hier stellen wir ein verdünntes Schädelpräparat vor, das die transkranielle Bildgebung von fluoreszenzmarkierten synaptischen Strukturen in der lebenden Mausrinde mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie ermöglicht.

Zwei-Photonen-<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging von dendritischen Dornen in der Maus Cortex Mit einem ausgedünnten Schädel Vorbereitung

Kombinatorische 5 fluoreszierenden Proteinen markiert von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen in vivo ermöglicht klonalen Tracking über die konfokale und Zwei-Photonen-Mikroskopie, die einen Einblick in die Knochenmark blutbild Architektur während der Regeneration. Dieses Verfahren ermöglicht nicht-invasive Abbildung von Schicksal spektral kodierten HSPCs abgeleiteten Zellen in intaktem Gewebe für ausgedehnte Zeiträume nach der Transplantation.

In vivo Klonale Verfolgung von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen durch Fünf Fluoreszierende Proteine ​​mit Hilfe der konfokalen und Multiphotonen Mikroskopie Markierte

Die Art der Wechselwirkung zwischen hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen (HSPCs) und Knochenmark Nischen schlecht verstanden. Kundenspezifische Hardware-Modifikationen und eine mehrstufige Akquisitionsprotokoll ermöglichen den Einsatz von Zwei-Photonen-Mikroskopie und konfokaler Bild ex vivo markierten HSPCs innerhalb des Knochenmarks Bereichen referenziert, Tracking-Wechselwirkungen und Bewegung.

In-vivo-4-Dimensional-Tracking von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen im erwachsenen Maus Schädeldachknochenmark

Monozyten sind Schlüsselregulatoren der angeborenen Immunität und spielen eine entscheidende Rolle bei der Erneuerung des peripheren mononukleären phagozytischen Systems und im Falle von Entzündungen. Dieses Manuskript beschreibt das Verfahren der Echtzeit-Bildgebung des Schädeldachknochenmarks der Maus, um den Mobilisierungsmechanismus der Monozyten zu untersuchen.

Tracking-Maus-Knochenmark-Monozyten<em&gt; In-vivo-</em

Wir beschreiben ein Protokoll zur Überwachung des Verhaltens von Neutrophilen und Monozyten in Mesenterialvenen unter stationären und entzündlichen Bedingungen mittels intravitaler konfokaler Mikroskopie an anästhesierten Mäusen.

Abbilden Neutrophilen und Monozyten in Mesenterialvenen von Intravitalmikroskopie an narkotisierten Ratten in Echtzeit

Das Protokoll beschreibt ein neuartiges Maus-Femur-Fensterkammermodell, das verwendet werden kann, um die Bewegung von Zellen im femoralen Knochenmark in vivo zu verfolgen. Die Intravital-Multiphotonen-Fluoreszenzmikroskopie wird verwendet, um drei Komponenten des femoralen Knochenmarks (Gefäße, Kollagenmatrix und Neutrophile) im Zeitverlauf abzubilden.

Femur Fensterkammer Modell für<em&gt; In Vivo</em&gt; Zelltracking im Knochenmark der Maus

Intravitalen Fluoreszenz-Mikroskopie (IVFM) von der Calvarium wird in Kombination mit genetischen Tiermodelle zur Untersuchung der Referenzfahrt und Engraftment des blutbildenden Zellen des Knochenmarks (BM) Nischen angewendet.

Kombination von intravitalen Fluoreszenz-Mikroskopie (IVFM) mit genetischen Modellen Engraftment Dynamik der blutbildenden Zellen des Knochenmarks Nischen zu studieren

Hier stellen wir ein Protokoll zur Analyse der Ultrastruktur der Megakaryozyten in situ mittels Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) vor.  Murine Knochenmarke werden gesammelt, fixiert, in Epoxidharz eingebettet und in ultradünnen Abschnitten geschnitten. Nach der Kontrastfärbung wird das Knochenmark unter einem TEM-Mikroskop bei 120 kV beobachtet.

In situ Erforschung der murinen Megakaryopoese mittels Transmissionselektronenmikroskopie

Hier beschreiben wir die Knochenmark-Explantationsmethode, von der Probenvorbereitung bis zur mikroskopischen Objektträgeranalyse, um die Fähigkeit von Megakaryozyten, die sich in ihrer physiologischen Umgebung differenziert haben, zu bewerten, Proplatelette zu bilden.

Proplatbildungsdynamik von mausfrischen Knochenmark-Explantaten

Die Intravitalmikroskopie ermöglicht die Untersuchung dynamischer biologischer Prozesse wie Geweberegeneration und Tumorentwicklung. Das Schädeldachknochenmark, ein hochdynamisches Gewebe, bietet Einblicke in die Blutbildung und Gefäßfunktion. Die Verwendung eines biokompatiblen 3D-gedruckten Kopffixationsimplantats ermöglicht eine repetitive Längsbildgebung und verbessert so unser Verständnis der Gewebedynamik und der Mikroumgebung des Tumors.

Intravitale longitudinale Bildgebung der Gefäßdynamik im Schädeldachknochenmark

Erfahren Sie die Zwei-Photonen-Mikroskopie zur Echtzeitbildgebung von Megakaryozyten und Proplättchenbildung im Knochenmark der Maus. Diese Methode ermöglicht die Quantifizierung morphologischer und dynamischer Parameter in vivo.

In Vivo Zwei-Photonen-Bildgebung von Megakaryozyten und Blutplättchen im Knochenmark des Mausschädels

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