Name: Dissektion einzelner Skelettmuskelfasern für immunfluoreszierende und morphometrische Analysen von neuromuskulären Verbindungen am ganzen Berg (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-14T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: Lernen Sie die Präparation einzelner Skelettmuskelfasern aus Ratten-EDL- und Soleus-Muskeln für immunfluoreszierende Analysen neuromuskulärer Verbindungen. Diese Methode ermöglicht hochauflösende morphometrische Untersuchungen prä- und postsynaptischer Strukturen.

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Vielen Dank an CSIC und PEDECIBA für die finanzielle Unterstützung dieser Arbeit; an Natalia Rosano für ihre Manuskriptkorrekturen; an Marcelo Casacuberta, der das Video macht, und an Nicolás Bolatto, der ihm seine Stimme ge lieh.

Alle Tierversuche wurden gemäß den Richtlinien des nationalen Gesetzes Nr. 18611 für die Pflege von Tieren, die für Versuchszwecke verwendet werden, durchgeführt. Das Protokoll wurde von der Institutionellen Ethikkommission genehmigt (CEUA IIBCE, Protokollnummer 004/09/2015).
1. Muskeldissektion (Tag 1)
HINWEIS: Bevor Sie beginnen, machen Sie 40 ml 0,5% Paraformaldehyd (PFA), pH 7,4 in Dulbeccos Phosphatsalzlösung (DPBS). Optional machen Sie 20 ml 4% PFA. 5 ml Aliquoten zubereiten und bei -20 °C einfrieren. Am Tag der Dissektion ein Aliquot von 4% auftauen und 35 ml DPBS hinzufügen, um 40 ml 0,5% PFA zu erhalten.
<ol><li>
Isolierung von EDL (Schnellzuckenmuskel)
	<ol>
<li>Euthanasie eine Ratte. Legen Sie das Tier mit dem Bauch nach oben. Machen Sie einen ersten Schnitt mit einer chirurgischen Klinge zwischen den Zehen in Richtung der Hintergliedmaße. HINWEIS: In diesem Fall wurde eine intraperitoneale Injektion von 90:10 mg/Kg Ketamin:Xylazin verabreicht, um die Ratte einzuschläfern, aber auch andere Anästhesieoptionen sind erlaubt.</li>
		<li>Ziehen Sie die Haut ab und ziehen Sie sie nach oben, bis das Rattenknie freigelegt ist.</li>
		<li>Um die EDL zu finden, folgen Sie den Fußsehnen bis zum Ringband. Dieses Band umkreist zwei Sehnen. Schneiden Sie das Band zwischen den beiden Sehnen mit einer Unibandschere (oder ähnlichem) ab. Identifizieren Sie die EDL-Sehne, indem Sie beide anheben und wählen Sie diejenige, die die Zehen nach oben bewegt.</li>
		<li>Schneiden Sie die Sehne mit einer Uniband-Schere ab. Dann, während Sie die Sehne mit einer feinen biologischen Pinzette halten, beginnen Sie, den EDL-Muskel langsam vom Tibialis anterior, dem Peroneus brevis und dem Peroneus longus40 zu trennen (siehe Abbildung 1A). HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der Muskel ohne Schäden getrennt ist. Tun Sie dies, indem Sie den Rest der seitlichen Muskeln schneiden, um einen Weg zwischen ihnen zu öffnen (die EDL hat keine oberflächliche Position), während Sie den EDL-Muskel halten und anheben.</li>
		<li>Um den Muskel vollständig zu isolieren, schneiden Sie die am Rattenknie befestigte Sehne mit einer Uniband-Schere ab.</li>
		<li>Tauchen Sie den sezierten Muskel in 5 ml 0,5% PFA und lassen Sie ihn 24 h bei 4 °C ein. Optional heften Sie den Muskel in ein Stück Pappe und drehen ihn mit dem Muskel nach unten. Dann tauchen Sie es vollständig in 8 ml der fixativen Lösung. Dieser Schritt hilft, den Muskel während des Fixierungsprozesses zu dehnung zu erhalten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Isolierung des Soleus (langsam zuckender Muskel)
	<ol>
<li>Drehen Sie das Tier um (der Bauch ist jetzt nach unten gerichtet). Schneiden Sie durch die Haut die Kalkanealsehne mit einer chirurgischen Klinge.</li>
		<li>Mit Hilfe der biologischen Pinzette und der Unibandschere trennen Sie den Musculus gastrocnemius von den Knochen und erzeugen einen "muskelösen Deckel". Der Soleus befindet sich auf der Innenseite des muskulösen Lids. Es kann identifiziert werden, weil es rot ist und eine flache Morphologie hat.</li>
		<li>Mit einer biologischen Pinzette erreichen und heben Sie die Soleussehne an, die über dem Gastrocnemius liegt (siehe Abbildung 1B).</li>
		<li>Schneiden Sie die Sehne mit einer Uniband-Schere ab. Heben Sie den gesamten Muskel an, während Sie einige der schwachen Befestigungspunkte (z. B. neurovaskuläre Elemente) schneiden. Um den Soleusmuskel vollständig zu befreien, schneiden Sie schließlich den Soleusfaszikel, der die Kalkanealsehne bildet, mit einer Unibandschere ab.</li>
		<li>Wiederholen Sie Schritt 1.1.6, um den sezierten Soleusmuskel zu reparieren.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Teefaserzubereitung (Tag 2)
<ol><li>Nach 24 h Fixierung spülen Sie die Muskeln mit 6 ml DPBS-Lösung 3x für jeweils 10 minuten, bevor Sie die Muskelfasern isolieren.</li>
	<li>Um die Fasern zu isolieren, legen Sie einen Muskel auf einen Objektträger. Halten Sie mit einem Stereomikroskop eine der Sehnen vorsichtig mit einer biologischen Pinzette. Dann, mit der anderen biologischen Pinzette, beginnen Sie, die Sehne langsam zu kneifen, um die Muskelfasern zu trennen. Danach ziehen Sie das eingeklemmte Gewebe langsam nach oben in Richtung der gegenüberliegenden Muskelsehne. Es ist notwendig, diese Aktion mehrmals zu wiederholen, bis mehrere kleine, isolierte Bündel erhalten werden.</li>
	<li>Legen Sie sie vorsichtig auf einen vorbehandelten Objektträger (silanisiert). Es ist notwendig, alle Fasern in Ordnung zu halten, damit sie sich nicht überlappen. An dieser Stelle trocknen Sie die Fasern 24 Stunden an der Luft.</li>
</ol>3. Immunfluoreszenz
<ol><li>
Primäre Antikörperinkubation (Tag 3) HINWEIS: Alle Schritte wurden bei Raumtemperatur durchgeführt, sofern nicht anders angegeben. Der effizienteste Weg, die verschiedenen Lösungen zu entfernen, ohne Fasern vom Objektträger zu lösen, ist die Verwendung einer Insulinspritze.<ol>
<li>Um den Immunfärbungsprozess zu starten, umschließen Sie die getrockneten isolierten Muskelfasern mit einem Pap-Pen, um eine wasserdichte Barriere zu schaffen.</li>
		<li>Um die Muskelfasern zu hydratisieren, fügen Sie 200 μL destilliertes Wasser für 5 minuten hinzu und ändern Sie dann das Wasser auf 200 μL DPBS für die nächste 5-minütige Inkubation. Beginnen Sie an dieser Stelle mit der Immunfluoreszenzmarkierung.</li>
		<li>Inkubieren Sie Fasern mit 300 μL eines Blockierpuffers (BB), der 50 mM Glycin, 1% BSA und 1% Triton X-100 enthält, für 30 min.</li>
		<li>Ersetzen Sie BB durch den primären Antikörper in einer vom Hersteller empfohlenen Konzentration. Verwenden Sie das BB, um den Antikörper zu verdünnen. Dieses Experiment verwendete 400 μL SMI 32 oder SMI 31, die nicht phosphoryliertes (Nf) oder phosphoryliertes (Phos-Nf) Neurofilament H bei 1/800 Verdünnung erkannten, um die präsynaptische NMJ-Komponente nachzuweisen. HINWEIS: Wenn Sie sich entscheiden, das gesamte präsynaptische Element zu erkennen, anstatt die Neurofilament-Phosphorylierung zu bewerten, wählen Sie Antikörper gegen Synapsin, Synaptophysin oder SV2a, die zuvor erfolgreich eingesetzt wurden.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Fasern mit der primären Antikörperverdünnung bei 4 °C über Nacht (optional kann die Inkubation bei 37 °C für 1 h durchgeführt werden). In beiden Fällen ist es wichtig, die Inkubation mit einer feuchten Kammer durchzuführen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Immunfluoreszenz: Sekundäre Antikörperinkubation (Tag 4)
	<ol>
<li>Entfernen Sie den primären Antikörper und spülen Sie die Fasern 3x für jeweils 10 min mit 500 μL DPBS und das letzte Mal mit BB.</li>
		<li>Entfernen Sie diese letzte Wäsche und fügen Sie den fluoreszierend markierten sekundären Antikörper hinzu, der in BB verdünnt ist. Für dieses Experiment wurden 500 μL Ziegen-Anti-Maus Alexa Fluor 488 bei 1/1000 Verdünnung in BB verwendet. Um das postsynaptische Element der NMJs zu sehen, wurde der sekundären Antikörperverdünnung 1:300 α-Bungarotoxin (Btx) Biotin-XX-Konjugat zugesetzt. HINWEIS: Die Zugabe von Btx-Biotin XX ermöglicht bessere Signal-Rausch-Bilder, sobald sie mit Streptavidin erkannt wurden, das das Signal verstärkt. Darüber hinaus erhöhte die Streptavidin-Konjugation mit verschiedenen Fluorophoren die Farbkombinationen in Co-Labeling-Assays. Alternativ ermöglicht fluoreszierend markiertes Btx die Gewinnung von Bildern ähnlicher Qualität.</li>
		<li>Inkubieren Sie den sekundären Antikörper und das Btx für 2 h bei Raumtemperatur oder 1 h bei 37 °C lichtgeschützt.</li>
		<li>Entfernen Sie den sekundären Antikörper und das Btx. Waschen Sie 3x für jeweils 10 min mit 500 μL DPBS und spülen Sie das letzte Mal mit BB.</li>
		<li>Mit 500 μL Streptavidin Alexa Fluor 555 bei 1/1000 Verdünnung mit BB für 1 h bei Raumtemperatur inkubieren. An dieser Stelle fügen Sie, falls gewünscht, eine Sonde hinzu, um die Kerne wie Diaminophenylindol in einer Endkonzentration von 1 μg / ml zu verunreinigt.</li>
		<li>Entfernen Sie die Inkubationslösung und waschen Sie die Fasern 3x für jeweils 10 min mit 500 μL DPBS. Montieren Sie dann die Fasern.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Montage
	<ol>
<li>Legen Sie 4 Punkte transparenten Nagellacks auf den Objektträger, als wären sie die Eckpunkte eines Quadrats. 1-2 min trocknen lassen. Dies sind die Punkte, an denen die Coverlips ruhen und helfen, Gewebezerkleinerung zu vermeiden.</li>
		<li>Entfernen Sie die letzte DPBS-Wäsche und fügen Sie genügend Montagemedien (~ 200 μL) hinzu, um die Fasern abzudecken. Vermeiden Sie das Trocknen. HINWEIS: Um 10 ml des Montagemedienmixes vorzubereiten, verwenden Sie Tris-HCl 1,5 M pH 8,8: Glycerin in einem 4:1 (v:v).</li>
		<li>Verwenden Sie eine 200 μL Pipettenspitze, um die Montagemedien vorsichtig über die Fasern zu verteilen, um ein vollständiges Eintauchen aller Fasern zu gewährleisten. Bevor Sie das Deckglas einsetzen, entfernen Sie luftblasen.</li>
		<li>Legen Sie den Abdeckel auf die Proben, um die Erzeugung von Luftblasen zu verhindern. Diese Bewegung kann mit Hilfe einer Zette erfolgen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Mikroskopie und morphometrische Analyse
<ol><li>Stellen Sie sich die gehänselten Faserpräparate mit der konfokalen Lasermikroskopie ab.</li>
	<li>Nehmen Sie eine Reihe von optischen Abschnitten (30 μm Z-Stacks) über die gesamte Synapse in einem Intervall von einem Mikrometer. Um den Stack einzustellen, verwenden Sie das Btx-Signal. Stellen Sie mindestens 15-20 NMJs für jede Muskelerkrankung mit einer Auflösung von 2048 px x 2048 px ab. Diese Methode wurde gewählt, um Bilder mit ausreichender optischer Qualität und Auflösung für die morphometrische Analyse zu erhalten.</li>
	<li>Um die Messungen durchzuführen, verwenden Sie die Projektionsbilder von Stapeln mit einer beliebigen Analysesoftware. HINWEIS: Obwohl die erläuterte morphometrische Analyse manuell durchgeführt wurde, gibt es zwei kürzlich entwickelte Image J-basierte Werkzeuge zur Untersuchung vieler verschiedener Aspekte der prä- und postsynaptischen NMJ-Morphologie33,34.</li>
	<li>Um die NMJ-Gesamtbereichswerte zu erhalten, wählen Sie mit dem Photoshop-Magnet-Lasso-Werkzeug den außene Rahmen (externer Umriss des gefärbten Bereichs, siehe Abbildung 2)der Endplatte aus und bestimmen Sie die Anzahl der ausgewählten Pixel im Histogrammfenster. Anschließend können die Pixelflächen mit der von der konfokalen Software vorgegebenen Skala in Quadratmikrometer umgewandelt werden.</li>
	<li>Wählen Sie mit demselben Lasso-Werkzeug den innenliegenden Rahmen aus (Umrisse des gefärbten Bereichs innerhalb der Endplatte, siehe Abbildung 2) und bestimmen Sie den nicht gefärbten Bereich in der gesamten Struktur (oder leeren Bereich) wie oben beschrieben (Schritt 4.4.). Die werte für die postsynaptische Fläche erhalten Sie, nachdem die Gesamtfläche von der leeren Fläche jedes NMJ subtrahiert wurde.</li>
	<li>Erhalten Sie den präsynaptischen Bereich, der als der Bereich mit Anti-Neurofilament-Immunfluoreszenz definiert ist, auf ähnliche Weise wie den Gesamten NMJ-Bereich. HINWEIS: Alle diese Parameter wurden verwendet, um den Postsynaptischen Dichteindex (Postsynaptic Area/Total Area) und die NMJ Coverage (Presynaptic Area/Postsynaptic Area) zu bestimmen. Ein höherer postsynaptischer Dichteindex impliziert eine dichtere oder kompaktere Endplatte, während eine kleinere NMJ-Abdeckung eine viel schlechtere Interaktion zwischen Nerventerminal und Endplatte widerspiegelt (beide kompatibel mit einem Denervierungsprozess). Im hier gezeigten Fall wurden, da phosphorylierte und nicht phosphorylierte Formen von Neurofilamenten auf Nerventerminalebene nachgewiesen wurden, das phosphorylierte/nicht phosphorylierte präsynaptische Signalverhältnis und das phosphorylierte/nicht phosphorylierte Deckungsverhältnis berechnet.</li>
</ol>

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Die Autoren haben nichts preiszugeben.

In diesem Artikel stellen wir ein detailliertes Protokoll für die Dissektion von zwei Rattenskeletten (eine langsame Zuckung und die andere schnell zucken), die Fasermuskelisolation und die Immunfluoreszenzdetektion von prä- und postsynaptischen Markern vor, um NMJ-Veränderungen sowie Montage- / Demontageprozesse quantitativ zu bewerten. Diese Art von Protokoll kann in den Nagetiermodellen41,42 nützlichsein,um NMJ während physiologischer oder pathologischer Proze...

Die neuromuskuläre Säugetierverbindung (NMJ) ist eine große cholinerge dreigliedrige Synapse, die aus dem Nervenende des Motoneurons, der postsynaptischen Membran auf der Skelettmuskelfaser und den terminalen Schwannzellen1,2,3besteht. Diese Synapse weist eine hohe morphologische und funktionellePlastizität auf 4,5,6,7,8, auch im Erwachsenenalter, wenn NMJs dynamische strukturelle Veränderungen erfahren können. So haben einige Forscher gezeigt, dass motorische Nervenenden im Mikrometermaßstab9kontinuierlich ihre Form verändern. Es wurde auch berichtet, dass die Morphologie des NMJ auf funktionelle Anforderungen, veränderte Verwendung, Alterung, Bewegung oder Variationen der Bewegungsaktivität reagiert4,10,11,12,13,14,15. So stellen Training und mangelnde Verwendung einen wesentlichen Anreiz dar, um einige Eigenschaften des NMJ zu modifizieren, wie seine Größe, Länge, Dispersion von synaptischen Vesikeln und Rezeptoren sowie Nerventerminalverzweigungen14,16,17,18,19,20.
Darüber hinaus wurde gezeigt, dass jede strukturelle Veränderung oder Degeneration dieser lebenswichtigen Verbindung zum Tod von Motoneuronzellen und Muskelatrophie führen kann21. Es wird auch angenommen, dass eine veränderte Kommunikation zwischen Nerven und Muskeln für die physiologischen altersbedingten NMJ-Veränderungen und möglicherweise für ihre Zerstörung in pathologischen Zuständen verantwortlich sein könnte. Der Abbau neuromuskulärer Verbindungen spielt eine entscheidende Rolle beim Auftreten der Amyotrophen Lateralsklerose (ALS), einer neurodegenerativen Erkrankung, die eines der besten Beispiele für ein gestörtes Muskel-Nerven-Zusammenspiel darstellt3. Trotz der zahlreichen Studien, die zur Dysfunktion von Motoneuronen durchgeführt wurden, wird immer noch diskutiert, ob die bei ALS beobachtete Verschlechterung aufgrund der direkten Schädigung des Motoneurons auftritt und sich dann auf die kortiko-spinalen Projektionen erstreckt22; oder wenn es als distale Axonopathie betrachtet werden sollte, bei der die Degeneration in den Nervenenden beginnt und in Richtung des Motoneurons Somas23,24fortschreitet. Angesichts der Komplexität der ALS-Pathologie ist es logisch zu berücksichtigen, dass eine Mischung unabhängiger Prozesse auftritt. Da NMJ der zentrale Akteur des physiopathologischen Zusammenspiels zwischen Muskel und Nerv ist, stellt seine Destabilisierung einen dreh- und angelpunktlichen Entstehungspunkt der zu analysierenden Erkrankung dar.
Das neuromuskuläre System von Säugetieren ist funktionell in diskrete motorische Einheiten organisiert, die aus einem Motoneuron und den Muskelfasern bestehen, die ausschließlich von seinem Nerventerminal innerviert werden. Jede Motoreinheit hat Fasern mit ähnlichen oder identischen strukturellen und funktionalen Eigenschaften25. Die selektive Rekrutierung von Motoneuronen ermöglicht die Optimierung der Muskelreaktion auf funktionelle Anforderungen. Jetzt ist klar, dass die Skelettmuskulatur von Säugetieren aus vier verschiedenen Fasertypen besteht. Einige Muskeln werden nach den Eigenschaften ihres häufigsten Fasertyps benannt. Zum Beispiel trägt der Soleus (ein hinterer Muskel der Hintergliedmaße, der an der Aufrechterhaltung der Körperhaltung beteiligt ist) einen Großteil der langsam zuckenden Einheiten (Typ 1) und wird als langsamer Muskel erkannt. Stattdessen besteht Extensor digitorum longus (EDL) im Wesentlichen aus Einheiten mit ähnlichen schnell zuckenden Eigenschaften (Typ 2-Fasern) und ist als schneller Muskel bekannt, der auf phasische Bewegungen spezialisiert ist, die für die Fortbewegung benötigt werden. Mit anderen Worten, obwohl erwachsene Muskeln aufgrund der hormonellen und neuronalen Einflüsse plastischer Natur sind, bestimmt ihre Faserzusammensetzung die Fähigkeit, verschiedene Aktivitäten auszuführen, wie bei Soleus, der kontinuierliche Aktivität mit geringer Intensität erfährt, und EDL, die ein schnelleres einzelnes Zucken aufweist. Andere Merkmale, die zwischen verschiedenen Arten von Muskelfasern variabel sind, hängen mit ihrer Struktur zusammen (mitochondrialer Gehalt, Erweiterung des sarkoplasmatischen Retikulums, Dicke der Z-Linie), Myosin-ATPase-Gehalt und Myosin-Schwerkettenzusammensetzung26,27,28,29.
Bei Nagetier-NMJs gibt es signifikante Unterschiede zwischen den Muskeln28,29. Morphometrische Analysen, die an Soleus und EDL von Ratten durchgeführt wurden, zeigten eine positive Korrelation zwischen der synaptischen Fläche und dem Faserdurchmesser (dh der synaptische Bereich in soleus langsamen Fasern ist größer als in EDL schnellen Fasern), aber das Verhältnis zwischen NMJ-Fläche und Fasergröße ist in beiden Muskeln ähnlich30,31. Auch in Bezug auf die Nerventerminals waren die absoluten Endplattenbereiche in Typ-1-Fasern niedriger als in Typ-2-Fasern, während die Normalisierung durch Faserdurchmesser Bereiche von Nerventerminals in Typ-1-Fasern zu den größten32machte.
Nur sehr wenige Studien konzentrieren sich jedoch auf morphometrische Analysen, um den Nachweis von Veränderungen in einigen der NMJ-Komponenten33,34zu zeigen. Aufgrund der Relevanz des NMJ für die Funktion des Organismus, dessen Morphologie und Physiologie in verschiedenen Pathologien verändert sind, ist es daher wichtig, die Dissektionsprotokolle verschiedener Muskeltypen mit ausreichender Qualität zu optimieren, um die Visualisierung der gesamten NMJ-Struktur zu ermöglichen. Es ist auch notwendig, das Auftreten von prä- oder postsynaptischen Veränderungen in verschiedenen experimentellen Situationen oder Bedingungen wie Alterung oder Übung zu bewerten35,36,37,38. Darüber hinaus kann es hilfreich sein, subtilere Veränderungen in NMJ-Komponenten wie eine veränderte Neurofilament-Phosphorylierung in den terminalen Nervenenden nachzuweisen, wie in ALS39berichtet.

<table><tbody><tr><td>Stereomikroskop mit Cool-Light-Beleuchtung</td><td>Nikon</td><td>SMZ-10A</td><td></td></tr><tr><td>Schaukelplattform</td><td>Biometra (WT 16)</td><td>042-500</td><td></td></tr><tr><td>Deckgläser (24 x 32 mm)</td><td>Deltalab</td><td>D102432</td><td></td></tr><tr><td>Premium (Plus) Objektträger</td><td>PORLAB</td><td>PC-201-16</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>F.S.T</td><td>11253-20</td><td></td></tr><tr><td>Uniband LA-4C Schere 125mm</td><td>E.M.S</td><td>77910-26</td><td></td></tr><tr><td>Einweg-OP-Klingen #10</td><td>Sakira Medical</td><td>1567</td><td></td></tr><tr><td>sterile Einwegspritze (1 ml)</td><td>Sakira Medical</td><td>1569</td><td></td></tr><tr><td>Super PAP Pen</td><td>E.M.S</td><td>71310</td><td></td></tr><tr><td>100 &mu; l oder 200 &mu; l Pipette</td><td>Finnpipette</td><td>9400130</td><td></td></tr><tr><td>Konfokalmikroskop</td><td>Zeiss</td><td>LSM 800 - AiryScan</td><td></td></tr><tr><td>NTac:SD-TgN(SOD1G93A)L26H Ratten</td><td>Taconic</td><td>2148-M</td><td></td></tr><tr><td>1X PBS (Dulbecco)</td><td>Gibco</td><td>21600-010</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Glycin</td><td>Amresco</td><td>167</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Bio Basic INC.</td><td>9048-46-8</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Mallinckrodt</td><td>5092</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Amresco</td><td>497</td><td></td></tr><tr><td>Gereinigtes Anti-Neurofilament H (NF-H), Phosphorylierter Antikörper</td><td>BioLegend</td><td>801601</td><td>Früher Covance # SMI 31P</td></tr><tr><td>Gereinigtes Anti-Neurofilament H (NF-H), Nichtphosphorylierter Antikörper</td><td>BioLegend</td><td>801701</td><td>Früher Covance # SMI-32P</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Anti-Maus-IgG (H+L)</td><td>Thermo Scientific</td><td>A11029</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-Bungarotoxin, Biotin-XX-Konjugat</td><td>Invitrogen</td><td>B1196</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin, Alexa Fluor 555 Konjugat</td><td>Invitrogen</td><td>S32355</td><td></td></tr><tr><td>Diaminophenylindol (DAPI)</td><td>Sigma</td><td>D8417</td><td></td></tr></tbody></table>

dissektion einzelner skelettmuskelfasern für immunfluoreszierende und morphometrische analysen von neuromuskulären verbindungen am ganzen berg

Dissection of Single Skeletal Muscle Fibers for Immunofluorescent and Morphometric Analyses of Whole-Mount Neuromuscular Junctions

Die neuromuskuläre Verbindung (NMJ) ist ein spezialisierter Kontaktpunkt zwischen dem motorischen Nerv und der Skelettmuskulatur. Diese periphere Synapse weist eine hohe morphologische und funktionelle Plastizität auf. Bei zahlreichen Erkrankungen des Nervensystems ist NMJ ein frühes pathologisches Ziel, das zu Neurotransmissionsversagen, Schwäche, Atrophie und sogar zum Muskelfasertod führt. Aufgrund seiner Relevanz kann die Möglichkeit, bestimmte Aspekte der Beziehung zwischen NMJ-Komponenten quantitativ zu bewerten, dazu beitragen, die mit ihrer Montage / Demontage verbundenen Prozesse zu verstehen. Das erste Hindernis bei der Arbeit mit Muskeln besteht darin, das technische Know-how zu erwerben, um ihre Fasern schnell zu identifizieren und zu sezieren, ohne sie zu beschädigen. Die zweite Herausforderung besteht darin, qualitativ hochwertige Nachweismethoden zu verwenden, um NMJ-Bilder zu erhalten, die für quantitative Analysen verwendet werden können. Dieser Artikel stellt ein Schritt-für-Schritt-Protokoll zum Sezieren von Extensor digitorum longus und Soleusmuskeln von Ratten vor. Es erklärt auch die Verwendung von Immunfluoreszenz zur Visualisierung prä- und postsynaptischer Elemente von Ganz-Mount-NMJs. Die erzielten Ergebnisse zeigen, dass diese Technik verwendet werden kann, um die mikroskopische Anatomie der Synapse zu bestimmen und subtile Veränderungen im Status einiger ihrer Komponenten unter physiologischen oder pathologischen Bedingungen zu identifizieren.

Dieses Protokoll bietet eine einfache Methode, um Muskelfasern aus zwei verschiedenen Arten von Muskeln (schnell und langsam zuckende Muskeln, siehe Abbildung 1)zu isolieren und zu immunanimieren. Mit den richtigen Markern und / oder Sonden können NMJ-Komponenten aus quantitativer Sicht detektiert und bewertet werden, um einige der morphologischen Veränderungen zu beurteilen, die als Folge eines Krankheitsverlaufs oder einer spezifischen medikamentösen Behandlung auftreten können. In der vor...

Die Fähigkeit, neuromuskuläre Verbindungskomponenten genau zu erkennen, ist entscheidend für die Bewertung von Modifikationen in ihrer Architektur aufgrund pathologischer oder Entwicklungsprozesse. Hier präsentieren wir eine vollständige Beschreibung einer einfachen Methode, um qualitativ hochwertige Bilder von neuromuskulären Verbindungen ganzer Mounts zu erhalten, die für quantitative Messungen verwendet werden können.

Dissektion einzelner Skelettmuskelfasern für immunfluoreszierende und morphometrische Analysen von neuromuskulären Verbindungen am ganzen Berg

The neuromuscular junction (NMJ) is a specialized point of contact between the motor nerve and the skeletal muscle. This peripheral synapse exhibits high ...

Dissektion einzelner Skelettmuskelfasern für immunfluoreszierende und morphometrische Analysen von neuromuskulären Übergängen im ganzen Mount. Dieses Video zeigt ein Protokoll, um EDL- und Soleusmuskeln mit einem wiederholbaren Ansatz effektiv und sicher zu sezieren. In diesem Video wird auch gezeigt, wie man neuromuskuläre Übergänge mit ganzer Montierung erhält, mit dem Ziel, synaptische Komponenten mit 3D-Integrität zu erkennen, um eine genaue morphometrische Analyse zu ermöglichen.Um die Muskeln zu sezieren, werden diese chirurgischen Instrumente benötigt. Um den Eingriff zu starten, legen Sie das Tier mit dem Bauch nach oben. Machen Sie einen ersten Schnitt mit einer chirurgischen Klinge zwischen den Zehen in Richtung der Hintergliedmaßen.Ziehen Sie die Haut ab und ziehen Sie nach oben, bis das rechte Knie freigelegt ist. Um die EDL zu finden, folgen Sie den Fußsehnen bis zum Ringband. Dieses Band umkreist zwei Sehnen.Schneiden Sie das Band mit der Uniband-Schere zwischen den beiden Sehnen ab. Identifizieren Sie die EDL-Sehne, indem Sie beide anheben und sehen, welche die Zehen nach oben bewegt. Schneiden Sie die Sehne mit einer Schere ab.Während Sie die Sehne mit einer biologischen Pinzette halten, beginnen Sie, den EDL-Muskel langsam von den anderen Hintergliedmuskeln zu trennen. Die Trennung des Muskels, ohne Schaden zu verursachen, kann durch verschiedene Schnitte am Rest der seitlichen Muskeln erfolgen, um einen Weg zwischen ihnen zu öffnen, während der Muskel aus dem Spaltenabschnitt der EDL-Sehne gehalten und angehoben wird. Um den Muskel vollständig zu isolieren, schneiden Sie die Sehne, die am Rattenknie befestigt ist, mit einer Uniband-Schere ab.Tauchen Sie den sezierten Muskel in die Fixierlösung und lassen Sie ihn 24 Stunden bei vier Grad Celsius ein. Im Allgemeinen ist es nützlich, einen länglichen Muskel zu haben. Verwenden Sie dazu Pappe und Klammern, um den Muskel zur Fixierung zu befestigen.Um den Soleusmuskel zu isolieren, drehen Sie das Tier um. Schneiden Sie durch die Haut die Kalkanealsehne mit einer chirurgischen Klinge. Mit Hilfe der biologischen Pinzette und der Uniband-Schere trennen Sie den Musculus gastrocnemius von den Knochen und erzeugen einen muskulösen Deckel.Der Soleus befindet sich auf der Innenseite des muskulösen Lids. Es kann identifiziert werden, weil es rot und flach ist. Mit einer biologischen Pinzette erreichen und heben Sie die Soleussehne an, die über dem Gastrocnemius liegt.Schneiden Sie die Sehne mit einer Uniband-Schere ab. Heben Sie den gesamten Muskel an, während Sie einige der schwachen Befestigungspunkte schneiden. Um den Soleusmuskel vollständig zu befreien, schneiden Sie schließlich das Soleus-Vesikel ab, das die Kalkanealsehne bildet.Wiederholen Sie den Fixierungsschritt wie mit dem EDL-Muskel. Um diese Methode zu verwenden, ist es wichtig, die Klammern an den Sehnen und nicht am Muskel zu befestige. Sobald die 24-Stunden-Fixierungszeit abgelaufen ist, spülen Sie die Muskeln in DPBS-Lösung, bevor Sie mit der Isolierung der Muskelfasern beginnen.Um die Fasern zu isolieren, halten Sie vorsichtig eine der Sehnen mit einer biologischen Pinzette. Dann mit dem anderen Paar biologischer Pinzetten beginnen, die Sehne langsam zu kneifen, um die Muskelfasern zu trennen. Um die Fasern zu isolieren, ziehen Sie langsam nach oben in Richtung der gegenüberliegenden Muskelsehne.Es ist notwendig, diese Aktion mehrmals zu wiederholen, bis mehrere, kleine, isolierte Bündel erhalten werden. Nach dem Trennen in kleine isolierte Bündel legen Sie sie vorsichtig in einen vorbehandelten silanisierten Objektträger. Es ist notwendig, alle Fasern geordnet zu halten, damit sie sich nicht überlappen.An diesem Punkt können die Fasern 24 Stunden an der Luft getrocknet werden. Beginnen Sie nach 24 Stunden mit der Immunfärbung. Um eine wasserdichte Barriere zu schaffen, verwenden Sie einen PAP-Stift, um die isolierten Muskelfasern im vorbehandelten Objektträger einzukreisen.Dies ist ein Beispiel für ein hochauflösendes konfokales Bild, das nach dem hier beschriebenen Protokoll erhalten werden kann. Oben links ist das postsynaptische Element und oben rechts das präsynaptische Element dargestellt, während die unteren Bilder die synaptischen Komponenten schematisiert zeigen, um die Parameter zu veranschaulichen, die für die morphometrische Analyse verwendet werden. Die zweite Folie zeigt die Verschmelzung der prä- und postsynaptischen Signale mit dem Kernfleck der API.Unterschiede zwischen den neuromuskulären Verbindungen von transgenen Tieren und nicht-transgenen Tieren sind deutlich sichtbar. Die morphometrische Analyse neuromuskulärer Verbindungen zeigt Hinweise auf das postsynaptische Signal bei transgenen Tieren und scheint kompakter zu sein, hauptsächlich aufgrund der reduzierten neuromuskulären Verbindungsfläche. Wie hier gezeigt, ist der neuromuskuläre Verbindungs-präsynaptischen Bereich des transgenen Tieres reduziert.Am kleinsten nachgewiesen wurde derjenige, der mit einem antiphosphorylierten Neurofilamentsignal gefunden wurde, wie zum Beispiel in Bild B gezeigt. Das letzte Bild zeigt die Ergebnisse in Bezug auf den Status von neuromuskulären Verbindungen im ganzen Mount. Anhand des Coverage-Index wurde festgestellt, dass die transgenen neuromuskulären Verbindungen teilweise denervated waren.Es könnte auch festgestellt werden, dass die Abdeckung und der Nexus des phosphorylierten Neurofilaments niedriger ist als beim Nachweis eines nicht phosphorylierten Neurofilaments. Das vorgeschlagene Protokoll ermöglicht es, hochwertige neuromuskuläre Verbindungspräparate aus langsamen und schnellen Muskelfasern zu erhalten. Prä- und postsynaptische neuromuskuläre Verbindungskomponenten wurden durch spezifische Sonden oder Antikörper identifiziert und dann in konfokaler oder hochauflösender konfokaler Mikroskopie abgebildet, was eine morphometrische Analyse auf mikrometrischer Skala ermöglichte.

dissection-single-skeletal-muscle-fibers-for-immunofluorescent

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Dissection und Imaging von aktiven Zonen in der Drosophila Neuromuskulären Synapse

Sichtbarmachen einzelner Zellen in dicht gepackten Geweben wie terminalen Schwann-Zellen (SCs) an neuromuskulären Endplatten (NMJs), ist eine Herausforderung. "Sequential Fotobleichen" ermöglicht die Abgrenzung einzigen Terminal SCs, zum Beispiel in der triangularis sterni Muskel Explantat, eine bequeme Nerv-Muskel-Präparat, wo sequenzielles Bleichen mit Zeitraffer-Aufnahmen kombiniert werden können...

Sequential Photo-Bleiche zur Einzel-Schwann-Zellen an der neuromuskulären Synapse Delineate

Quelle: Marinello, M., et al. Charakterisierung neuromuskulärer Verbindungen bei Mäusen durch kombinierte konfokale und superauflösende Mikroskopie. J. Vis. Exp. (2021)Dieses Video zeigt die Präparation, Immunfärbung und Bildgebung von neuromuskulären Verbindungen im Muskelgewebe von Ratten mit konfokaler und superauflösender Mikroskopie zur Visualisierung und Analyse präsynaptischer und postsynaptischer Strukturen.

Charakterisierung neuromuskulärer Verbindungen in Mäusen durch kombinierte konfokale und superauflösende Mikroskopie

In diesem Video zeigen wir ein Protokoll zur Zerlegung des Transversus-Abdominis-Muskels der Maus und verwenden Immunfluoreszenz und Mikroskopie, um neuromuskuläre Knoten zu visualisieren.

Zerlegung des Transversus Abdominis Muskels für die neuromuskuläre Junction-Analyse

Die neuromuskuläre Verbindung (NMJ) ist in einer Vielzahl von Zuständen verändert, die manchmal in einem synaptischen Versagen gipfeln können. In diesem Bericht werden fluoreszenzmikroskopische Methoden zur Quantifizierung solcher Strukturveränderungen beschrieben.

Der neuromuskulären Synapse: Mess Synapse Größe, Fragmentierung und Veränderungen der synaptischen Protein Dichte Mit der konfokalen Fluoreszenzmikroskopie

Wir beschreiben eine neuartige experimentelle Technik, die nennen wir Minimal Invasive Muskel einbetten (MIME), basiert auf dem Beweis Skelettmuskelgewebe lebensfähige myogen Zellen enthält, die Spender-Zell-vermittelten Myogenesis bei implantiert erleichtern können Ein Host-Muskel.

Minimal-Invasive Muskel einbetten (MIME) - eine neuartige experimentelle Technik, Spender-Zell-vermittelten Myogenesis zu erleichtern

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur morphometrischen Analyse neuromuskulärer Verbindungen durch kombinierte konfokale und STED-Mikroskopie, die zur Quantifizierung pathologischer Veränderungen in Mausmodellen von SMA und ColQ-bezogenen CMS verwendet wird.

Charakterisierung neuromuskulärer Verbindungen bei Mäusen mittels kombinierter konfokaler und hochauflösender Mikroskopie

Das Protokoll zeigt eine Methode zur Untersuchung der räumlichen Korrelation zwischen den präsynaptischen Terminals, postsynaptischen Rezeptoren und perisynaptischen Schwann-Zellen im medialen Gastrocnemius-Muskel der Ratte unter Verwendung der fluoreszierenden Immunhistochemie mit verschiedenen Biomarkern, nämlich Neurofilament 200, vesikulärem Acetylcholintransporter, Alpha-Bungarotoxin und S100.

Visualisierung der morphologischen Eigenschaften der neuromuskulären Verbindung im Musculus atralis guestrocnemius medialis der Ratte

Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Visualisierung der Mikrotubuli-Netzwerke in neuromuskulären Verbindungen und Muskelzellen vor. In Kombination mit den leistungsstarken genetischen Werkzeugen von Drosophila melanogaster erleichtert dieses Protokoll das genetische Screening und die Analyse der Mikrotubuli-Dynamik für die Rolle von Mikrotubuli-Netzwerk-regulatorischen Proteinen im Nervensystem erheblich.

Verwendung von neuromuskulären Verbindungen und Muskelzellen von Drosophila-Larven zur Visualisierung des Mikrotubuli-Netzwerks

Wir beschreiben ein Protokoll zur Gewinnung enzymatisch dissoziierter Fasern unterschiedlicher Länge und Art aus sechs Muskeln erwachsener Mäuse: drei davon bereits beschrieben (Flexor digitorum brevis, Extensor digitorum longus, soleus) und drei von ihnen erstmals erfolgreich dissoziiert (Extensor hallucis longus, Peroneus longus, Peroneus digiti quarti).

Intakte kurze, mittlere und lange Skelettmuskelfasern, die durch enzymatische Dissoziation von sechs Hintergliedmaßenmuskeln von Mäusen gewonnen wurden: Jenseits des Flexor Digitorum brevis

Lokale Injektionen einer mitochondrialen Farbstoffbeschriftung terminaler Schwann-Zellmitochondrien in vivo zur konfokalen Mikroskopie. Diese Methode nutzt einen Proof of Concept, der im Skelettgewebe von Mäusen mit gesunden oder kranken Muskeln demonstriert wurde, um eine hochauflösende mitochondriale Visualisierung zu ermöglichen.

Methoden zur In-situ-Quantifizierung der mitochondrialen Morphologie in Muskel- und terminalen Schwannzellen von Mäusen

Lernen Sie die Präparation einzelner Skelettmuskelfasern aus Ratten-EDL- und Soleus-Muskeln für immunfluoreszierende Analysen neuromuskulärer Verbindungen. Diese Methode ermöglicht hochauflösende morphometrische Untersuchungen prä- und postsynaptischer Strukturen.

Dissektion einzelner Skelettmuskelfasern für immunfluoreszierende und morphometrische Analysen von neuromuskulären Verbindungen am ganzen Berg (Video) | JoVE Journal

Dissektion einzelner Skelettmuskelfasern für immunfluoreszierende und morphometrische Analysen von neuromuskulären Verbindungen am ganzen Berg

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