Kleinkäfig-Laborversuche mit gentechnisch veränderten Anopheline-Mücken

Das hier beschriebene Protokoll ist geeignet, um die transgene Mückenleistung und Vergleiche mit Wildtyp-Gegenstücken in einem kleinen Laborkäfigversuch zu bewerten. Die Kleinkäfigversuche sind wichtig, um Erfahrungswerte zu liefern, die helfen, die Implementierung neuer Technologien zur Eliminierung von Malaria zu unterstützen. Die Käfigversuche können an andere experimentelle Designs angepasst werden und eignen sich, um die Dynamik einer Bedrohung durch ein Desire-Transgen zu beurteilen.

Nach der Einführung transgene Individuen. Beginnen Sie die Anfangsphase des Experiments, indem Sie drei 0,216 Kubikmeter große Käfige in Triplikaten aufstellen. Und fügen Sie jedem Käfig über drei aufeinanderfolgende Wochen 60 Wildtyplarven im zweiten Stadium hinzu.

Stellen Sie jede Woche erwachsene Weibchen in jedem Käfig mit betäubten Mäusen als Blutmahlzeitquelle zur Verfügung. Und ein Eiablagebehälter drei Tage nach der Blutmahlzeit. Schlüpfen Sie wöchentlich Eier aus jedem Käfig.

Wählen Sie von Woche vier bis acht 60 L2-Larven im zweiten Stadium nach dem Zufallsprinzip aus, um in ihre jeweiligen Käfige zurückzukehren. Weisen Sie in Woche neun nach dem Zufallsprinzip einen Satz dreifacher Käfige als Kontrollen und einen Satz für jedes gewünschte Freisetzungsverhältnis zu. Fügen Sie wöchentlich 60 Wildtyppuppen mit 30 Männchen und 30 Weibchen zu den Kontrollkäfigen hinzu.

Halten Sie ein Verhältnis von eins zu eins in jedem jeweiligen Käfig aufrecht, indem Sie wöchentlich 30 transgene männliche Puppen zusammen mit 60 Wildtyppuppen hinzufügen. Für ein Verhältnis von eins zu 0,1 fügen Sie wöchentlich 300 transgene männliche Puppen zusammen mit 60 Wildtyppuppen in den jeweiligen Käfig hinzu. Wiederholen Sie das Hinzufügen von Mückenpuppen im Käfig, die Bereitstellung von Blutmehl und das Ausbrüten von Eiern jede Woche.

Wählen Sie insgesamt 300 Larven aus jedem Käfig nach dem Zufallsprinzip für das Screening aus. Screenen Sie die Larven unter einem Stereomikroskop mit Fluoreszenzfiltern auf die Expression des fluoreszierenden dominanten Markers im Larven- und Puppenstadium. Bewerten Sie das Geschlecht der resultierenden Puppen.

Wenden Sie im Gene-Drive-Experiment eine Barrierestrategie an, indem Sie Moskitos in einem sicheren Insektarium halten und Standardarbeitsanweisungen mit regelmäßiger Überwachung befolgen. Bereiten Sie einen Käfig vor, der mit zwei Sätzen von dreifachen 0,216 Kubikmeter-Käfigen für jedes gewünschte transgene zu wildtypische männliche Freisetzungsverhältnis eingerichtet ist. Um ein männliches Freisetzungsverhältnis von eins zu eins zu erreichen, fügen Sie 120 transgene Männchen, 120 Wildtypmännchen und Weibchen im Puppenstadium zu jedem Replikatkäfig hinzu.

Geben Sie eine Blutmahlzeit mit betäubten Mäusen an vier bis sieben Tage alte Weibchen in jedem Käfig. Nachdem Sie Eier in einer Larvenschale geschlüpft haben, wählen Sie etwa 240 L1-Larven des ersten Stadiums nach dem Zufallsprinzip aus jedem Käfig aus und ziehen Sie sie zu Puppen auf, bevor Sie in ihre jeweiligen Käfige zurückkehren. Wählen und screenen Sie Larven auf Augenmarker und Geschlechtsphänotyp wie zuvor beschrieben.

Stellen Sie einen Käfigaufbau aus dreifachen 0,005 Kubikmeter-Käfigen mit einer gleichen Anzahl von Männchen und Weibchen für jedes spezifische Freisetzungsverhältnis von Transgenen zu Wildtyp-Männchen zusammen. Mit einem künstlichen Fütterungsgerät versorgen Sie die vier bis sieben Tage alten Weibchen in jedem Käfig an zwei aufeinanderfolgenden Tagen mit Blutmahlzeiten. Fügen Sie drei Tage nach der zweiten Blutmahlzeit einen Eiablagebehälter hinzu und entfernen Sie die Behälter nach drei Tagen.

Nachdem Sie alle Toten und die lebenden Erwachsenen, die im Käfig verbleiben, nach Geschlecht bewertet haben, lagern Sie sie bei minus 80 Grad Celsius für die molekulare Analyse. Brüten Sie Eier aus und wählen Sie 200 L1-Larven aus und legen Sie die Larven beiseite, um neue Käfige für die nächste Generation zu bevölkern. Wählen Sie dann nach dem Zufallsprinzip weitere 500 Larven aus jedem Käfig aus, der für das Screening vorgesehen ist.

Die ausgewählten 200 Larven zur Puppe und 500 Larven zum L4-Stadium aufziehen. Bringen Sie die Puppe aus 200 Tabletts zurück, um den neuen Käfig zu füllen. Sieben Sie zufällig ausgewählte Larven auf Augenmarker und Geschlechtsphänotyp wie zuvor.

In der repräsentativen Analyse wird die erwartete Phänotypdynamik der leistungsstärksten Replikate für die verschiedenen Populationsersatzkäfig-Studienprotokolle gezeigt. Die Ergebnisse zeigten den linear steigenden Anteil von Larven mit DsRed-Marker-Phänotyp über sieben Generationen. Die Eins-zu-Eins-Freisetzung ohne Laufwerk erreichte innerhalb von sieben Generationen etwas mehr als 80% Transgeneinführung.

Die Gene-Drive-Protokolle erreichten dies innerhalb von drei bis vier Generationen. Dies bestätigt, dass eine einzige Freisetzung eines Gene-Drive-Systems für die Transgeneinführung effizienter sein kann. Am Ende der Beobachtung hatte die Ausbreitung des Transgens eine fast vollständige Einführung in Gene-Drive-Systeme erreicht.

Wichtige Parameter wie die Altersstruktur der Freisetzungsquote, die Käfiggröße und andere variieren je nach Zweck des Experiments und spezifischen Zielen. Experimente zur Beurteilung von Fitnessparametern wie Fruchtbarkeit und Fruchtbarkeit können durchgeführt werden. Darüber hinaus können empirische Daten aus den Käfigversuchen verwendet werden, um mathematische Modelle der Populationsdynamik zu parametrisieren.