Assemblierung von zellimitierenden unterstützten und suspendierten Lipiddoppelschichtmodellen zur Untersuchung molekularer Wechselwirkungen

Die in diesem Protokoll beschriebene Konstruktion von Lipiddoppelschichtmembranen kann verwendet werden, um entscheidende Informationen über Membranwechselwirkungen mit pharmazeutischen Wirkstoffen, umwelttoxischen Mitteln und sogar biologischen Verbindungen zu erhalten. Diese Techniken können verwendet werden, um Membranen mit unterschiedlicher Flüssigkeitskomplexität herzustellen und die Permeabilität, Absorption und Einbettung von Verbindungen in Membranen zu bewerten. Geben Sie zunächst das entsprechende Volumen der Lipidstocklösung in ein sauberes Glas, um nach der Rehydratation eine endgültige Vesikelkonzentration von 2,5 Milligramm pro Milliliter zu erreichen.

Entfernen Sie Chloroform aus der Lipidlösung mit einem Stickstoffgasstrom. Um eine vollständige Entfernung von Chloroform zu gewährleisten, verbinden Sie den getrockneten Lipidfilm mindestens vier Stunden lang mit dem Vakuum. Rehydrieren Sie den getrockneten Lipidfilm mit einem erforderlichen Volumen an Tris-Natriumchloridpuffer, um die endgültige Vesikelkonzentration von 2,5 Milligramm pro Milliliter zu erhalten, und wirbeln Sie etwa 15 bis 30 Sekunden lang.

Die Vesikelsuspension in einen Behälter mit Trockeneis geben, bis sie für ca. 30 Minuten eingefroren ist. Nachdem die Probe vollständig eingefroren ist, tauen Sie die Suspension in einem 30 bis 40 Grad Celsius warmen Wasserbad auf. Wirbeln Sie die aufgetaute Vesikelsuspension.

Um einen Milliliter oder weniger Vesikel herzustellen, besorgen Sie sich einen Mini-Extruder. Befeuchten Sie eine Filterhalterung mit ultrareinem Wasser und legen Sie sie dann auf die Membranträgeroberfläche im O-Ring. Wiederholen Sie dies für die zweite interne Membranstütze.

Positionieren Sie eine interne Membranstütze in das Außengehäuse des Extruders. Legen Sie eine 100 Nanometer große Polycarbonatmembran direkt über die Filterhalterung auf die interne Membranhalterung. Positionieren Sie den zweiten internen Membranträger im Extruderaußengehäuse mit dem O-Ring und der Filterträgerseite, die der Polycarbonatmembran zugewandt sind.

Befestigen Sie das Polytetrafluorethylenlager in den Halterastecker und schrauben Sie es mit dem Extruderaußengehäuse zu. Clippen Sie den Extruder in den Heizblock. Laden Sie die Lipidvesikelsuspension in eine der Spritzen und positionieren Sie die Spritze im Extruder-Wärmeblock, wobei Sie die Nadel vollständig in ein Ende des Extruders einführen.

Setzen Sie die zweite leere Spritze in die gegenüberliegende Seite ein und verriegeln Sie beide Spritzen mit den Armklammern am Wärmeblock. Drücken Sie die Vesikelaufhängung langsam in die leere Spritze und dann wieder in die Originalspritze. Wiederholen Sie dies 20 weitere Male für insgesamt 21 Durchgänge durch die Polycarbonatmembran.

Übertragen Sie die Lipidvesikel zur Lagerung in ein sauberes Glas. Um fünf bis 50 Milliliter Vesikel zu extrudieren, montieren Sie den großen Extruder, indem Sie den großen Lochsiebträger, die zentrierte Scheibe, die Ablassscheiben und die Polycarbonatmembran in den Raum in der unteren Auflage des Extruders legen. Verbinden Sie die oberen und unteren Stützen des Extruders mit den vier Schrauben und ziehen Sie sie fest.

Befestigen Sie die Extrudereinheit am Probenzylinder, indem Sie sie an der Unterseite schrubben und mit einem Schraubenschlüssel festziehen, um sie zu sichern. Füllen Sie den Probenzylinder mit Reinstwasser und extrudieren Sie das Wasser durch die Extrudereinheit, bevor Sie die Probe in den Probenzylinder geben. Die Lipidvesikelsuspension in den Probenzylinder geben und die Oberseite verschrauben.

Erhöhen Sie langsam den Druck, bis die Probe mit einer Geschwindigkeit von etwa zwei bis drei Tropfen pro Sekunde aus der Extrudereinheit in ein sauberes Glas zu tropfen beginnt. Sobald alle Proben extrudiert wurden, schalten Sie die Stickstoffzufuhr aus und geben Sie den Druck im Probenzylinder ab, indem Sie das Überdruckventil langsam öffnen. Gießen Sie die Lipidvesikel zurück in den Probenzylinder und wiederholen Sie den vorherigen Schritt neun weitere Male für insgesamt 10 Extrusionen.

Laden Sie die Vesikelsuspension in die entsprechende Küvette und legen Sie sie in das dynamische Lichtstreuinstrument ein, geben Sie die Probendetails ein und führen Sie die Messung mit der zugehörigen Software durch. Legen Sie die Zetazelle in die Probenkammer, stellen Sie sicher, dass die Elektroden in Kontakt sind, und schließen Sie den Probenhalterdeckel. Geben Sie in der zugehörigen Software die Probendetails ein und sammeln Sie Messungen.

Setzen Sie den quarzcodierten Quarzkristallsensor in das Durchflussmodul ein, um sicherzustellen, dass die T-Form auf dem Kristall mit der T-Form auf dem Modul übereinstimmt, und schrauben Sie das Durchflussmodul zu. Bei Instrumenten mit mehreren Kammern können zusätzliche Doppelschichten parallel gebildet werden. Schließen Sie den Einlass- und Auslassschlauch an das Durchflussmodul und die Pumpe an.

Legen Sie den Schlauch in die Haltevorrichtungen und schließen Sie den Deckel des Analysatorsystems. Stellen Sie einen Abfallbehälter an den Auslass der Pumpe, um verbrauchte Lösungen zu sammeln. Um die Reinigung durchzuführen, schalten Sie zuerst die Pumpe ein und stellen Sie die Durchflussgeschwindigkeit auf 400 Mikroliter pro Minute ein.

Führen Sie den Einlassschlauch in Reinstwasser ein und lassen Sie fünf bis 10 Milliliter durch das Modul fließen. Schalten Sie die Schläuche in SDB um und strömen Sie fünf bis 10 Milliliter durch das Modul. Schläuche wieder in Reinstwasser umschalten und 10 bis 20 Milliliter durch das Modul strömen lassen.

Schließlich strömen Sie Luft durch das Modul, bis keine verbleibende Lösung mehr gesammelt ist. Entfernen Sie den Sensor aus dem Durchflussmodul und spülen Sie den Sensor mit hochreinem Wasser ab. Treiben Sie den Sensor und das Durchflussmodul mit einem Stickstoffgasstrom an, um sicherzustellen, dass die Elektrode immer frei von Flüssigkeit bleibt.

Setzen Sie den quarzbeschichteten Quarzkristallsensor in einen chemischen Abzug in ein UV- oder Ozonreinigungsinstrument ein. Schalten Sie das Instrument ein und lassen Sie die Behandlung mindestens zwei Minuten einwirken. Entfernen Sie die Sensoren vorsichtig und geben Sie sie in das Durchflussmodul zurück.

Schalten Sie das Analysegerät ein, um die zugehörige Software anzuschließen, und stellen Sie die Temperatur auf den gewünschten Wert für die Bildung der unterstützenden Lipiddoppelschicht ein. Lassen Sie die Temperatur auf den gewünschten Eingang stabilisieren. Konfigurieren Sie die Messung und finden Sie alle Sensorresonanzfrequenzen und die Dissipation für die Obertöne drei, fünf, sieben, neun, 11 und 13, bevor Sie mit der Messung beginnen.

Lassen Sie Tris-Natriumchlorid fünf bis 10 Minuten durch das Modul fließen, um sicherzustellen, dass die Basisfrequenzänderung oder Delta F- und Dissipationsänderung oder Delta D-Werte in Flüssigkeit stabil bleiben. Stoppen Sie die Pumpe, entfernen Sie den Einlassschlauch von der Tris-Natriumchloridlösung und führen Sie ihn vorsichtig in die Lipidvesikellösung ein. Fünf Sekunden lang rückströmen, um Luftblasen aus dem Einlassschlauch zu entfernen, und dann den Vorwärtsstrom fortsetzen.

Starten Sie die Messung in der Software neu, um die Baseline auf Null zu setzen. Fließen Lipidvesikel bis zur Doppelschichtbildung in Echtzeit in der Datenerfassungssoftware. Wiederholen Sie dann diesen Schritt, um den Einlassschlauch von Lipidvesikeln zurück in Tris-Natriumchloridpuffer zu ändern.

Fügen Sie fünf Mikroliter der Lipidlösung in das Donorkompartiment hinzu, bei dem es sich um eine poröse Polyvinylidendifluorid-96-Well-Multiscreen-Filterplatte mit einer Porengröße von 0,45 Mikrometern handelt. Tauchen Sie die Filterplatte sofort in das Akzeptorfach ein, bei dem es sich um eine Transportbehälterplatte handelt, die 300 Mikroliter phosphatgepufferte Kochsalzlösung enthält. 200 Mikroliter phosphatgepufferte Kochsalzlösung in das Transportspenderkompartiment geben.

Befolgen Sie die vorherigen Schritte, um die Pumpe zu stoppen und den Einlassschlauch in Lipidvesikellösung umzuwandeln und die Doppelschichtbildung zu beobachten, dann ändern Sie den Einlassschlauch in die Alpha-Helikal- oder AH-Peptidlösung. Führen Sie die Lösung in das Durchflussmodul ein, bis die Frequenzänderung und die Verlustleistungsänderung durch die neue Lösungszugabe beobachtet werden. Stoppen Sie die Pumpe und lassen Sie das AH-Peptid 10 Minuten lang mit den Vesikeln inkubieren.

Schalten Sie den Einlassschlauch in Tris-Natriumchlorid um und starten Sie den Fluss, um das AH-Peptid aus den gerissenen Vesikeln zu entfernen, was zur erfolgreichen Bildung einer Lipiddoppelschicht führt. Zuerst das Moleküllösungsmittel fließen lassen, dann den Einlassschlauch in die Lösung umschalten, die das Molekül von Interesse enthält, und mindestens fünf Minuten lang fließen lassen. Wenn gewünscht, stoppen Sie den Fluss und lassen Sie die Flüssigkeit, die das gewünschte Molekül enthält, mit der Doppelschicht inkubieren.

Wechseln Sie den Einlassschlauch zurück zum Moleküllösungsmittel allein. Mindestens fünf Minuten durchströmen lassen, dann den Einlassschlauch in Tris-Natriumchlorid umschalten und mindestens fünf Minuten lang fließen lassen. Stoppen Sie in der Software die Messung, speichern Sie die Datei und stoppen Sie die Pumpe.

Unmittelbar nach den vorherigen Schritten für eine Einlipid-Suspendierungsdoppelschicht oder für eine Multi-Lipid-Suspendierungsdoppelschicht wird PBS aus dem Donorfilterplattenkompartiment entfernt und durch 200 Mikroliter der Testlösung ersetzt. Tauchen Sie sofort in eine neue Transportbehälterplatte mit 300 Mikrolitern PBS ein. Nach der Inkubation mit sanftem Schaukeln für zwei Stunden bei 25 Grad Celsius werden 150 Mikroliter der Lösung aus den Spender- und Akzeptorkompartimenten entnommen.

Messen Sie die Molekülkonzentration in beiden Proben mit einer geeigneten Methode, die auf den Eigenschaften dieses Moleküls basiert. Größe, Polydispersität und Zetapotential von Uni-Lipid-Ei-PC-Vesikeln und zwei Multilipid-Vesikelzusammensetzungen wurden verglichen. Die Größenverteilung der Ei-PC-Vesikel und der Multi-Lipid-Eins-Vesikel war nahezu identisch.

Sowohl Ei- als auch PC-Multilipid-Eins-Vesikel waren negativ geladen, während Zwei-Lipid-Vesikel positiv geladen waren. Uni-Lipid-Ei-PC-Vesikel werden leicht an die Oberfläche absorbiert, wie die Abnahme der Frequenzänderung und die Zunahme der Dissipationsänderung zeigen, gefolgt von einer spontanen Ruptur. Multilipidvesikel werden an die Oberfläche absorbiert, erfordern jedoch die Zugabe von AH-Peptid, um die Vesikel zu reißen, was zur Bildung von Lipiddoppelschichten führt.

Mit unterstützten Lipiddoppelschichten können Frequenzänderungen und Dissipationsänderungen vor und nach der Einführung einer interessierenden Verbindung analysiert werden. So wurden beispielsweise Wechselwirkungen von DEHP und umwelttoxischem Wirkstoff mit träger Uni und schichtweise mehrschichtig untersucht. Ähnliche Konzentrationen der DEHP-Absorption wurden für beide Lipiddoppelschichttypen beobachtet.

Es wurden jedoch Unterschiede in der Dissipationsänderung zwischen den Doppelschichten beobachtet, wobei eine größere Dissipationsänderung für die Ei-PC-Doppelschicht im Vergleich zur Multilipid-Doppelschicht beobachtet wurde. Sowohl für Ein- als auch für Multilipid-Doppelschichten wurde eine geringe Permeation beobachtet. Nach diesem Verfahren kann eine Vielzahl von zellimitierenden Lipiddoppelschichten entwickelt werden, um ein zellfreies Screening molekularer Wechselwirkungen mit Verbindungen von Pharmazeutika bis hin zu umwelttoxischen Mitteln zu ermöglichen.