Name: Herstellung von pseudotypisierten H5-Aviären Influenzaviren mit Calciumphosphat-Transfektionsmethode und Messung der Antikörperneutralisationsaktivität (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-22T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 15 s
Description: Erfahren Sie die Herstellung von H5-Avian-Influenza-Pseudoviren mittels Calciumphosphat-Transfektion in HEK293-FT-Zellen und die Messung der Antikörperneutralisation. Dieses Protokoll ermöglicht die sichere Untersuchung von Immunantworten.

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Diese Arbeit wurde durch die Forschungsstipendien des Innovation Capacity Building Project der Provinz Jiangsu (BM2020019), des Shenzhen Scientific and Technological Project (Nr. JSGG20200225150702770), Strategic Priority Research Program der Chinesischen Akademie der Wissenschaften (XDB29030103), Guangdong Scientific and Technological Project (Nr. 2020B1111340076) und das Shenzhen Bay Laboratory Open Research Program (Nr. SZBL202002271003).

Alle Pseudovirus-bezogenen experimentellen Operationen wurden unter ABSL2-Bedingungen im Institut Pasteur der Shanghai Chinese Academy of Sciences (IPS, CAS) durchgeführt. Die Tierversuche wurden auf der Grundlage der vom Institutional Animal Care and Use Committee genehmigten Tierprotokolle von IPS, CAS durchgeführt.
1. Pseudovirusverpackung mit Calciumphosphat-Transfektion
<ol><li>Einzelzellsuspensionen von HEK293FT Zellen (9 x 10,5 pro ml) in vollständigem DMEM-Medium herstellen (Tabelle 1). Geben Sie 10 ml der einzelligen Suspensionen in einen T75-Kolben und inkubieren Sie die Zellen in einem 37 °C heißen Inkubator mit 5 % Kohlendioxid (CO2) für 20 h vor der Transfektion. HINWEIS: HEK293FT niedriger Durchgang (<20 Durchgänge) wird empfohlen. Stellen Sie sicher, dass die Zellmonoschicht zu 80-90% konfluent ist.</li>
	<li>Ersetzen Sie das Medium 2 h vor der Transfektion durch 10 ml frisches Komplettmedium mit Chloroquin (100 μM).</li>
	<li>Mischen Sie die Reagenzien und die Plasmid-DNA wie in Tabelle 2 und Abbildung 1 gezeigt: ddH 2 O, pCMV/R-HA, pCMV/R-NA, pHR-Luc, pCMV Δ 8,9, 2,5 M CaCl2und 2x HEPES-Puffer. Pipettieren Sie 5 Mal vorsichtig auf und ab, inkubieren Sie die Mischung bei Raumtemperatur (RT) für 20 Minuten.</li>
	<li>Übertragen Sie die Mischung in das Medium über den Zellen und schaukeln Sie den Kolben vorsichtig. Inkubieren Sie die Zellen im Zellinkubator für 15 h.</li>
	<li>Ersetzen Sie das Medium durch 15 ml frisches, vollständiges DMEM-Medium. Inkubieren Sie die Zellen in einem Inkubator mit 37 °C und 5 % CO2 -Anteil für 65 h. HINWEIS: Die Farbe des Mediums ist hellorange oder leicht gelblich, und mindestens 80 % der Zelle sollten unter dem inversen Lichtmikroskop den zytopathischen Effekt (CPE) zeigen.</li>
	<li>Ernten Sie den Überstand und zentrifugieren Sie ihn bei 2095 x g für 20 Minuten bei 4 °C. Den Überstand auffangen, aliquotieren und bei -80 °C lagern.</li>
</ol>2. Nachweis der HA-, NA- und HIV-1-p24-Proteinexpression des Influenza-Pseudovirus
<ol><li>Nachweis der HA-Proteinexpression mittels Hämagglutinin (HA)-Assay.<ol><li>Geben Sie 50 μl PBS in die Spalten 2-12, Zeilen A, B und C einer 96-Well-Platte mit rundem Boden. HINWEIS: Die Zeilen A, B und C gehören zu 3 unabhängigen Replikationstests, und Spalte 12 wird als Negativkontrolle verwendet.</li>
		<li>Geben Sie 100 μl Pseudovirus in die Vertiefungen von Spalte 1. Übertragen Sie 50 μl von Säule 1 in Säule 2, mischen Sie gut, indem Sie 5 Mal auf und ab pipettieren, führen Sie die zweifachen Verdünnungen bis zur letzten Säule 11 durch und verwerfen Sie die zusätzlichen 50 μl aus Säule 11.</li>
		<li>Geben Sie 50 μl 0,5%ige Erythrozyten in jede Vertiefung und pipettieren Sie sie zweimal vorsichtig auf und ab. Inkubieren Sie die Platte für 30-60 min bei RT oder bis die Erythrozyten der Negativkontrolle die regelmäßigen Flecken am Boden der Vertiefung bilden.</li>
		<li>Beobachten und notieren Sie die HA-Titer des Pseudovirus. HINWEIS: Die HA-Einheit der Pseudoviren ist der höchste Verdünnungsfaktor des Virus, der eine 100%ige Hämagglutination der roten Blutkörperchen verursachen kann.</li>
	</ol></li>
	<li>Nachweis der HA- und NA-Proteinexpression mit dem Western-Blot-Assay. HINWEIS: Alle Western-Blot-Schritte werden gemäß dem Handbuch der molekularen Klonierung (4. Auflage) durchgeführt.</li>
	<li>Nachweis der HIV-1 p24 Proteinexpression mit dem HIV-1 p24 ELISA Kit (Table of Materials).<ol><li>Geben Sie 50 μl des Lysepuffers in 450 μl Pseudovirusprobe. Mischen Sie es gründlich.</li>
		<li>Geben Sie 300 μl des Waschpuffers in jede Vertiefung der Mikrotiterplatte. Schlagen Sie die Platte auf den Kopf, um den Waschpuffer vollständig zu entfernen. Wiederholen Sie den Waschgang 5 Mal.</li>
		<li>Geben Sie 200 μl des Standards und der Proben separat in jede Welle. Bei 37 °C über Nacht oder 2 h inkubieren.</li>
		<li>Saugen Sie den Inhalt der Platte ab und waschen Sie die Platte wie in Schritt 2.3.2 beschrieben. Anmerkungen: Lassen Sie eine Vertiefung der Assay-Platte leer, um sie als leeres Substrat zu verwenden.</li>
		<li>Geben Sie 200 μl der p24-Detektorantikörper in jede Welle. Bei 37 °C 1 h inkubieren. Aspirieren und waschen Sie die Platte wie in Schritt 2.3.2 beschrieben.</li>
		<li>In jede Vertiefung werden 100 μl der Streptavidin-Peroxidase-Arbeitslösung gegeben und bei 37 °C für 30 min inkubiert. Aspirieren und waschen Sie die Platte wie in Schritt 2.3.2 beschrieben.</li>
		<li>Geben Sie 100 μl der Arbeitslösung des Unterzustands in jede Vertiefung, einschließlich der Substrat-Blindvertiefung, und inkubieren Sie sie bei 37 °C für 30 min. Anmerkungen: In den Vertiefungen entwickelt sich eine blaue Farbe.</li>
		<li>Geben Sie 100 μl des Stopppuffers in jede Vertiefung. Anmerkungen: Die blaue Farbe ändert sich sofort in Gelb.</li>
		<li>Lesen Sie die optische Dichte bei 450 nm innerhalb von 15 Minuten ab. Erfassen Sie die p24-Titer des Pseudovirus</li>
	</ol></li>
</ol>3. Pseudovirus-Titration
<ol><li>Stellen Sie Einzelzellsuspensionen von MDCK-Zellen (5 x 104 pro ml) in vollständigem DMEM-Medium her, fügen Sie 1250, 2500, 5000, 10000, 20000 und 40000 Zellen zu verschiedenen Vertiefungen einer 96-Well-Flachbodenplatte hinzu. Inkubieren Sie die Zellen in einem Inkubator mit 37 °C und 5 % CO2 -Anteil für 20 h.</li>
	<li>Nehmen Sie das Pseudovirus aus dem -80 °C warmen Kühlschrank, tauen Sie es auf dem Eis auf und wirbeln Sie das Pseudovirus vor.</li>
	<li>Fügen Sie 6 HAU-Pseudoviren (6x HA-Einheiten) zu jeder Vertiefung der 96-Well-Rundbodenplatte hinzu und füllen Sie jede Vertiefung mit vollständigem DMEM bis zu 120 μl auf.</li>
	<li>Pipettieren Sie die Mischung 5 Mal auf und ab, um sie gründlich zu mischen. Inkubieren Sie die Mischplatte in einem 37 °C, 5 % CO2 - Inkubator für 1 Stunde.</li>
	<li>Übertragen Sie 100 μl der Mischung auf die Zellen in der 96-Well-Platte. Legen Sie die Zellkulturplatte nach der Virusinfektion für 48 h, 60 h und 72 h wieder in den Inkubator.</li>
	<li>Nehmen Sie die Platte aus dem Inkubator und führen Sie den Luciferase-Test durch (Materialtabelle).</li>
	<li>Entfernen Sie das Medium vorsichtig aus den Vertiefungen der Platte. Spülen Sie die Zellen mit 200 μl PBS und entfernen Sie das PBS so weit wie möglich. Anmerkungen: Drehen Sie die Platte um und entsorgen Sie den Überstand, indem Sie ihn rückwärts auf saugfähiges Papier schlagen. Wenn die Testzelllinie nicht fest am Boden haften konnte, entfernen Sie die Aspiration des Mediums vorsichtig.</li>
	<li>Geben Sie 50 μl des Lysepuffers in jede Vertiefung und schaukeln Sie die Kulturplatte mehrmals. Lagern Sie die Platte über Nacht bei -80 °C. Anmerkungen: Mischen Sie 1 Volumen 5x Lysepuffer mit 4 Volumen Wasser, um den 1x Lysepuffer herzustellen. Äquilibrieren Sie den 1x Lysepuffer vor der Verwendung mit RT. Schaukeln Sie die Platte, um sicherzustellen, dass die Zellen vollständig mit dem Lysepuffer bedeckt sind. Der einzelne Gefrier-Auftau-Prozess kann dazu beitragen, dass die Zelle vollständig lysiert wird.</li>
	<li>Platte herausnehmen, 2 h bei RT äquilibrieren. HINWEIS: Die Zelle sollte vollständig lysiert sein.</li>
	<li>Schaukeln Sie die Platte mehrmals vorsichtig und übertragen Sie alle Zelllysate auf undurchsichtige 96-Well-Platten.</li>
	<li>Geben Sie 50 μl des Substrats in jede Vertiefung, schaukeln Sie die Platte mehrmals vorsichtig und mischen Sie Substrat und Lysepuffer gründlich.</li>
	<li>Messen Sie das erzeugte Licht innerhalb von 5 Minuten mit einem Luminometer. Notieren Sie die Luciferase-Titer des Pseudovirus. Anmerkungen: Wenn ein geeignetes Substrat hinzugefügt wird, wird Licht als Nebenprodukt über eine chemische Reaktion emittiert, bei der Luciferin durch das Luciferase-Enzym in Oxyluciferin umgewandelt wird. Die erzeugte Lichtmenge ist proportional zur Menge des Luciferase-Enzyms.</li>
</ol>4. Vorbereitung der Immunseren
HINWEIS: Das Immunserum wird für zellbezogene Experimente verwendet, und der experimentelle Betrieb sollte unter aseptischen Bedingungen durchgeführt werden.
<ol><li>Bereiten Sie 12 acht Wochen alte weibliche BALB/c-Mäuse vor. Teilen Sie die Mäuse gleichmäßig in zwei Gruppen ein. HINWEIS: Eine Gruppe war die DDV-Gruppe und die andere war die Negativkontrollgruppe.</li>
	<li>Immunisierung der DDV-Gruppe: Zweimal intramuskulär mit 100 μg eines Codon-optimierten DNA-Plasmids, das für das HA-Protein A/Thailand/(KAN-1)/2004 (TH) HA kodiert, in Woche 0 und Woche 3 und einmal intraperitoneal mit 512 HAU TH-Virus-ähnlichen Partikeln (VLP) in Woche 6 geboostert.</li>
	<li>Immunisierung der Kontrollgruppe: In Woche 0 und Woche 3 zweimal intramuskulär mit 100 μg leerer Vektorplasmid-DNA primen und in Woche 6 einmal intraperitoneal mit HIV-1 gag VLP boostern.</li>
	<li>Sammeln Sie das Mäuseblut 2 Wochen nach der letzten Impfung. HINWEIS: Hier wurden die Mäuse zum Zeitpunkt der Blutentnahme mit Pentobarbital-Natrium (65 mg/kg) betäubt. Nach der Blutentnahme aus der Vena submandibularis wurden die Mäuse sofort mit CO2 eingeschläfert.</li>
	<li>Bewahren Sie das Blut 2 h bei RT auf, dann über Nacht bei 4 °C. Bei 900 x g 10 min bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand auffangen. Deaktivieren Sie die Seren, indem Sie sie 30 min lang bei 56 °C aussetzen.</li>
	<li>Lagern Sie die Immunseren zur Verwendung in einem Kühlschrank bei -80 °C. HINWEIS: In der ergänzenden Abbildung 1 finden Sie das Flussdiagramm, das die wichtigsten Verfahren der Mäuseimmunisierung beschreibt.</li>
</ol>5. Pseudovirus-Neutralisations-Assay (PN)
<ol><li>Stellen Sie Einzelzellsuspensionen von MDCK-Zellen (5 x 104 pro ml) in vollständigem DMEM-Medium her und geben Sie 100 μl der Zellsuspension in jede Vertiefung einer 96-Well-Flachbodenplatte. Inkubieren Sie die Zellen in einem Inkubator mit 37 °C und 5 % CO2 -Anteil für 20 h.</li>
	<li>Nehmen Sie das Pseudovirus und die Seren aus dem -80 °C warmen Kühlschrank, tauen Sie es auf dem Eis auf und wirbeln Sie es gründlich vor.</li>
	<li>Verdünnen Sie die Seren 20-mal im gesamten Medium und geben Sie 100 μl des vollständigen DMEM-Mediums in die Vertiefungen einer 96-Well-Rundbodenplatte aus den Säulen 2-10.</li>
	<li>Geben Sie 200 μl der verdünnten Seren in die Vertiefungen von Spalte 2, übertragen Sie 100 μl von Spalte 2 in Spalte 3, verdünnen Sie die Seren nacheinander von Spalte 2 bis Spalte 10 auf 1:10240 und verwerfen Sie die 100 μl aus Spalte 10.</li>
	<li>Als Negativkontrolle werden 100 μl DMEM-Komplettmedium in die Vertiefungen der Säule 11 gegeben.</li>
	<li>Geben Sie 100 μl Pseudoviren in jede Vertiefung, pipettieren Sie das Gemisch 5 Mal gründlich auf und ab und inkubieren Sie die Gemischplatte bei 37 °C, 5 % CO2 für 1 h.</li>
	<li>Übertragen Sie 100 μl des Gemisches von der 96-Well-Rundbodenplatte in die entsprechende Vertiefung der 96-Well-Zellkulturplatte. Legen Sie die Platte für 60 h wieder in den Inkubator (37 °C, 5 %CO 2).</li>
	<li>Nehmen Sie die Platte aus dem Inkubator. Führen Sie den Luciferase-Assay wie in den Schritten 3.7-3.12 beschrieben durch.</li>
</ol>6. Assay zur Anhängung von Pseudoviren
<ol><li>Stellen Sie Einzelzellsuspensionen von MDCK-Zellen (4 x 104 pro ml) in vollständigem DMEM-Medium her und fügen Sie 100 μl Zellsuspensionen zu jeder Vertiefung in einer 96-Well-Flachbodenplatte hinzu. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C, 5% CO2 für 20 h.</li>
	<li>Inkubieren Sie das Pseudovirus mit Seren in DMEM mit 1% BSA bei 4 °C über Nacht. Anmerkungen: Das Volumen der Mischung beträgt 100 μl.</li>
	<li>Blockieren Sie die MDCK-Zellen mit 100 μl DMEM mit 1 % BSA pro Well bei 4 °C für 1 h.</li>
	<li>Das Pseudovirus-Serum-Gemisch (100 μL) wird auf die MDCK-Monoschicht geimpft und bei 4 °C für 2 h inkubiert.</li>
	<li>Waschen Sie die Zellplatte 4 Mal mit PBS, das 1 % BSA enthält, um ungebundene Viren zu entfernen.</li>
	<li>Lyse der Zellen mit 100 μL Luciferase-Lysepuffer bei RT für 30 min.</li>
	<li>Quantifizieren Sie die Menge des gebundenen Virus auf den Zellen mit einem HIV-1 p24 ELISA-Kit wie oben beschrieben (Abschnitt 2.3).</li>
</ol>7. Beurteilung des Viruseintritts
<ol><li>Stellen Sie Einzelzellsuspensionen von MDCK-Zellen (5 x 104 pro ml) in vollständigem DMEM-Medium her und geben Sie 100 μl der Zellsuspension in jede Vertiefung einer 96-Well-Flachbodenplatte. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C, 5 % CO2 für 20 h vor dem Assay.</li>
	<li>Inokulieren Sie das Pseudovirus (100 μL) auf einer MDCK-Monoschicht in einer 96-Well-Platte bei 4 °C für 6 h.</li>
	<li>Waschen Sie die Zellplatte 4 Mal mit PBS, das 1% BSA enthält, um ungebundene Pseudoviren zu entfernen.</li>
	<li>100 μl der seriell verdünnten Immunseren oder Seren von Scheinimpfmäusen in DMEM mit 1 % BSA in die Monoschicht geben und die Zelle bei 4 °C für 2 h inkubieren.</li>
	<li>Entfernen Sie den Zellüberstand und waschen Sie die Zellkulturplatte 4 Mal mit PBS, das 1% BSA enthält.</li>
	<li>Frisches DMEM in die Zellen geben und 60 h in einem Inkubator mit 37 °C und 5 % CO2 -% inkubieren.</li>
	<li>Messen Sie die relative Luciferase-Aktivität (RLA) der Zellen, wie in den Schritten 3.7-3.12 beschrieben. HINWEIS: Der virale Eintrag, wie von RLA angegeben, wurde als Prozentsatz des Messwerts ausgedrückt, der in Abwesenheit von Seren erhalten wurde, was auf 100% festgelegt wurde.</li>
</ol>

<ol><li>Wang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+prime+and+virus-like+particle+boost+from+a+single+H5N1+strain+elicits+broadly+neutralizing+antibody+responses+against+head+region+of+h5+hemagglutinin%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">DNA prime and virus-like particle boost from a single H5N1 strain elicits broadly neutralizing antibody responses against head region of h5 hemagglutinin.</a> The Journal of Infectious Diseases. 209 (5), 676-685 (2014).</li>
<li>Wang, G., Yin, R., Zhou, P., Ding, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+of+the+immunization+with+the+sequence+close+to+the+consensus+sequence+and+two+DNA+prime+plus+one+VLP+boost+generate+H5+hemagglutinin+specific+broad+neutralizing+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Combination of the immunization with the sequence close to the consensus sequence and two DNA prime plus one VLP boost generate H5 hemagglutinin specific broad neutralizing antibodies.</a> Plos One. 12 (5), 0176854(2017).</li>
<li>Li, Q., Liu, Q., Huang, W., Li, X., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+status+on+the+development+of+pseudoviruses+for+enveloped+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Reviews+in+Medical+Virology%22%5BJournal%5D)">Current status on the development of pseudoviruses for enveloped viruses.</a> Reviews in Medical Virology. 28 (1), 1963(2018).</li>
<li>Duvergé, A., Negroni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudotyping+lentiviral+vectors%3A+When+the+clothes+make+the+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Pseudotyping lentiviral vectors: When the clothes make the virus.</a> Viruses. 12 (11), 1311(2020).</li>
<li>Carnell, G. W., Ferrara, F., Grehan, K., Thompson, C. P., Temperton, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudotype-based+neutralization+assays+for+influenza%3A+A+systematic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Pseudotype-based neutralization assays for influenza: A systematic analysis.</a> Frontiers in Immunology. 6 (161), (2015).</li>
<li>Trombetta, C., Perini, D., Mather, S., Temperton, N., Montomoli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+serological+techniques+for+influenza+vaccine+evaluation%3A+Past%2C+present+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccines%22%5BJournal%5D)">Overview of serological techniques for influenza vaccine evaluation: Past, present and future.</a> Vaccines. 2 (4), 707-734 (2014).</li>
<li>Wei, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+influenza+vaccines%3A+opportunities+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Next-generation influenza vaccines: opportunities and challenges.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 19 (4), 239-252 (2020).</li>
<li>Krammer, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Disease+Primers%22%5BJournal%5D)">Influenza.</a> Nature Reviews Disease Primers. 4 (3), (2018).</li>
<li>Wei, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+broadly+neutralizing+H1N1+influenza+antibodies+by+vaccination%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induction of broadly neutralizing H1N1 influenza antibodies by vaccination.</a> Science. 27 (329), 1060-1064 (2010).</li>
<li>Chernov, V. M., Chernova, O. A., Sanchez-Vega, J. T., Kolpakov, A. I., Ilinskaya, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycoplasma+contamination+of+cell+cultures+vesicular+traffic+in+bacteria+and+control+over+infectious+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Naturae%22%5BJournal%5D)">Mycoplasma contamination of cell cultures vesicular traffic in bacteria and control over infectious agents.</a> Acta Naturae. 6 (3), 41-51 (2014).</li>
<li>Michael, R. G., Joseph, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMichael%2C+RG+%22Molecular+Cloning%3A+A+Laboratory+Manual+%28Fourth+Edition%29%22">Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Fourth Edition)</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (2012).</li>
<li>Kumar, P., Nagarajan, A., Uchil, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+of+mammalian+cells+with+calcium+phosphate-DNA+coprecipitates%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Transfection of mammalian cells with calcium phosphate-DNA coprecipitates.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (10), (2019).</li>
<li>Robert, E. K., Chen, C. A., Okayama, H., John, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+phosphate+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Calcium phosphate transfection.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 9, (2003).</li>
<li>Robert, E. K., Chen, C. A., Okayama, H., John, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+of+DNA+into+eukaryotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Transfection of DNA into eukaryotic cells.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 9, 11-19 (1996).</li>
<li>Kachkin, D. V., Khorolskaya, J. I., Ivanova, J. S., Rubel, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+method+for+isolation+of+plasmid+DNA+for+transfection+of+mammalian+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">An efficient method for isolation of plasmid DNA for transfection of mammalian cell cultures.</a> Methods and Protocols. 3 (4), 69(2020).</li>
<li>Luciferase assay system. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.promega.com.cn/products/luciferase-assays/reporter-assays/luciferase-assay-system">https://www.promega.com.cn/products/luciferase-assays/reporter-assays/luciferase-assay-system</a> (2021).</li>
<li>Corning 96-Well Solid Black or White Polystyrene Microplates. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.fishersci.com/shop/products/costar-96-well-black-white-solid-plates">https://www.fishersci.com/shop/products/costar-96-well-black-white-solid-plates</a> (2021).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

HEK293FT Zellen werden in der Regel als Verpackungszellen zur Herstellung von Pseudoviren verwendet. Ein regelmäßiger Mykoplasmennachweis ist während der Zellkultur unerlässlich. Eine Mykoplasmenkontamination kann die Ausbeute an Pseudoviren drastisch verringern und manchmal nahe Null liegen. Im Vergleich zu anderen Kontaminationen führen Mykoplasmen-Kontaminationen nicht zu pH-Wert-Veränderungen oder Trübungen des Zellkulturmediums. Selbst eine hohe Konzentration von Mykoplasmen ist mit bloßem Auge oder unter dem Mikros...

Seit 1996 verursachen hochpathogene H5-Viren der A/Goose/Guangdong/1/96-Linie der aviären Influenza (HPAI) kontinuierliche Grippeausbrüche bei Geflügel und Wildvögeln, die für enorme sozioökonomische Verluste in der globalen Geflügelindustrie verantwortlich sind. Manchmal infizieren sich auch Menschen damit, was mit einer hohen Sterblichkeitsrate konfrontiert ist 1,2. Die HPAI-Virusforschung wird jedoch häufig behindert, da sie nicht außerhalb von Laboratorien der Biosicherheitsstufe 3 durchgeführt werden kann. Um dieses Problem zu lösen, werden Pseudoviren als Alternative zu Wildtyp-Viren in einigen Experimenten von H5-HPAI-Studien eingesetzt. Pseudoviren sind sicher genug, um in Laboratorien der Biosicherheitsstufe 2 praktiziert zu werden.
H5 HPAI-Pseudoviren gehören zu den chimären Viren, die aus Surrogatviruskernen, Lipidhüllen mit den Oberflächenglykoproteinen von Influenzaviren und Reportergenen bestehen. Pseudoviruskerne stammen in der Regel vom lentiviralen humanen Immundefizienzvirus (HIV), Retroviren wie dem murinen Leukämievirus (MLV) und dem vesikulären Stomatitisvirus (VSV)3. Insbesondere das HIV-1-Verpackungssystem wird häufig zur Herstellung von Influenza-Pseudoviren verwendet, wobei die primären Gene gag und pol sind. Das HIV-Gag-Gen exprimiert Kernproteine. Das pol-Gen exprimiert die Integrase und die reverse Transkriptase, die beide für die Expression des Reportergens in transduzierten Zellen notwendig sind. In Anlehnung an das Genom des Surrogatvirus wird das Reportergen in RNA-Form in den Pseudoviruskern aufgenommen. Das Reportergen exprimiert das Protein in den Wirtszellen. Die Genexpressionsniveaus von Reportergenen können verwendet werden, um die Effizienz von Pseudovirusinfektionen zu messen 3,4. Der primäre Reporter ist die Glühwürmchen-Luciferase zur Messung der relativen Lumineszenzeinheiten (RLU) oder der relativen Luciferase-Aktivität (RLA) in transduzierten Zellen. Andere Reporter wie lacZ, Gaussia und Renilla luciferase werden ebenfalls verwendet, nur in geringerem Maße5.
Pseudoviren sind ideale Werkzeuge, um neutralisierende Antikörper gegen H5-HAPI-Viren zu untersuchen. Um die Potenz der neutralisierenden Antikörper zu messen, werden Pseudovirus-Neutralisations-Assays (PN)6 verwendet. Hämagglutinin (HA) und Neuraminidase (NA) sind Glykoproteine auf der Oberfläche des Influenza-A-Virus 7,8. Die HA besteht aus einer globulären Kopfdomäne für die Rezeptorbindung und einer Stammdomäne für die Membranfusion. Das NA-Protein hat die Sialidase-Aktivität, um die Virusfreisetzung zu erleichtern 7,8. Ein PN-Assay kann neutralisierende Antikörper messen, die gegen HA-Proteine gerichtet sind. Neutralisierende Antikörper, die auf den Kopf- und Stammbereich der HA gerichtet sind, können auch durch virale Attachment- und Eintrittsassays nachgewiesen werden. Im Vergleich zu Wildtyp-Viren haben Pseudovirus-Neutralisationsexperimente empfindlichere Nachweiswerte, können in einem Biosicherheitslabor der Stufe 2 sicher durchgeführt werden und sind in der Praxis im Allgemeinen einfacher zu bedienen.
In diesem Protokoll werden die Verfahren und kritischen Schritte von H5-HPAI-Pseudoviruspräparaten und PN-Assays detailliert beschrieben. Außerdem werden die Fehlerbehebung, die Einschränkung und die Modifikationen dieser Assays erörtert. In dieser Arbeit wurde der Stamm A/Thailand/1(KAN)-1/2004(TH) von H5N1 HPAI-Viren als Beispiel verwendet. Um die in Assays verwendeten Immunseren zu erhalten, wählte dieses Protokoll das aus dem TH-Stamm stammende HA-Protein als Immunogen für die Immunisierung von Mäusen aus.

<table><tbody><tr><td>1 % Chiken Erythrozyten-Biokanal</td><td></td><td>BC-RBC-C001</td><td>Reagenz</td></tr><tr><td>96-Well-Zellkulturplatten (flacher Boden)</td><td>Thermo fisher scientific</td><td>167008</td><td>Verbrauchsmaterial</td></tr><tr><td>96-Well-Zellkulturplatten (runder Boden)</td><td>Thermo fisher scientific</td><td>163320</td><td>Verbrauchsmaterial</td></tr><tr><td>Allegra X-15R</td><td>Beckman-Schar</td> <td>-</td> <td>Ausrüstung/Zentrifuge</td></tr><tr><td>BD Insulinspritzen</td><td>BD</td><td>324910</td><td>Verbrauchsmaterial</td></tr><tr><td>Calciumchlorid wasserfrei</td><td>AMRESCO</td><td>1B1110-500G</td><td>Reagenz</td></tr><tr><td>Chloroquindiphosphat</td><td>Selleck</td><td>S4157</td><td>Reagenz</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>12100-046</td><td>Reagenz</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td>Reagenz</td></tr><tr><td>HEK293FT</td><td>Gibco</td><td>R700-07</td><td>Zelllinie</td></tr><tr><td>HEPES FREIE SÄURE</td><td>AMRESCO</td><td>0511-250G</td><td>Reagenz</td></tr><tr><td>HIV-1 p24 Antigen ELISA</td><td>ZeptoMetrix</td><td>801111</td><td>Reagenzkit</td></tr><tr><td>Luciferase Assay System Gefrierschrank Pack</td><td>Promega</td><td>E4530</td><td>Reagenzien-Kit</td></tr><tr><td>MDCK.1</td><td>ATCC</td><td>CRL-2935</td><td></td></tr><tr><td>Mikrozentrifugenröhrchen für die Zelllinie 1,5 mL</td><td>Thermo fisher scientific</td><td>509-GRD-Q</td><td>Verbrauchsmaterial</td></tr><tr><td>Nunc Konische Zentrifugenröhrchen 15 mL</td><td>Thermo fisher scientific</td><td>339650</td><td>Verbrauchsmaterial</td></tr><tr><td>Nunc Konische Zentrifugenröhrchen 50 mL</td><td>Thermo fisher scientific</td><td>339652</td><td>Verbrauchsmaterial</td></tr><tr><td>Nunc EasYFlask 75 cm2</td><td>Thermo fisher wissenschaftliches</td><td>156499</td><td>Verbrauchsmaterial</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td> Reagenz-Pipettenspitzen <td></td></tr><tr><td>(10 &mu; L)</td><td>Thermo fisher scientific</td><td>TF102-10-Q</td><td>Verbrauchsmaterial</td></tr><tr><td>Pipettenspitzen (100 &mu; L)</td><td>Thermo fisher scientific</td><td>TF113-100-Q</td><td>Verbrauchsmaterial</td></tr><tr><td>Pipettenspitzen (1000 &mu; L)</td><td>Thermo fisher scientific</td><td>TF112-1000-Q</td><td>Verbrauchsmaterial</td></tr><tr><td>Serologische Pipetten (5 mL)</td><td>Thermo fisher scientific</td><td>170355N</td><td>Verbrauchsmaterial</td></tr><tr><td>Serologische Pipetten (10 mL)</td><td>Thermo fisher scientific</td><td>170356N</td><td>Verbrauchsmaterial</td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-072</td><td>Reagenz</td></tr><tr><td>Varioskan Flash</td><td>Thermo fisher wissenschaftlich</td><td>--</td><td>Ausrüstung/Mikroplatten-Reader</td></tr><tr><td>Wassermantel-Inkubator</td><td>Thermo fisher scientific</td><td>3111</td><td>Ausrüstung/Zell-Inkubator</td></tr><tr><td>Pentobarbital-Natriumsalz</td><td>Sigma</td><td>57-33-0</td><td>Reagenz</td></tr></tbody></table>

herstellung von pseudotypisierten h5-aviären influenzaviren mit calciumphosphat-transfektionsmethode und messung der antikörperneutralisationsaktivität

Preparation of Pseudo-Typed H5 Avian Influenza Viruses with Calcium Phosphate Transfection Method and Measurement of Antibody Neutralizing Activity

Seit 1996 verursachen hochpathogene H5-Viren der A/Gans/Guangdong/1/96-Linie Grippeausbrüche bei Geflügel und Wildvögeln. Gelegentlich fallen ihr auch Menschen zum Opfer, was zu einer hohen Sterblichkeit führt. Nichtsdestotrotz wird die HPAI-Virusforschung oft behindert, wenn man bedenkt, dass sie in Laboratorien der biologischen Sicherheitsstufe 3 durchgeführt werden muss. Um dieses Problem zu lösen, werden Pseudoviren als Alternative zu Wildtyp-Viren in einigen Experimenten von H5-HPAI-Studien eingesetzt. Pseudoviren erweisen sich als ideale Werkzeuge, um neutralisierende Antikörper gegen H5-HPAI-Viren zu untersuchen. Dieses Protokoll beschreibt die Verfahren und kritischen Schritte von H5-HPAI-Pseudovirus-Präparaten und Pseudovirus-Neutralisationsassays. Außerdem werden die Fehlerbehebung, die Einschränkung und die Modifikationen dieser Assays erörtert.

HA, NA und HIV-1 p24 Proteinexpression des Influenza-Pseudovirus Um die Effizienz der Virusverpackung zu ermitteln, wurden zunächst Influenza-Pseudovirusbestände mittels HA-Assay nachgewiesen (Abbildung 2A). Die HA-Einheiten pro Milliliter Influenza-Pseudoviren betragen 643 (Tabelle 3). Western-Blot-Assays und Sandwich-ELISA-Assays wurden verwendet, um die HA-, NA- und HIV-1 p24-Proteinexpression zu testen. Anschließend wurden die Verhältnisse der HA-Einh...

Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Verpackung von Pseudoviren und die Messung der Antikörper-neutralisierenden Aktivität.

Herstellung von pseudotypisierten H5-Aviären Influenzaviren mit Calciumphosphat-Transfektionsmethode und Messung der Antikörperneutralisationsaktivität

Since 1996, A/goose/Guangdong/1/96-lineage highly pathogenic avian influenza (HPAI) H5 viruses have been causing flu outbreaks in poultry and wild birds. ...

Dieses Protokoll beschreibt die Verfahren und die kritischen Schritte von H5-Präparaten für Vogelgrippe mit hohem Krankheitserregergehalt und Pseudovirus-Neutralisationsassays. Außerdem werden die Einschränkungen bei der Fehlerbehebung und die Modifikationen dieser Assays erörtert. Hochpathogene Krankheitserreger müssen im Biosicherheitslabor der Stufe drei durchgeführt werden, während Pseudoviren in einem Biosicherheitslabor der Stufe zwei sicher gehandhabt werden können.Stellen Sie zunächst eine Einzelzellsuspension von HEK293 FT-Zellen in einem vollständigen DMEM-Medium her. 10 Milliliter der einzelligen Suspension in einen T75-Kolben geben, anschließend bei 37 Grad Celsius inkubieren. Ersetzen Sie zwei Stunden vor der Transfektion das alte Medium durch 10 Milliliter frisches Komplettmedium mit Chloroquin.Mischen Sie die Reagenzien und die Plasmid-DNA wie im Manuskript beschrieben, übertragen Sie diese Mischung dann in das Medium über den Zellen und rocken Sie sie vorsichtig. Ersetzen Sie das Medium nach der Inkubation durch 15 Milliliter frisches, vollständiges DMEM-Medium. Nach 65 Stunden wird der Überstand durch Zentrifugieren geerntet.Sammeln Sie den Überstand und aliquotieren Sie ihn. Um die Expression des Hämagglutinin-Proteins nachzuweisen, geben Sie 50 Mikroliter PBS in die Säulen zwei bis 12 einer runden Bodenplatte mit 96 Wells. Geben Sie 100 Mikroliter Pseudovirus in die Vertiefungen der ersten Säule.Übertragen Sie dann 50 Mikroliter Pseudovirus aus der ersten Säule in die Vertiefungen der zweiten Säule. Führen Sie diese zweifache Verdünnung bis zur Säule 11 durch, gefolgt von einer sanften Vermischung. Entsorgen Sie dann die zusätzlichen 50 Mikroliter aus Spalte 11.Geben Sie 50 Mikroliter 0,5%ige Erythrozyten in jede Vertiefung und mischen Sie sie anschließend vorsichtig. Nach 30 bis 60 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur werden die Hämagglutinintiter des Pseudovirus beobachtet und aufgezeichnet. Für die Pseudovirus-Titration wird eine Einzelzellsuspension von fünfmal 10 bis vier Zellen pro Milliliter MDCK-Zellen in einem vollständigen DMEM-Medium hergestellt.Fügen Sie 1, 250, 2, 500, 5, 000, 10, 000, 20, 000 und 40.000 Zellen zu verschiedenen Vertiefungen einer 96-Well-Platte mit flachem Boden hinzu. Tauen Sie das Pseudovirus nach der Inkubation auf und wirbeln Sie es vor. Geben Sie sechs HAU von Pseudoviren in jede Vertiefung einer runden 96-Well-Bodenplatte und füllen Sie jede Vertiefung mit vollständigem DMEM bis zu 120 Mikrolitern auf.Übertragen Sie 100 Mikroliter der Mischung auf die Zellen in der 96-Well-Platte. Inkubieren Sie die Kulturplatte 48, 60 und 72 Stunden lang für eine Virusinfektion und führen Sie einen Luciferase-Assay durch. Um den Luciferase-Assay durchzuführen, waschen Sie die Zellen, indem Sie das Medium vorsichtig entfernen und mit 200 Mikrolitern PBS spülen.Entfernen Sie so viel PBS wie möglich und geben Sie dann 50 Milliliter des Lysepuffers in jede Vertiefung. Am nächsten Tag werden die Platten zwei Stunden lang bei Raumtemperatur äquilibriert, dann die Kulturplatten mehrmals geschaukelt und alle Zelllysate auf undurchsichtige 96-Well-Platten überführt. Geben Sie 50 Mikroliter des Substrats auf jede Platte und mischen Sie es gut.Zeichnen Sie die Luciferase-Titer des Pseudovirus mit dem Luminometer auf. Geben Sie 100 Mikroliter der Einzelzellsuspension von MDCK-Zellen in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte mit flachem Boden und inkubieren Sie sie 20 Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Nach der Inkubation das Pseudovirus und die bei minus 80 Grad Celsius gelagerten Seren auftauen und wirbeln.Verdünnen Sie die Seren 20-mal in einem vollständigen Medium. Geben Sie 100 Mikroliter DMEM-Medium in die Spalten drei bis 10. Geben Sie 200 Mikroliter der verdünnten Seren in die Vertiefungen der zweiten Säule und führen Sie eine serielle Verdünnung durch.Geben Sie dann 100 Mikroliter DMEM-Medium als Negativkontrolle in die 11. Spalte. Geben Sie 100 Mikroliter Pseudoviren in jede Vertiefung und mischen Sie sie. Übertragen Sie 100 Mikroliter des Gemisches von der runden 96-Well-Bodenplatte in die entsprechende Vertiefung der 96-Well-Zellkulturplatte.Führen Sie nach 60 Stunden Inkubation bei 37 Grad Celsius den Luciferase-Assay durch. Der Hämagglutinin-Assay zeigte, dass 643 HA-Einheiten pro Milliliter Influenza-Pseudoviren in Influenza-Pseudovirus-Beständen vorhanden sind. Die Verhältnisse von HA und Knebel P24 lagen im Normbereich.Der Western-Blot-Assay zeigte das Vorhandensein von vier Proteintypen, darunter HA0-, HA1-, HA2- und NA-Proteine, was auf die Ähnlichkeit von Influenza-Pseudoviren mit denen von Wildtyp-Viren hinweist. Die Ergebnisse der Pseudovirus-Titration deuten darauf hin, dass die geeigneten Bedingungen für die höchste relative Luciferase-Aktivität die Fütterung von 5.000 Zellen in einer Vertiefung einer 96-Well-Platte und die Detektion relativer Luciferase-Aktivitätswerte nach 60 Stunden Virusinfektion umfassen. Die Immunseren der DDV-Gruppe zeigten hohe Neutralisationstiter gegen den Stamm des Pseudovirus A Thailand 1 Can 104, während die Seren der Kontrollgruppe keine Neutralisationsaktivität aufwiesen.Die neutralisierende Aktivität der Immunseren war im Vergleich zu den Kontrollseren stark, was darauf hindeutet, dass in den Immunseren viele Antikörper gegen den HA-Kopf gerichtet waren. Die signifikanten Unterschiede zwischen den Immunseren und den Kontrollen bei der Beurteilung des Viruseintritts deuten darauf hin, dass die Antikörper in den Immunseren auf die HA-Stammregion gerichtet sind. Denken Sie bei der Durchführung dieses Verfahrens daran, den pH-Wert der Transfektionslösung und des Nährmediums stabil zu halten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Source: Chang, X., et al. Preparation of Pseudo-Typed H5 Avian Influenza Viruses with Calcium Phosphate Transfection Method and Measurement of Antibody Neutralizing Activity. J. Vis. Exp. (2021)This video demonstrates a luciferase-based pseudovirus titration assay to determine the optimal target cell density for maximum infection. By comparing luminescence across cell densities, the method ensures high assay sensitivity and reproducibility for downstream applications.

Determining Optimal Target Cell Density Using a Luciferase-Based Pseudovirus Infection Assay

Source: Chang, X., et al. Preparation of Pseudo-Typed H5 Avian Influenza Viruses with Calcium Phosphate Transfection Method and Measurement of Antibody Neutralizing Activity. J. Vis. Exp. (2021).This video demonstrates a luciferase-based assay to quantify pseudovirus infection in epithelial cells. The pseudovirus encodes the luciferase gene, which is expressed in infected cells. After washing, and cells are incubated with lysis buffer at an ultra-low temperature, and then thawed to induce lysis.

Assessing Pseudovirus Infection Using Luciferase Reporter Assay

Dieses Video zeigt Mikroneutralisationsassays zur Messung neutralisierender Antikörper mit Hilfe von Madin-Darby Canine Kidney Zellen, die α2,6-verknüpfte Sialinsäure in menschlichen Seren überexprimieren. Dieser Assay wird häufig in der Influenza-Humanserologie...

Ein Mikroneutralisationsassay zur Messung neutralisierender Antikörpertiter im Humanserum

Dieses Video zeigt eine Technik zur Erzeugung von Escape-Varianten von neutralisierenden monoklonalen Antikörpern des Influenzavirus. Antikörper-neutralisierte Virussuspension wird in embryonisierte Hühnereier injiziert, um Fluchtvarianten selektiv zu vermehren. Dies führt zu einer Viruspopulation, die überwiegend aus Escape-Varianten besteht, was durch einen Hämagglutinationsassay bestätigt wurde.

Entstehung von Influenzavirus-Escape-Varianten gegen neutralisierende Antikörper

Diese Studie beschreibt ein   Imaging-basierte Mikroneutralisationstest auf die antigenen Beziehungen zwischen Viren zu analysieren. Das Protokoll verwendet einen Flachbettscanner und hat vier Schritte, einschließlich der Titration Titration Quantifizierung, Neutralisierung und Neutralisierung Quantifizierung. Der Test funktioniert gut mit aktuellen zirkulierenden Influenza A (H1N1) pdm09, A (H3N2) und B-Viren.

Optimierung eines Assay Quantitative Mikroneutralisations

Influenza A-Viren (IAVs) sind wichtige Humanpathogene Atemwege. Die Pathogenität von IAVs verstehen und neuartigen Impfstoff präklinischen Erprobung durchführen, sind Tiermodelle imitiert menschliche Physiologie erforderlich. Hier beschreiben wir Techniken zur Bewertung IAV Pathogenese, humorale Reaktionen und Wirksamkeit des Impfstoffes mit einem Maus-Modell der Infektion.

Influenza-A-Virus-Studien in einem Mausmodell der Infektion

Wir beschreiben eine Methode mit der identifizieren wir kritische Rückstände für die Bindung von menschlichen oder murinen monoklonalen Antikörpern, die die virale Hämagglutinin der Influenza A-Viren Zielen erforderlich. Das Protokoll kann zu anderen Virus Oberfläche Glykoproteine und ihre entsprechenden neutralisierende Antikörper angepasst werden.

Generation von Escape Varianten des Influenza-Virus Monoclonal Antikörper neutralisieren

Grippe neutralisierende Antikörper korrelieren mit dem Schutz der Influenza-Infektionen. Microneutralization Assays messen neutralisierende Antikörper im menschlichen Serum und dienen oft der menschlichen Grippe-Serologie. Wir beschreiben einen Microneutralization-Assay mit MDCK-SIAT1 Zellen um zu messen, neutralisierende Antikörpertiter zu zeitgenössischen 3C.2a und 3C.3a a/H3N2-Viren nach Influenza-Impfung oder Infektion.

Messung der Influenza neutralisierenden Antikörperantworten gegen a/H3N2-Viren im menschlichen Serum von Microneutralization Assays mit MDCK-SIAT1 Zellen

Dieses Protokoll beschreibt einen experimentellen Prozess zur Herstellung hochtiter infektiöser viraler pseudotypisierter Partikel (pp) mit Hüllglykoproteinen aus zwei Influenza-A-Stämmen und wie ihre Infektiosität bestimmt werden kann. Dieses Protokoll ist sehr anpassungsfähig, um pps von jeder anderen Art von umhüllten Viren mit verschiedenen Hüll-Glykoproteinen zu entwickeln.

Herstellung von hochtiterinfektiösen Influenza-Pseudotyppartikeln mit Hülllykoproteinen aus hoch pathogenen H5N1- und Avian H7N9-Viren

Pseudotypisierte Viren (PVs) sind replikationsdefekte Virionen, die verwendet werden, um Wirt-Virus-Interaktionen unter sichereren Bedingungen zu untersuchen als mit authentischen Viren. Hier wird ein detailliertes Protokoll vorgestellt, das zeigt, wie SARS-CoV-2-PVs verwendet werden können, um die neutralisierende Fähigkeit des Serums von Patienten nach einer COVID-19-Impfung zu testen.

Pseudotypisierte Viren als molekulares Werkzeug zur Überwachung humoraler Immunantworten gegen SARS-CoV-2 mittels Neutralisationsassay

Das Protokoll beschreibt eine Methode zur Kultivierung von aviären T-Zellen in vitro , indem Gedächtnis-T-Zellen aus infizierten Enten isoliert werden, was die Erzeugung hochreiner spezifischer Enten-T-Zellen ermöglicht. Darüber hinaus wurde eine intrazelluläre Zytokin-Färbemethode (ICS) etabliert, um die IFN-γ-Sekretion in Enten-T-Zellen genau zu messen.

In vitro Kultur für H5N1-spezifische Enten-T-Zellen und Nachweis von Immunantworten mittels intrazellulärer Zytokin-Färbemethode

Erfahren Sie die Herstellung von H5-Avian-Influenza-Pseudoviren mittels Calciumphosphat-Transfektion in HEK293-FT-Zellen und die Messung der Antikörperneutralisation. Dieses Protokoll ermöglicht die sichere Untersuchung von Immunantworten.

Herstellung von pseudotypisierten H5-Aviären Influenzaviren mit Calciumphosphat-Transfektionsmethode und Messung der Antikörperneutralisationsaktivität (Video) | JoVE Journal

Herstellung von pseudotypisierten H5-Aviären Influenzaviren mit Calciumphosphat-Transfektionsmethode und Messung der Antikörperneutralisationsaktivität

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