Dichtegradienten-Ultrazentrifugation zur Untersuchung des endozytären Recyclings in Säugetierzellen
30. Juni 2021
Dieser Beitrag zielt darauf ab, ein Protokoll zur Herstellung von Recycling-Endosomen aus Säugetierzellen unter Verwendung der Saccharosedichtegradienten-Ultrazentrifugation vorzustellen.
Dieses Protokoll hilft bei der Isolierung der Recycling-Endosomen, die eine Fraktion aus transfizierten Säugetierzellen enthalten, um die Untersuchung des Proteintransports über den endozytären Handel zu erleichtern. Diese Technik ist einfach zu handhaben und sowohl auf Gewebe- als auch auf Zellproben anwendbar. Das Verfahren wird Miss Zhai Yu Qi, eine Doktorandin aus dem Labor von Dr. Lao, demonstrieren.
Um zu beginnen, Teller 2 mal 10 zu den 6 Zellen in einer 100 Millimeter Kulturschale. Am nächsten Tag transfizieren Sie die Zellen mit Lipofectamine gemäß den Anweisungen des Herstellers. Um die Zellen zu ernten, verwerfen Sie das Kulturmedium 48 Stunden nach der Transfektion und waschen Sie die Zellen zweimal mit eiskaltem PBS.
Dann fügen Sie einen Milliliter eiskaltes PBS, ergänzt mit einem 0,5-fachen Protease-Inhibitor-Cocktail in einem 0,5-fachen Phosphatase-Inhibitor-Cocktail, zu jedem Gericht hinzu. Als nächstes sammeln Sie die Zellen mit einem Zellschaber und übertragen sie die Zellsuspension in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. die Zellen durch Zentrifugation mit einem Schwenklöffelrotor.
Entsorgen Sie den Überstand und resuspenieren Sie das Zellpellet vorsichtig in fünf Milliliter Homogenisierungspuffer. Sammeln Sie die Zellen erneut durch Zentrifugation und resuspen Sie das Zellpellet in einem Milliliter Homogenisierungspuffer. Homogenisieren Sie die Zellen mit einem Dounce Homogenisator mit 15 bis 20 Schlägen.
Dann übertragen Sie das Homogonat auf ein zwei Milliliter Zentrifugationsrohr. Fügen Sie dem Homogonat 700 Mikroliter Homogenisierungspuffer hinzu. Dann das verdünnte Homogonat drehen und 1,5 Milliliter des Überstandes sammeln.
Drehen Sie den gesammelten Überstand erneut, sammeln Sie dann 1,4 Milliliter des Überstandes und kennzeichnen Sie ihn als postnuklearen Überstand. Um die Dichtegradientenkolonne vorzubereiten, werden 1,2 Milliliter des postnuklearen Überstands in ein Ultrazentrifugenrohr überführt. Dann fügen Sie einen Milliliter 62% Saccharoselösung in die Probe und mischen Sie gut durch sanftes Pipettieren.
Als nächstes werden vorsichtig 3,3 Milliliter 35% Saccharoselösung auf die Probe gegeben, gefolgt von 2,2 Millilitern 25% Saccharoselösung zusätzlich zu der 35% Saccharoselösung. Zum Schluss füllen Sie das Ultrazentrifugenröhrchen nach oben mit Homogenisierungspuffer. Zentrifugieren Sie die Dichtegradientensäule und sammeln Sie vorsichtig 12 Fraktionen von je 1 Milliliter, beginnend von der Oberseite des Gradienten.
Als nächstes verdünnen Sie alle Fraktionen mit einem Milliliter Verdünnungspuffer und zentrifugieren Sie die verdünnten Proben. Nach der Zentrifugation den Überstand absaugen und 50 Mikroliter 1X Probenpuffer hinzufügen, um die Fraktionen zu ernten. Der Recycling-Endosomenmarker Rab11 wurde in Fraktion sieben nachgewiesen.
Andere subzelluläre Marker, einschließlich Beta COP, COX IV, GAPDH, EEA1, Rab 7 und Lamp1, wurden ebenfalls untersucht. Ein positives EEA1-Signal wurde auch in Fraktion sieben nachgewiesen. Die gemessenen Bandenintensitäten von GAPDH, Cox IV und Rab11 sowohl in Fraktion sieben als auch im postnuklearen Überstand sind hier dargestellt.
Nach der Transektion von HEC293-Zellen mit ELMO1, ELMO1 ARF6Q67L oder ELMO1 ARF6Q67L FE65 wurden keine Veränderungen in der ELMO1-Verteilung mit ARF6Q67L- und FE65-Überexpression gefunden. Der ELMO1-Spiegel in Fraktion sieben wurde zwischen verschiedenen Transfektionen verglichen und nach Cotransfektion von ARF6Q67L erhöht befunden. Ein weiterer Anstieg wurde beobachtet, wenn sowohl ARF6Q67L als auch FE65 gemeinsam exprimiert wurden.
Umgekehrt verringerte das Ausschalten von FE65 die ARF6-vermittelte Elmo1-Anreicherung in Fraktion sieben. Die erhaltene Fraktion könnte für die anschließende Analyse verwendet werden. Zum Beispiel Western Blotting, um Proteinspiegeländerungen in der Fraktion zu visualisieren.
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Übersicht
Dieser Artikel stellt ein Protokoll zur Gewinnung von recycelnden Endosomen aus Säugerzellen mittels Ultrazentrifugation in einem Saccharosedichtegradienten vor. Diese Technik soll die Untersuchung des Proteintransports über endozytotische Wege erleichtern.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Zellbiologie
- Endozytose
- Proteintransport
Hintergrund
- Rezyklierende Endosomen spielen eine entscheidende Rolle beim zellulären Transport.
- Das Verständnis des Proteintransports ist entscheidend für Einblicke in verschiedene zelluläre Prozesse.
- Die Ultrazentrifugation ist eine weit verbreitete Technik zur Isolierung zellulärer Bestandteile.
- Dieses Protokoll ist sowohl auf Gewebe- als auch auf Zellproben anwendbar.
Zweck der Studie
- Eine zuverlässige Methode zur Isolierung von recycelnden Endosomen bereitstellen.
- Das Verständnis der Mechanismen des endozytotischen Transports verbessern.
- Zukünftige Forschung zur Proteindynamik in Zellen unterstützen.
Verwendete Methoden
- Transfektion von Säugerzellen mit Lipofectamin.
- Isolierung der Zellen 48 Stunden nach der Transfektion.
- Waschen der Zellen mit eiskalter PBS.
- Isolierung mittels Ultrazentrifugation in einem Saccharosedichtegradienten.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Isolierung von Recycling-Endosomen aus transfizierten Zellen.
- Demonstration des Protokolls durch einen Doktoranden.
- Erleichterung weiterer Untersuchungen zum Proteintrafficking.
- Bestätigung der Anwendbarkeit der Methode auf verschiedene Probenarten.
Schlussfolgerungen
- Das Protokoll bietet einen einfachen Ansatz zur Isolierung von recycelnden Endosomen.
- Es soll zum Verständnis des Proteintransports beitragen.
- Diese Methode kann in verschiedenen biologischen Forschungskontexten eingesetzt werden.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die Isolierung von Recycling-Endosomen ermöglicht die mechanistische Entschärfung von Zielstrukturen des endozytotischen Transports, indem quantitative Daten zur subzellulären Fraktionierung bereitgestellt werden. Dies unterstützt die Zielvalidierung und die Entwicklung von Assays für Proteine, die das Recycling von Membranproteinen regulieren, wie beispielsweise ARF6-Effektoren. Die Methode erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Identifizierung von Leitstrukturen, indem die Proteinlokalisierung mit funktionellen Recyclingwegen verknüpft wird.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Untersucht therapeutische Hypothesen zu Regulatoren des endozytotischen Recyclings wie ARF6 und ELMO1.
- Operativer Wert: Liefert Fraktionierungsdaten, um die proteingesteuerten Transportmechanismen in spezifischen Signalwegen zu klären.
- Wissenschaftlicher Wert: Unterstützt die biologische Risikominderung, indem die Zielinteraktion in Fraktionen von Recycling-Endosomen validiert wird.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Bereitet validierte Fraktionen, die Recycling-Endosomen enthalten, für nachgeschaltete Western-Blot-Analysen vor.
- Operativer Wert: Ermöglicht eine standardisierte und reproduzierbare Isolierung von Organellen zur quantitativen Proteinbestimmung.
- Wissenschaftlicher Wert: Erleichtert die Bereitschaft für Assays zur Untersuchung von Substanzen, die den endozytotischen Recycling-Prozess modulieren.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Verbindet Entdeckungsdaten zum Vesikeltransport mit präklinischen Modellen durch die Isolierung der Rab11-positiven Fraktion.
- Operativer Wert: Stellt die Kontinuität von der subzellulären Fraktionierung bis zur funktionellen Validierung in krankheitsrelevanten Systemen sicher.
- Wissenschaftlicher Wert: Unterstützt die risikoadjustierte Weiterentwicklung, indem die Lokalisation des Zielmoleküls in Recyclingwegen bestätigt wird.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode integriert sich in frühe Entdeckungsworkflows, indem sie subzelluläre Fraktionen isoliert, die zur Zielvalidierung und zur Identifizierung von Leitstrukturen beitragen.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung von Regulatoren des endozytotischen Recyclings mittels Fraktionierung und Markeranalyse.
- Screening: Ermöglicht die Entwicklung von Assays durch standardisierte Isolierung von Rab11-positiven Fraktionen zur Proteinquantifizierung.
- Analytik: Erzeugt quantitative Western-Blot-Signale aus Fraktionen, um die Proteinanreicherung unter verschiedenen Bedingungen zu vergleichen.
- Translationale Forschung: Verbindet Fraktionierungsdaten mit der präklinischen Kontinuität durch die Validierung der Isolierung von Recycling-Endosomen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Bietet eine wiederverwendbare Plattform für die subzelluläre Fraktionierung in mehreren Projekten zur Target-Validierung.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Target-Validierung, indem mechanistische Unklarheiten in Transportwegen verringert werden.
- Operativer Wert: Stellt die Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit der Isolierung von Organellen für eine konsistente nachgeschaltete Analyse sicher.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch durch Bereitstellung von Daten zur subzellulären Lokalisation für Targets des Rezyklierungswegs.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht die risikoadjustierte Priorisierung von Targets basierend auf Anreicherungsdaten aus Recycling-Endosomen.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in Zellkultur, Transfektion und Ultrazentrifugationstechniken.
- Setzt den Zugang zu Schwenkköpfen und Ultrazentrifugen für die Dichtegradientenseparation voraus.
- Erfordert die Standardisierung von Fraktionierungsprotokollen zwischen verschiedenen Arbeitsgruppen, um vergleichbare Rab11-Fraktionen zu isolieren.
- Erfordert die Anpassung von Markerpanelen (z. B. Rab11, EEA1) an verschiedene Zelltypen oder Transportwege.
- Ist durch den Bedarf an Validierungsmarkern zur Bestätigung der Reinheit der Fraktionen vor nachgeschalteten Anwendungen begrenzt.
Biopharma-Häufig gestellte Fragen
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:33
Mammalian Cell Culture, Transfection and Cell Harvest
2:07
Density Gradient Column Preparation
2:46
Fractionation and Recovery of Recycling Endosome-Containing Fraction
3:17
Results: Density Gradient Ultracentrifugation for Investigating Endocytic Recycling in Mammalian Cells
4:47
Conclusion
