Name: Dichtegradienten-Ultrazentrifugation zur Untersuchung des endozytären Recyclings in Säugetierzellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-30T13:15:00.000+00:00
Duration: 5 min 13 s
Description: Lernen Sie die Dichtegradienten-Ultrazentrifugation zur Isolierung von Recycling-Endosomen aus Säugetierzellen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung des endozytären Proteintransports in der Zellbiologie.

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Diese Arbeit wurde durch Mittel des Research Grants Council Hong Kong, des CUHK Direct Grant Scheme, des United College Endowment Fund und des TUYF Charitable Trust unterstützt. Die Zahlen in dieser Arbeit wurden aus unserer früheren Publikation "ARF6-Rac1 signaling-mediated neurite outgrowth is potentiated by the neuronal adaptor FE65 through orchestrating ARF6 and ELMO1" übernommen, die im Oktober 2020 im FASEB Journal veröffentlicht wurde.

1. Zellkultur und Transfektion von Säugetieren
<ol><li>Platte 2 x 106 Zellen in einer 100 mm Kulturschale. Verwenden Sie vier Gerichte für jede Transfektion. HINWEIS: Die Anzahl der benötigten Zellen kann für verschiedene Zelllinien variieren. Möglicherweise ist eine Optimierung erforderlich, bevor Sie mit dem Isolationsschritt fortfahren.</li>
	<li>Am nächsten Tag transfizieren Sie die Zellen mit Lipofektamin gemäß den Anweisungen des Herstellers.</li>
</ol>2. Zellernte
<ol><li>Entsorgen Sie das Kulturmedium 48 h nach der Transfektion.</li>
	<li>Waschen Sie die Zellen zweimal mit eiskaltem PBS (10 mM Natriumphosphate, 2,68 mM Kaliumchlorid, 140 mM Natriumchlorid).</li>
	<li>Fügen Sie 1 ml eiskaltes PBS+ (PBS ergänzt mit 0,5x Protease-Inhibitor-Cocktail und 0,5x Phosphatase-Inhibitor-Cocktail) zu jedem Gericht hinzu.</li>
	<li>Sammeln Sie die Zellen mit einem Zellschaber und übertragen Sie die Zellsuspension in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen.</li>
	<li>Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation mit einem Schwenklöffelrotor bei 400 x g für 5 min.</li>
	<li>Verwerfen Sie den Überstand und resuspenieren Sie das Zellpellet vorsichtig in 5 ml Homogenisierungspuffer (HB; 250 mM Saccharose, 3 mM Imidazol bei pH 7,4, 1 mM EDTA ergänzt mit 0,03 mM Cycloheximid, 1x Protease-Inhibitor-Cocktail und 1x Phosphatase-Inhibitor-Cocktail).</li>
	<li>Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 1.300 x g für 10 min.</li>
	<li>Resuspendieren Sie das Zellpellet in 1 ml HB.</li>
	<li>Homogenisieren Sie die Zellen mit einem Dounce-Homogenisator für 15-20 Hübe. ANMERKUNG: Andere Homogenisierungsmethoden, z. B. das Durchlaufen der Probe durch eine Spritze, könnten verwendet werden. Die Homogenisierungseffizienz konnte durch die Beobachtung des Homogenats unter einem Phasenkontrastmikroskop aufgedeckt werden.</li>
	<li>Das Homogenat wird in ein 2 ml Zentrifugationsröhrchen überführt. HINWEIS: Ernten Sie 50 μL Homogenat mit 12,5 μL 5x Probenpuffer und markieren Sie es als Gesamtlysat.</li>
	<li>Dem Homogenat werden 0,7 ml HB zugegeben.</li>
	<li>Das verdünnte Homogenat bei 2.000 x g für 10 min bei 4 °C drehen. HINWEIS: Das Pellet enthält Kerne und ungebrochene Zellen.</li>
	<li>Sammeln Sie 1,5 ml des Überstandes und wiederholen Sie Schritt 2.12 einmal.</li>
	<li>Sammeln Sie 1,4 ml des Überstandes und kennzeichnen Sie ihn als postnuklearen Überstand (PNS).</li>
</ol>3. Vorbereitung der Dichtegradientensäule
<ol><li>Übertragen Sie 1,2 ml PNS in ein Ultrazentrifugenröhrchen.</li>
	<li>1 mL 62%ige Saccharoselösung (2,351 M Saccharose, 3 mM Imidazol bei pH 7,4) in die Probe geben und durch schonendes Pipettieren gut mischen. HINWEIS: Die resultierende Lösung ist eine 40,6% ige Saccharoselösung.</li>
	<li>3,3 ml 35%ige Saccharoselösung (1,177 M Saccharose, 3 mM Imidazol bei pH 7,4) vorsichtig auf die Probe geben.</li>
	<li>2,2 ml 25%ige Saccharoselösung (0,806 M Saccharose, 3 mM Imidazol bei pH 7,4) vorsichtig auf die 35%ige Saccharoselösung geben. ANMERKUNG: Der Brechungsindex der 62%, 40,6%, 35% und 25% Saccharoselösungen bei Raumtemperatur beträgt 1,44, 1,40, 1,39 bzw. 1,37. Die Brechungsindizes der Saccharoselösungen konnten mit einem Refraktometer überprüft werden, um die Präzision und Konsistenz des Experiments sicherzustellen.</li>
	<li>Füllen Sie das Ultrazentrifugationsrohr mit HB auf. HINWEIS: Die vorbereitete Dichtegradientensäule wird bei 4 °C zwischengespeichert.</li>
</ol>4. Fraktionierung und Rückgewinnung von Recycling-Endosomen-haltigen Fraktionen
<ol><li>Zentrifugieren Sie die Säule bei 210.000 x g für 3 h bei 4 °C.</li>
	<li>Sammeln Sie 12 Fraktionen (je 1 ml) sorgfältig, beginnend von der Spitze des Gradienten. HINWEIS: Die Recycling-Endosomen sollten an der Grenzfläche zwischen 35% und 25% Saccharoselösungen gefunden werden. Die gesammelten Fraktionen können in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80 °C gelagert werden.</li>
	<li>Verdünnen Sie alle Fraktionen mit 1 ml Verdünnungspuffer (3 mM Imidazol bei pH 7,4, 1 mM EDTA).</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die verdünnte Probe bei 100.000 x g für 1 h bei 4 °C.</li>
	<li>Aspirieren Sie den Überstand und fügen Sie 50 μL 1x Probenpuffer hinzu, um die Fraktionen zu ernten.</li>
	<li>Analysieren Sie den Proteingehalt in den Fraktionen durch Western Blotting.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte mit dem Inhalt dieses Artikels haben.

Das obige Protokoll beschreibt die Verfahren zur Isolierung von Recycling-Endosomen aus kultivierten Zellen durch Ultrazentrifugation. Die Zuverlässigkeit dieser Methode wurde durch die neueste Veröffentlichung22nachgewiesen, die beweist, dass Recycling-Endosomen erfolgreich aus anderen Organellen (Abbildung 1) wie dem Golgi-Apparat und den Mitochondrien isoliert werden. Einige kritische Schritte müssen beachtet werden, um ein gutes Trennergebnis zu erzielen. Bei der ...

Der endosomale Transport ist ein essentieller physiologischer Prozess, der verschiedene biologische Ereignisse1impliziert, z. B. den Transport von Signalrezeptoren, Ionenkanälen und Adhäsionsmolekülen. Proteine, die an der Plasmamembran lokalisiert sind, werden durch Endozytoseinternalisiert 2. Die internalisierten Proteine werden dann nach dem frühen Endosom3sortiert. Einige der Proteine zielen auf Lysosomen zum Abbau ab4. Eine beträchtliche Menge an Proteinen wird jedoch durch schnelles Recycling und langsame Recyclingprozesse wieder auf die Zelloberfläche zurückgeführt. Beim schnellen Recycling verlassen Proteine die frühen Endosomen und kehren direkt zur Plasmamembran zurück. Umgekehrt werden beim langsamen Recycling Proteine zunächst in das endozytäre Recyclingkompartiment sortiert und dann zurück zur Plasmamembran transportiert. Verschiedene Frachtproteine, zum Beispiel Clathrin, Retromerkomplex, Retrieverkomplex und Wiskott-Aldrich-Syndrom-Protein sowie SCAR Homologue (WASH) -Komplex, nehmen an solchen Membranrecyclingprozessenteil 4,5,6,7,8,9. Das Gleichgewicht der Endozytose und des Recyclingereignisses ist entscheidend für das Überleben der Zelle und trägt zu verschiedenen zellulären Ereignissen10bei, z. B. Zelladhäsion, Zellmigration, Zellpolarität und Signaltransduktion.
ARF6, eine kleine GTPase, ist ein berichteter Regulator des endozytären Transports7,11,12. Interessant ist, dass verschiedene Forschungsgruppen die Bedeutung von ARF6 für das endozytäre Recycling13,14,15,16,17aufgezeigthaben. Die Studie zielt darauf ab, den Zusammenhang zwischen ARF6-vermitteltem Neuritenauswuchs und endozytärem Recycling zu untersuchen. Der vorherige Bericht legt nahe, dass die Aktivierung von ARF6 der Rac1-Aktivität vorgelagert ist, indem sie auf den ELMO1-Dedikator des Zytokinese-1-Komplexes (DOCK180)18einwirkt. Wie ARF6 jedoch die ELMO1-DOCK180-vermittelte Rac1-Signalisierung auslöst, bleibt unklar. Die Dichtegradienten-Ultrazentrifugation wurde eingesetzt, um die Rolle des ARF6-vermittelten endozytären Recyclings in einem solchen Prozess zu untersuchen. Auf diese Weise wurde die Recycling-Endosomen-haltige Fraktion aus Zelllysaten19erhalten. Die Fraktion wurde für die Proteingehaltsanalyse einem Western Blotting unterzogen. Die Immunoblot-Ergebnisse zeigten, dass unter Der Anwesenheit von FE65, einem mit dem Gehirn angereicherten Adapterprotein, aktives ARF6 den Gehalt an ELMO1 in der Recycling-Endosomen-haltigen Fraktion erheblich erhöhte. Das folgende Protokoll enthält die Verfahren für (1) die Transfektionierung von Säugetierzellen; (2) Vorbereitung der Proben und Dichtegradientensäulen; und (3) Gewinnung der Recycling-Endosomen-haltigen Fraktion.

<table><tbody><tr><td>1 ml, Dickwandiges Polypropylen-Röhrchen mit offenem Deckel, 11 x 34 mm</td><td>Beckman Coulter</td><td>347287</td><td></td></tr><tr><td>100 mm Gewebekulturschale</td><td>SPL</td><td>20100</td><td></td></tr><tr><td>13,2 ml, zertifiziertes freies Open-Top-Dünnwand-Ultra-Clear-Röhrchen, 14 x 89 mm</td><td>Beckman Coulter</td><td>C14277</td><td></td></tr><tr><td>5x Probenpuffer</td><td>GenScript</td><td>MB01015</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete, EDTA-freier Proteaseinhibitor-Cocktail</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>COX IV (3E11) Kaninchen-mAb-Zellsignaltechnologie</td><td></td><td>4850S</td><td>Monoklonaler Kaninchen-Antikörper zum Nachweis von COX IV.</td></tr><tr><td>Cycloheximid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1988</td><td></td></tr><tr><td>Dounce Tissue Grinder, 7 mL</td><td>DWK Life Sciences</td><td>357542</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) mit niedrigem Glukosegehalt</td><td>HyClone</td><td>SH30021.01</td><td></td></tr><tr><td>ELMO1 Antikörper (B-7)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-271519</td><td>Maus monoklonaler Antikörper zum Nachweis von ELMO1.</td></tr><tr><td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td><td>QIAGEN</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>FE65 Antikörper (E-20)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-19751</td><td>polyklonaler Antikörper aus Ziegen zum Nachweis von FE65.</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum,</td><td>HyClone</td><td>SV30160.03</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH Monoklonaler Antikörper (6C5)</td><td>Ambion</td><td>AM4300</td><td>Monoklonaler Maus-Antikörper zum Nachweis von GAPDH.</td></tr><tr><td>ImageLab Software</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>Messung der Bandenintensität</td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2399</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 Transfektionsreagenz</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>monoklonaler Anti-&beta;-COP Antikörper</td><td>Sigma</td><td>G6160</td><td>Maus monoklonaler Antikörper zum Nachweis von &beta;-COP.</td></tr><tr><td>Myc-tag (9B11) Maus mAb</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>2276S</td><td>Monoklonaler Maus-Antikörper zum Nachweis von myc-markierten Proteinen.</td></tr><tr><td>OmniPur EDTA, Dinatriumsalz, Dihydrat</td><td>Calbiochem</td><td>4010-OP</td><td></td></tr><tr><td>Optima L-100 XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>392050</td><td></td></tr><tr><td>Optima MAX-TL</td><td>Beckman Coulter</td><td>A95761</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I Reduced Serum Media</td><td>Gibco</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>PBS Tabletten</td><td>Gibco</td><td>18912014</td><td></td></tr><tr><td>PhosSTOP</td><td>Roche</td><td></td><td></td>4906845001</tr><tr><td>RAB11A-spezifischer polyklonaler Antikörper</td><td>Proteintech</td><td>20229-1-AP</td><td>Polyklonaler Kaninchen-Antikörper zum Nachweis von Rab11.</td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Affymetrix</td><td>AAJ21931A4</td><td></td></tr><tr><td>SW 41 Ti Ausschwingrotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>331362</td><td></td></tr><tr><td>TLA-120.2 Festwinkelrotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>362046</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,05%), phenolrot</td><td>Gibco</td><td>25300062</td><td></td></tr></tbody></table>

dichtegradienten-ultrazentrifugation zur untersuchung des endozytären recyclings in säugetierzellen

Density Gradient Ultracentrifugation for Investigating Endocytic Recycling in Mammalian Cells

Der endosomale Transport ist ein essentieller zellulärer Prozess, der eine breite Palette biologischer Ereignisse reguliert. Proteine werden aus der Plasmamembran internalisiert und dann zu den frühen Endosomen transportiert. Die internalisierten Proteine könnten zum Abbau in das Lysosom überführt oder zur Plasmamembran zurückgeführt werden. Ein robuster endozytärer Recyclingweg ist erforderlich, um die Entfernung von Membranmaterialien aus der Endozytose auszugleichen. Es wird berichtet, dass verschiedene Proteine den Signalweg regulieren, einschließlich ADP-Ribosylierungsfaktor 6 (ARF6). Die Dichtegradienten-Ultrazentrifugation ist eine klassische Methode zur Zellfraktionierung. Nach der Zentrifugation werden Organellen an ihrer isopyknen Oberfläche sedimentiert. Die Fraktionen werden gesammelt und für andere nachgelagerte Anwendungen verwendet. Hier beschrieben ist ein Protokoll zur Gewinnung einer Recycling-Endosomen-haltigen Fraktion aus transfizierten Säugetierzellen mittels Dichtegradienten-Ultrazentrifugation. Die isolierten Fraktionen wurden zur Analyse ihres Proteingehalts einem Standard-Western-Blotting unterzogen. Durch die Anwendung dieser Methode identifizierten wir, dass die Plasmamembran, die auf Engulfment und Zellmotilität 1 (ELMO1), einen Ras-verwandten C3-Botulinumtoxin-Substrat 1 (Rac1) Guanin-Nukleotidaustauschfaktor, abzielt, durch ARF6-vermitteltes endozytäres Recycling erfolgt.

Nach der Fraktionierung der nicht transfizierten HEK293-Zellen durch Dichtegradienten-Ultrazentrifugation wurden 12 Brüche von der Spitze des Gradienten gesammelt. Die geernteten Fraktionen wurden mit dem Verdünnungspuffer im Verhältnis 1:1 verdünnt und einer zweiten Zentrifugationsrunde unterzogen. Die Proben wurden dann einem Western Blotting unterzogen, um ihren Proteingehalt zu analysieren. Wie in Abbildung 1 gezeigt,wird der Recycling-Endosomenmarker Rab11 in Fraktion 7<sup class="xref"...

Dieser Beitrag zielt darauf ab, ein Protokoll zur Herstellung von Recycling-Endosomen aus Säugetierzellen unter Verwendung der Saccharosedichtegradienten-Ultrazentrifugation vorzustellen.

Dichtegradienten-Ultrazentrifugation zur Untersuchung des endozytären Recyclings in Säugetierzellen

Endosomal trafficking is an essential cellular process that regulates a broad range of biological events. Proteins are internalized from the plasma ...

Dieses Protokoll hilft bei der Isolierung der Recycling-Endosomen, die eine Fraktion aus transfizierten Säugetierzellen enthalten, um die Untersuchung des Proteintransports über den endozytären Handel zu erleichtern. Diese Technik ist einfach zu handhaben und sowohl auf Gewebe- als auch auf Zellproben anwendbar. Das Verfahren wird Miss Zhai Yu Qi, eine Doktorandin aus dem Labor von Dr. Lao, demonstrieren.Um zu beginnen, Teller 2 mal 10 zu den 6 Zellen in einer 100 Millimeter Kulturschale. Am nächsten Tag transfizieren Sie die Zellen mit Lipofectamine gemäß den Anweisungen des Herstellers. Um die Zellen zu ernten, verwerfen Sie das Kulturmedium 48 Stunden nach der Transfektion und waschen Sie die Zellen zweimal mit eiskaltem PBS.Dann fügen Sie einen Milliliter eiskaltes PBS, ergänzt mit einem 0,5-fachen Protease-Inhibitor-Cocktail in einem 0,5-fachen Phosphatase-Inhibitor-Cocktail, zu jedem Gericht hinzu. Als nächstes sammeln Sie die Zellen mit einem Zellschaber und übertragen sie die Zellsuspension in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. die Zellen durch Zentrifugation mit einem Schwenklöffelrotor.Entsorgen Sie den Überstand und resuspenieren Sie das Zellpellet vorsichtig in fünf Milliliter Homogenisierungspuffer. Sammeln Sie die Zellen erneut durch Zentrifugation und resuspen Sie das Zellpellet in einem Milliliter Homogenisierungspuffer. Homogenisieren Sie die Zellen mit einem Dounce Homogenisator mit 15 bis 20 Schlägen.Dann übertragen Sie das Homogonat auf ein zwei Milliliter Zentrifugationsrohr. Fügen Sie dem Homogonat 700 Mikroliter Homogenisierungspuffer hinzu. Dann das verdünnte Homogonat drehen und 1,5 Milliliter des Überstandes sammeln.Drehen Sie den gesammelten Überstand erneut, sammeln Sie dann 1,4 Milliliter des Überstandes und kennzeichnen Sie ihn als postnuklearen Überstand. Um die Dichtegradientenkolonne vorzubereiten, werden 1,2 Milliliter des postnuklearen Überstands in ein Ultrazentrifugenrohr überführt. Dann fügen Sie einen Milliliter 62% Saccharoselösung in die Probe und mischen Sie gut durch sanftes Pipettieren.Als nächstes werden vorsichtig 3,3 Milliliter 35% Saccharoselösung auf die Probe gegeben, gefolgt von 2,2 Millilitern 25% Saccharoselösung zusätzlich zu der 35% Saccharoselösung. Zum Schluss füllen Sie das Ultrazentrifugenröhrchen nach oben mit Homogenisierungspuffer. Zentrifugieren Sie die Dichtegradientensäule und sammeln Sie vorsichtig 12 Fraktionen von je 1 Milliliter, beginnend von der Oberseite des Gradienten.Als nächstes verdünnen Sie alle Fraktionen mit einem Milliliter Verdünnungspuffer und zentrifugieren Sie die verdünnten Proben. Nach der Zentrifugation den Überstand absaugen und 50 Mikroliter 1X Probenpuffer hinzufügen, um die Fraktionen zu ernten. Der Recycling-Endosomenmarker Rab11 wurde in Fraktion sieben nachgewiesen.Andere subzelluläre Marker, einschließlich Beta COP, COX IV, GAPDH, EEA1, Rab 7 und Lamp1, wurden ebenfalls untersucht. Ein positives EEA1-Signal wurde auch in Fraktion sieben nachgewiesen. Die gemessenen Bandenintensitäten von GAPDH, Cox IV und Rab11 sowohl in Fraktion sieben als auch im postnuklearen Überstand sind hier dargestellt.Nach der Transektion von HEC293-Zellen mit ELMO1, ELMO1 ARF6Q67L oder ELMO1 ARF6Q67L FE65 wurden keine Veränderungen in der ELMO1-Verteilung mit ARF6Q67L- und FE65-Überexpression gefunden. Der ELMO1-Spiegel in Fraktion sieben wurde zwischen verschiedenen Transfektionen verglichen und nach Cotransfektion von ARF6Q67L erhöht befunden. Ein weiterer Anstieg wurde beobachtet, wenn sowohl ARF6Q67L als auch FE65 gemeinsam exprimiert wurden.Umgekehrt verringerte das Ausschalten von FE65 die ARF6-vermittelte Elmo1-Anreicherung in Fraktion sieben. Die erhaltene Fraktion könnte für die anschließende Analyse verwendet werden. Zum Beispiel Western Blotting, um Proteinspiegeländerungen in der Fraktion zu visualisieren.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll für die Extraktion des Übersetzens Ribosomen aus eukaryotischen Zellen. Sobald extrahiert, Ribosomen in monosomes und Polyribosomen durch Saccharose-Gradienten Fraktionierung getrennt, um verschiedene ribosomale Populationen analysiert werden. Als solche ist diese Methode der Goldstandard für die Untersuchung der Regulation der Translation.

Eukaryotische Polyribosome Profile Analysis

In diesem Video beschreiben wir ein einfaches und effizientes Protokoll, das Gradientenzentrifugation verwendet, um einzelne Kerne zu isolieren. Nach der Isolierung können diese Zellkerne für die Sequenzierung und Genomanalyse verwendet werden.

Gradientenzentrifugation basierte Reinigung von Kernen: Eine Technik zur Gewinnung einer hochreinen Fraktion intakter Kerne mittels Dichtegradientenzentrifugation

Dieses Video demonstriert die auf Dichtegradienten-Ultrazentrifugation basierende Aufreinigungsmethode zur Isolierung von Subpopulationen extrazellulärer Vesikel, die für Charakterisierungsstudien geeignet sind.

Reinigung von Subpopulationen extrazellulärer Vesikel: Eine Technik zur Aufreinigung von Subpopulationen extrazellulärer Vesikel mittels Dichtegradienten-Ultrazentrifugation

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um die Plasmamembran, Zytoplasma und Mitochondrien von U937 Zellen ohne den Einsatz von High-Speed-Zentrifugation zu isolieren. Diese Technik lässt sich subzelluläre Fraktionen für die anschließende Untersuchung des Proteins Lokalisierung über Immunoblotting zu reinigen.

Zelle Fraktionierung von U937 Zellen in der Abwesenheit von High-Speed-Zentrifugation

Dieses Fraktionierungsprotokoll wird es Forschern ermöglichen, zytoplasmatische, nukleare, mitochondriale und Membranproteine aus Säugetierzellen zu isolieren. Die beiden letztgenannten subzellulären Fraktionen werden über einen isopyknischen Dichtegradienten weiter gereinigt.

Zellfraktionierung von U937-Zellen durch isopyknische Dichtegradientenreinigung

Dieses Protokoll beschreibt die Anreicherung nativer mykobakterieller extrazellulärer Vesikel (mEVs) aus axenischen Kulturen von Mycobacterium smegmatis (Msm) und wie mCherry (ein rot fluoreszierender Reporter) enthaltende rekombinante MsmEVs entworfen und angereichert werden können. Schließlich wird der neuartige Ansatz mit der Anreicherung von MsmEVs verifiziert, die das EsxA-Protein von Mycobacterium tuberculosis enthalten.

Anreicherung nativer und rekombinanter extrazellulärer Vesikel von Mykobakterien

Mitochondriale Kontaktstellen sind Proteinkomplexe, die mit mitochondrialen inneren und äußeren Membranproteinen interagieren. Diese Stellen sind essentiell für die Kommunikation zwischen den mitochondrialen Membranen und damit zwischen dem Zytosol und der mitochondrialen Matrix. Hier beschreiben wir eine Methode zur Identifizierung von Kandidaten, die sich für diese spezifische Klasse von Proteinen qualifizieren.

Eine verbesserte Methode zur Isolierung mitochondrialer Kontaktstellen

Diese Studie beschreibt eine Methode zur Isolierung und Reinigung bakterieller extrazellulärer Vesikel (BEVs), die aus menschlichen Fäkalien mittels Dichtegradientenzentrifugation (DGC) angereichert wurden, identifiziert die physikalischen Eigenschaften von BEVs anhand von Morphologie, Partikelgröße und Konzentration und diskutiert die potenziellen Anwendungen des DGC-Ansatzes in der klinischen und wissenschaftlichen Forschung.

Isolierung und Aufreinigung bakterieller extrazellulärer Vesikel aus menschlichen Fäkalien mittels Dichtegradientenzentrifugation

Das Protokoll beschreibt die Isolierung von mikrobiellen EVs im Darm von salzempfindlichen Ratten, die mit HSD gefüttert wurden, mittels Dichtegradientenzentrifugation. EVs wurden durch Nanopartikel-Tracking, TEM, LPS/BCA-Assays und 16S rRNA-Sequenzierung charakterisiert, um die Größe, Morphologie, Zusammensetzung und Herkunft der Mikrobiota zu analysieren.

Trennung und differentielle Charakterisierung von mikrobiellen extrazellulären Vesikeln im Darm bei salzempfindlichen Ratten unter salzreichen Ernährungsbedingungen

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung und Quantifizierung von kleinen RNAs mit hohem Dichtheits-Lipoprotein.

Isolierung von Lipoproteinen hoher Dichte für Non-coding Small RNA Quantification

Lernen Sie die Dichtegradienten-Ultrazentrifugation zur Isolierung von Recycling-Endosomen aus Säugetierzellen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung des endozytären Proteintransports in der Zellbiologie.

Dichtegradienten-Ultrazentrifugation zur Untersuchung des endozytären Recyclings in Säugetierzellen

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