Mikroinjektionsmethode für Anopheles gambiae Embryonen

Dieses Protokoll ist von Bedeutung, da es eine spezifische Mikroinjektionsmethode für eine Anopheles gambiae bereitstellt, die in der Vergangenheit mit gängigen gentechnischen Techniken schwer zu transformieren war. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie zuverlässig transgene Anopheles gambiae erzeugt. Die Anwendungen dieser Technik erstrecken sich auf neuartige Strategien zur Eliminierung von Malaria, indem sie die Bildung von Moskitos erleichtern, die für die Populationsunterdrückung oder -modifikation von Wildtyp-Anopheles gambiae-Populationen geeignet sind.

Diese Methodik kann leicht an verschiedene Mückenarten angepasst werden. Unsere Mikroinjektionstechnologie erfordert Geduld und Übung. Es gibt eine Lernkurve.

Verwenden Sie zunächst einen Sauger, um 20 bis 30 Weibchen in ein transparentes konisches 50-Milliliter-Röhrchen zu legen. Stellen Sie sicher, dass das Röhrchen an beiden Enden aufgeschnitten und an einem Ende mit Latex-Zahnfilm und am anderen Ende mit Nylongewebe und Filterpapier bedeckt ist, wo Moskitos ihre Eier ablegen. Legen Sie das mit Mücken gefüllte Röhrchen in eine kleine Petrischale, die mit doppelt destilliertem Wasser gefüllt ist, und legen Sie dann das Röhrchen und die Schüssel für 45 Minuten in einen Inkubator bei 28 Grad Celsius.

Entfernen Sie das Röhrchen aus dem Inkubator und führen Sie das Röhrchen in einen leeren Käfig ein. Klopfen Sie vorsichtig auf die Röhre, damit Moskitos herausfliegen können. Entfernen Sie die Röhre aus dem Käfig, sobald alle Moskitos ausgeflogen sind.

Wenn das Röhrchen frei von Moskitos ist, schrauben Sie den unteren Ring ab, entfernen Sie das Nylon und entfernen Sie mit einer Pinzette vorsichtig das Filterpapier mit den Eiern aus dem Röhrchen. Legen Sie das mit Ei beladene Filterpapier in eine Kunststoff-Petrischale, die eine mit Wasser angefeuchtete Schicht Filterpapier enthält. Legen Sie eine Membran auf einen sauberen Glasträger und bedecken Sie die Membran mit einer sauberen Pinzette mit einem Stück Filterpapier, wobei etwa ein Millimeter des Membranfilters unbedeckt bleibt.

Befeuchten Sie das Filterpapier mit entionisiertem Wasser, übertragen Sie dann mit der Bürste vorsichtig 30 bis 50 Embryonen an den Rand der Membran und richten Sie die Eier vertikal entlang der Membran aus. Richten Sie die Eier in die gleiche Richtung aus, so dass, wenn Eier unter dem Mikroinjektionsmikroskop beobachtet werden, das hintere Ende in einer abwärts gerichteten Position ist und mit der Nadel einen Winkel von 15 Grad bildet. Den gesamten Rand der Membran mit Eiern auslegen.

Verwenden Sie eine Mikroladerspitze, um die Nadeln mit zwei Mikrolitern DNA-Mischung zu füllen. Führen Sie die Nadel in den Nadelhalter ein und schließen Sie den automatisierten Druckpumpenschlauch an. Richten Sie die Nadel so aus, dass sie einen Winkel von 15 Grad mit der Ebene des Objektträgers bildet.

Öffnen Sie die Nadelspitze, indem Sie das erste Ei vorsichtig berühren, und führen Sie dann die Nadelspitze auf etwa 10 Mikrometer in die hintere Stange ein. Eine erfolgreiche Injektion führt zu einer kleinen Bewegung des Zytoplasmas innerhalb des Eies. Verwenden Sie die koaxialen Stufensteuerungen des Mikroskops, um zum nächsten Ei zu gelangen, um die Injektion fortzusetzen.

Um sicherzustellen, dass die Nadelspitze offen bleibt und nicht verstopft ist, drücken Sie die Injektionstaste, bevor Sie in einen anderen Embryo eintreten, und visualisieren Sie den kleinen Tröpfchen an der Öffnung der Nadel. Wenn die Nadel verstopft ist, drücken Sie die Clear-Taste, um die Nadel zu löschen und den Tröpfchenvisualisierungstest zu wiederholen. Stellen Sie den Druck nach Bedarf ein, wenn die Nadelspitzenöffnung etwas größer wird, um sicherzustellen, dass die Tröpfchengröße klein bleibt.

Injizieren Sie etwa 40 bis 50 Eier mit einer Nadel. Nachdem die Injektionen abgeschlossen sind, spülen Sie die Eier in einen mit Filterpapier ausgekleideten Und mit 50 Millilitern entionisiertem Wasser gefüllten Glasbehälter ab. Mit diesem Protokoll wurde ein autonomes gengetriebenes System in die Keimbahn eines Laborstamms G3 von Anopheles gambiae eingefügt.

Das System wurde entwickelt, um auf den Kardinalortholog oder Agcd auf dem dritten Chromosom dieser Spezies abzuzielen. Das Plasmid pCO37 wird gezeigt. Es enthält Streptococcus pyogenes Cas9-Endonuklease unter Kontrolle der regulatorischen Elemente des Nano-Genorthologs.

Darüber hinaus verfügt es über eine Guide-RNA unter der Kontrolle eines U6-Genpromotors und der 3XP3 CFP-dominanten Markerkassette, die das cyanfarbene fluoreszierende Protein exprimiert. Molekulare Ansätze bestätigten die genaue Insertion von etwa 10 Kilo Basenpaaren DNA, die als AgNosCd-1 bezeichnet wurde. Umfangreiche Follow-up-Analysen zeigten, dass AgNosCd-1 beim Antrieb hocheffizient war, nur wenige resistente Allele erzeugte und aufgrund der Integration und Expression des Gene-Drive-Systems keine größere genetische Belastung aufwies.

Homozygote Gene Drive, die Moskitos enthielten, waren Loss-of-Function-Mutanten, wobei Larven, Puppen und neu aufgetauchte Erwachsene einen Rote-Augen-Phänotyp hatten. Wenn Sie dieses Protokoll versuchen, ist es entscheidend, bei 88 zu bleiben, um hellgraue Eier gut zu schlüpfen und weiße Eier zu vermeiden.