Name: Räumliches Profiling der Protein- und RNA-Expression im Gewebe: Ein Ansatz zur Feinabstimmung der virtuellen Mikrodissektion (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-06T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: Erfahren Sie die automatisierte Auswahl von Regions of Interest für Spatial-Omics-Technologien. Diese Methode ermöglicht präzise Protein- und RNA-Profiling in Geweben mit verbesserter Reproduzierbarkeit.

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Die Autoren danken Thomas Wu für die Bearbeitung der NGS-Dateien. Wir danken James Ziai für die Ergebnisdiskussionen und die Überprüfung des Manuskripts und Meredith Triplet und Rachel Taylor für die interne Überarbeitung des Manuskripts.

Alle menschlichen Gewebe wurden von kommerziellen Biobanken oder akkreditierten Gewebebanken unter der Garantie erworben, dass die entsprechende Genehmigung des Institutional Review Board und die Einverständniserklärung eingeholt wurden.
HINWEIS: Das Protokoll wird mit dem Discovery Ultra und dem GeoMx Digital Spatial Profiler durchgeführt. Weitere Informationen zu Reagenzien, Geräten und Software, die in diesem Protokoll verwendet werden, finden Sie in der Materialtabelle .
1. Automatisiertes Visualisierungsprotokoll für räumliche Proteomik-Assays
<ol><li>Programmieren Sie Autostainer zur Anwendung fluoreszierender Visualisierungsantikörper<ol><li>Klicken Sie in der Autostainer-Software auf die Home-Taste und wählen Sie Protokolle. Klicken Sie dann auf Protokolle erstellen/bearbeiten und wählen Sie RUO DISCOVERY Universal als Prozedur aus.</li>
		<li>Klicken Sie auf Erste Sequenz > Deparaffinisierung > Depar v2. Wählen Sie für Mediumstemperatur 72 ° C, klicken Sie dann auf Vorbehandlung und wählen Sie Zellkonditionierung und CC1-Reservoir. Wählen Sie für sehr hohe Temperatur 100 ° C, klicken Sie dann auf CC1 8 Min und klicken Sie weiter, bis CC1 64 Min ausgewählt ist.</li>
		<li>Klicken Sie auf Inhibitor > DISCOVERY Inhibitor und wählen Sie für Inkubationszeit 8 Minuten. Klicken Sie dann auf Antikörper > High Temp Ab Inkubation; für niedrige Temperatur, wählen Sie 37 ° C; Wählen Sie für Antikörper die Antikörpernummer auf dem Etikett des Spenders aus (in diesem Beispiel Antikörper 6); Wählen Sie für Plus Inkubationszeit die Option 32 Minuten aus. HINWEIS: Dieses Protokoll hat drei verschiedene Antikörpernummern. Der erste Antikörper ist FAP, der zweite ist Pan-Cytokeratin und der dritte ist Antikörper X.</li>
		<li>Klicken Sie auf Multimer HRP > Multimer HRP Blocker, wählen Sie dann für Antikörperblockierung die Option Gt Ig Block und für Inkubationszeit die Option 4 Minuten. Wählen Sie als Nächstes unter Multimer HRP Reagenz die Option OMap anti-Rb HRP und für Inkubationszeit 16 Minuten aus. Klicken Sie dann auf Cy5 und wählen Sie für Long Incubation Time (Lange Inkubationszeit) die Option 0 Hr 8 Min.</li>
		<li>Klicken Sie auf Dual Sequence (Dualsequenz ) und wählen Sie Antibody Denaturation, dann Antibody Denature CC2-1 und für Very High Temperature (Sehr hohe Temperatur) die Option 100 °C (Sehr hohe Temperatur). Stellen Sie sicher, dass die Inkubationszeit 8 min beträgt. Klicken Sie anschließend auf DS Inhibitor und wählen Sie Neutralisieren.</li>
		<li>Klicken Sie auf DS Antikörper und wählen Sie für Sehr niedrige Temperatur 37 ° C. Wählen Sie dann unter Antikörper die Antikörpernummer aus dem Spenderetikett aus (in diesem Beispiel Antikörper 3), und wählen Sie für Plus Inkubationszeit die Option 32 Minuten aus.</li>
		<li>Klicken Sie auf DS Multimer HRP und wählen Sie DS Multimer HRP Blocker. Wählen Sie dann für Antikörperblockierung die Option Gt Ig-Block und für Inkubationszeit die Option 4 Minuten aus. Wählen Sie als Nächstes auf Multimer HRP Reagenz OMap Anti-Ms HRP aus, und wählen Sie für Inkubationszeit 16 Minuten aus. Klicken Sie dann auf DS Rhodamine 6G und wählen Sie für Lange Inkubationszeit 0 Std. 8 Min.</li>
		<li>Klicken Sie auf Triple Färbung und wählen Sie TS Antikörper-Denaturierung, dann wählen Sie Antikörper-Denaturierung CC2-2 und für sehr hohe Temperatur wählen Sie 100 ° C. Stellen Sie sicher, dass die Inkubationszeit 8 Minuten beträgt. Klicken Sie anschließend auf TS-Inhibitor und wählen Sie TS Neutralisieren.</li>
		<li>Klicken Sie auf TS-Antikörper und wählen Sie für Sehr niedrige Temperatur 37 ° C aus. Wählen Sie dann unter Antikörper die Antikörpernummer aus dem Spenderetikett aus (in diesem Beispiel Antikörper 7), und wählen Sie für Plus Inkubationszeit die Option 32 Minuten aus.</li>
		<li>Klicken Sie auf TS Multimer HRP und wählen Sie TS Multimer HRP Blocker. Wählen Sie dann für Antikörperblockierung die Option Gt Ig Block und für Inkubationszeit die Option 4 Minuten. Wählen Sie als Nächstes unter Multimer HRP Reagenz die Option OMap anti-Rb HRP und für Inkubationszeit 16 Minuten aus. Klicken Sie dann auf TS FAM und wählen Sie für Long Incubation Time (Lange Inkubationszeit) 0 Hr 8 Min.</li>
		<li>Fügen Sie dem Protokoll einen Titel hinzu. Wählen Sie eine Protokollnummer aus, fügen Sie einen Kommentar hinzu und klicken Sie auf Aktiv und dann auf Speichern.</li>
	</ol></li>
	<li>Vorbereiten von Dias, Drucken von Etiketten und Starten des Autostainer-Laufs<ol><li>Der Backverkäufer beschaffte FFPE (Formalin-fixierte, paraffineingebettete) menschliche Gewebeschnitte in einem Ofen, der 20-60 Minuten auf 70 °C eingestellt war. Drucken Sie Etiketten aus, indem Sie in der Autostainer-Software auf "Etikett erstellen " klicken. Klicken Sie anschließend auf Protokolle, wählen Sie die Protokollnummer aus und klicken Sie auf Schließen/Drucken. Fügen Sie relevante Informationen auf dem Folienetikett hinzu und klicken Sie auf Drucken.</li>
		<li>Dias aus dem Ofen nehmen und auf Raumtemperatur (RT) abkühlen lassen. Wenden Sie die zuvor gedruckten Protokollbeschriftungen auf die entsprechenden Folien an.</li>
		<li>Beladen Sie nachfüllbare Antikörperspender mit Antikörpern gemäß der in Schritt 1.1 zugewiesenen Antikörper-Kennzeichnungsnummer. Verwenden Sie in diesem Protokoll Antikörper 6 für FAP bei 1 μg/ml, verwenden Sie Antikörper 3 für Pan-Zytokeratin bei 0,1 μg/ml und verwenden Sie Antikörper 7 für Antikörper X bei 2,5 μg/ml. Verdünnen Sie jeden Antikörper in dem angegebenen Verdünnungsmittel und bereiten Sie die nachfüllbaren Antikörperspender vor.</li>
		<li>Sammeln Sie die oben genannten vorgefüllten Reagenzienspender zum Blockieren, Erkennen und Verstärken und legen Sie sie auf ein Reagenzienfach. Laden Sie die Folien in die Folienfächer (bis zu 30 Folien pro Durchlauf) und klicken Sie auf Ausführen und dann auf Ja. Beachten Sie, dass DAPI nicht für die nukleare Gegenfärbung verwendet wird.</li>
		<li>Bestätigen Sie den Start des Laufs, indem Sie die Laufdauer in der Autostainer-Software überprüfen. Das Protokoll dauert ~11 h für die Fertigstellung und kann über Nacht ausgeführt werden.</li>
		<li>Stellen Sie am nächsten Tag sicher, dass der Lauf abgeschlossen ist, indem Sie grüne Blinklichter an den Schiebefachschlitzen beobachten. Nehmen Sie dann die Objektträger vom Gerät ab und spülen Sie die Objektträger kräftig in 1x Reaktionspuffer, bis die flüssige Deckglaslösung vollständig entfernt ist.</li>
	</ol></li>
	<li>Räumliches Profiling-Plattformprotokoll für Proteomik-Assays<ol><li>Befolgen Sie das räumliche Proteomik-Protokoll, das in der folgenden Anmerkung angegeben ist. Nehmen Sie die folgenden Änderungen am Protokoll vor, um das automatisierte 3-Plex-Kennzeichnungsverfahren zu aktivieren.</li>
		<li>Führen Sie die Schritte 1.2.1 bis 1.2.6 am Tag vor dem Start des räumlichen Proteomikprotokolls durch und fahren Sie nach dem Ausführen von Schritt 1.2.6 direkt mit dem Antigenabrufschritt des räumlichen Proteomikprotokolls fort. Lassen Sie das im Spatial Profiling Proteomics-Protokoll beschriebene Visualisierungsverfahren weg.</li>
		<li>Ersetzen Sie SYTO 13 durch SYTO 64 bei 5000 nM, um die Fluorophorintegration zu ermöglichen. SYTO 64 in 1x TBS verdünnen und 15 min in einer Feuchtigkeitskammer inkubieren.</li>
		<li>Wählen Sie beim Einrichten der Scanparameter in der räumlichen Profilierungsplattform die Filter und Fokussierkanäle entsprechend den im Visualisierungspanel verwendeten Fluorophoren aus, um eine 3-Plex-Integration zu ermöglichen. Verwenden Sie FITC für DISCOVERY FAM und stellen Sie die Belichtung auf 200 ms ein, verwenden Sie Cy3 für DISCOVERY Rhodamin 6G und stellen Sie die Belichtung auf 200 ms ein, verwenden Sie Texas Red für SYTO 64 und stellen Sie die Belichtung auf 50 ms ein (geben Sie dies als Fokuskanal an), und verwenden Sie schließlich Cy5 für DISCOVERY Cy5, stellen Sie die Belichtung auf 200 ms ein, und speichern Sie die Änderungen. HINWEIS: Detaillierte Anweisungen zum Proteomik-Protokoll für räumliche Profilerstellung finden Sie auf der offiziellen Support-Registerkarte der Website, indem Sie Dokumentation > Benutzerhandbücher auswählen. Suchen Sie hier nach dem Proteinprotokoll für nCounter mit Bond RX.</li>
	</ol></li>
</ol>2. ROI-Auswahl für räumliche Transkriptomik-Assays
<ol><li>FFPE-Zellpelletabschnitte in einem auf 70 °C eingestellten Ofen für 20-60 min backen. Befolgen Sie das NGS-Protokoll der räumlichen Profilierungsplattform, das in der folgenden Anmerkung angegeben ist, und scannen Sie Objektträger auf der räumlichen Profilierungsplattform, wobei Sie Größen von 50 μm und 300 μm auswählen. Die folgende Empfehlung wird für den räumlichen Transkriptomik-Assay hervorgehoben:<ol><li>Wenn beim Vorbereiten der Bibliothek verschiedene Größen von ROIs ausgewählt wurden, fassen Sie ROIs ähnlicher Größe zusammen, um eine Bibliothek pro Größe zu erstellen. Damit soll sichergestellt werden, dass ausreichende Sequenziertiefen für alle ROIs ohne Verzerrung durch die Größe erreicht werden. HINWEIS: Detaillierte Anweisungen zur räumlichen Profilerstellungsplattform finden Sie auf der offiziellen Registerkarte "Support" auf der Website, indem Sie " Dokumentation" > "Benutzerhandbücher" auswählen. Suchen Sie hier nach dem RNA-Protokoll für NGS-Anwendungen mit Bond RX.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Nerurkar, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+spatial+profiling+of+cancer+tissues+in+the+era+of+immunotherapy%3A+The+potential+and+promise%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Transcriptional spatial profiling of cancer tissues in the era of immunotherapy: The potential and promise.</a> Cancers. 12 (9), 2572(2020).</li>
<li>Decalf, J., Albert, M. L., Ziai, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+tools+for+pathology%3A+a+user%27s+review+of+a+highly+multiplexed+method+for+in+situ+analysis+of+protein+and+RNA+expression+in+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">New tools for pathology: a user's review of a highly multiplexed method for in situ analysis of protein and RNA expression in tissue.</a> Journal of Pathology. 247 (5), 650-661 (2019).</li>
<li>McGinnis, L. M., Ibarra-Lopez, V., Rost, S., Ziai, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+and+research+applications+of+multiplexed+immunohistochemistry+and+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Clinical and research applications of multiplexed immunohistochemistry and in situ hybridization.</a> Journal of Pathology. 254 (4), 405-417 (2021).</li>
<li>NanoString. GeoMx Digital Spatial Profiler. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://nanostring.com/products/geomx-digital-spatial-profiler/geomx-dsp-overview">https://nanostring.com/products/geomx-digital-spatial-profiler/geomx-dsp-overview</a> (2022).</li>
<li>NanoString. GeoMx Digital Spatial Profiler. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://nanostring.com/wp-content/uploads/BR_MK0981_GeoMx_Brochure_r19_FINAL_Single_WEB.pdf">https://nanostring.com/wp-content/uploads/BR_MK0981_GeoMx_Brochure_r19_FINAL_Single_WEB.pdf</a> (2022).</li>
<li>McCart Reed, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+spatial+profiling+application+in+breast+cancer%3A+a+user%27s+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Virchows+Arch%3A+An+International+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Digital spatial profiling application in breast cancer: a user's perspective.</a> Virchows Arch: An International Journal of Pathology. 477 (6), 885-890 (2020).</li>
<li>McNamara, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+proteomic+characterization+of+HER2-positive+breast+tumors+through+neoadjuvant+therapy+predicts+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cancer%22%5BJournal%5D)">Spatial proteomic characterization of HER2-positive breast tumors through neoadjuvant therapy predicts response.</a> Nature Cancer. 2 (4), 400-413 (2021).</li>
<li>Kim, S. W., Roh, J., Park, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemistry+for+pathologists%3A+Protocols%2C+pitfalls%2C+and+tips%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pathology+and+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemistry for pathologists: Protocols, pitfalls, and tips.</a> Journal of Pathology and Translational Medicine. 50 (6), 411-418 (2016).</li>
<li>Muñoz, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecularly+targeted+photothermal+ablation+improves+tumor+specificity+and+immune+modulation+in+a+rat+model+of+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecularly targeted photothermal ablation improves tumor specificity and immune modulation in a rat model of hepatocellular carcinoma.</a> Communications Biology. 3 (1), 783(2020).</li>
<li>Coleman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyaluronidase+impairs+neutrophil+function+and+promotes+Group+B+Streptococcus+invasion+and+preterm+labor+in+nonhuman+primates%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Hyaluronidase impairs neutrophil function and promotes Group B Streptococcus invasion and preterm labor in nonhuman primates.</a> mBio. 12 (1), 03115-03120 (2021).</li>
<li>Gupta, S., Zugazagoitia, J., Martinez-Morilla, S., Fuhrman, K., Rimm, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+quantitative+assessment+of+PD-L1+using+digital+spatial+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%3B+A+Journal+of+Technical+Methods+and+Pathology%22%5BJournal%5D)">Digital quantitative assessment of PD-L1 using digital spatial profiling.</a> Laboratory Investigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 100 (10), 1311-1317 (2020).</li>
<li>Carter, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+and+spatially+defined+immune+%28micro%29landscapes+of+early-stage+PD-L1-positive+triple-negative+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Characteristics and spatially defined immune (micro)landscapes of early-stage PD-L1-positive triple-negative breast cancer.</a> Clinical Cancer Research. 27 (20), 5628-5637 (2021).</li>
<li>Busse, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoprofiling+in+neuroendocrine+neoplasms+unveil+immunosuppressive+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Immunoprofiling in neuroendocrine neoplasms unveil immunosuppressive microenvironment.</a> Cancers. 12 (11), 3448(2020).</li>
<li>Kulasinghe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+of+lung+SARS-CoV-2+and+influenza+virus+infection+dissects+virus-specific+host+responses+and+gene+signatures%5BTitle%5D)+AND+%22European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Profiling of lung SARS-CoV-2 and influenza virus infection dissects virus-specific host responses and gene signatures.</a> European Respiratory Journal. 59 (1), (2021).</li>
<li>Li, X., Wang, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+bulk%2C+single-cell+to+spatial+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Oral+Science%22%5BJournal%5D)">From bulk, single-cell to spatial RNA sequencing.</a> International Journal of Oral Science. 13 (36), (2021).</li>
<li>Merritt, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+digital+spatial+profiling+of+proteins+and+RNA+in+fixed+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Multiplex digital spatial profiling of proteins and RNA in fixed tissue.</a> Nature Biotechnology. 38 (5), 586-599 (2020).</li>
<li>Van, T. M., Blank, C. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+user%27s+perspective+on+GeoMxTM+digital+spatial+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Immuno-Oncology+Technology%22%5BJournal%5D)">A user's perspective on GeoMxTM digital spatial profiling.</a> Immuno-Oncology Technology. 1, 11-18 (2019).</li>
<li>Introduction to GeoMx Normalization: Protein. White Paper. Nanostring. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://nanostring.com/wp-content/uploads/MK2593_GeoMx_Normalization-Protein.pdf">https://nanostring.com/wp-content/uploads/MK2593_GeoMx_Normalization-Protein.pdf</a> (2020).</li>
<li>Bergholtz, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Best+practices+for+spatial+profiling+for+breast+cancer+research+with+the+geomx+spatial+profiler%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Best practices for spatial profiling for breast cancer research with the geomx spatial profiler.</a> Cancers. 13 (17), 4456(2021).</li>
<li>Hwang, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleus+and+spatial+transcriptomics+of+archival+pancreatic+cancer+reveals+multi-compartment+reprogramming+after+neoadjuvant+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22BioRxiv%22%5BJournal%5D)">Single-nucleus and spatial transcriptomics of archival pancreatic cancer reveals multi-compartment reprogramming after neoadjuvant treatment.</a> BioRxiv. , (2020).</li>
<li>Jerby-Arnon, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opposing+immune+and+genetic+mechanisms+shape+oncogenic+programs+in+synovial+sarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Opposing immune and genetic mechanisms shape oncogenic programs in synovial sarcoma.</a> Nature Medicine. 27 (2), 289-300 (2021).</li>
</ol>

Veronica Ibarra-Lopez, Sangeeta Jayakar, Yeqing Angela Yang, Zora Modrusan und Sandra Rost sind Mitarbeitende und Aktionäre von Genentech, einem Unternehmen der Roche-Gruppe. Andere Unternehmen, die zu Roche gehören, stellen Reagenzien und Instrumente her, die in diesem Manuskript verwendet werden. Ciara Martin ist eine Vollzeitangestellte von NanoString Technologies Inc., die Reagenzien und Instrumente herstellt, die in diesem Manuskript verwendet werden.

Bis heute werden direkt konjugierte fluoreszierende Antikörper in einem manuellen Protokoll am häufigsten als Visualisierungspanels für räumliche Proteomik oder räumliche Transkriptomik-Assaysverwendet 9,10. Die Verwendung von direkt konjugierten fluoreszierenden Antikörpern kann jedoch für weniger häufig vorkommende Marker eine Herausforderung darstellen, was die Auswahl geeigneter Antikörper einschränkt. Dieses Protokoll zeigt, dass die Markierung von Visualisi...

Fortschritte in Multiplexing-Techniken bieten weiterhin bessere Charakterisierungswerkzeuge für Targets in Tumoren. Die Tumormikroumgebung (TME) ist ein komplexes System aus Tumorzellen, infiltrierenden Immunzellen und Stroma, in dem räumliche Informationen entscheidend sind, um die Interaktionsmechanismen zwischen Biomarkern von Interesse besser zu verstehen und zu interpretieren1. Mit neuen Techniken wie dem GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP) und 10x Visium können mehrere Ziele gleichzeitig in ihrem räumlichen Kontext erkannt und quantifiziert werden. Die Verwendung von Immunfluoreszenzprotokollen, die die Visualisierung von Gewebe erleichtern, kann die räumlichen Profilierungsfähigkeiten dieser Technologien weiter verbessern.
Die Spatial Omics-Technologie, auf die wir uns für diese Methodenentwicklung konzentriert haben, besteht aus räumlichen Proteomik- und Transkriptomik-Assays, bei denen Oligonukleotide über einen UV-empfindlichen photospaltbaren Linker an Antikörper oder RNA-Sonden gebunden werden. Histologische Objektträger werden mit diesen oligokonjugierten Antikörpern oder Sonden markiert und dann auf der räumlichen Profilierungsplattform abgebildet. Als nächstes werden ROIs unterschiedlicher Größe und Form für die Beleuchtung ausgewählt, und die photogespaltenen Oligonukleotide werden abgesaugt und in einer 96-Well-Platte gesammelt. Die photogespaltenen Oligonukleotide können entweder mit dem Nanostring nCounter-System oder mit Next Generation Sequencing (NGS)2,3 quantifiziert werden (Abbildung 1)4,5.
Die Zellverteilungen variieren innerhalb von Geweben, und die Fähigkeit, bestimmte Positionen von Zellen mit ausgewählten Markern und unterschiedlichen ROI-Größen zu charakterisieren, ist von großer Bedeutung, um die Gewebeumgebung vollständig zu verstehen und spezifische Merkmale zu identifizieren. In der hier erwähnten Spatial Omics-Technologie verwendet das Standard-Visualisierungsprotokoll direkt konjugierte Antikörper und ist ein manuelles Protokoll. Die Standardmarker zur Unterscheidung zwischen Tumor und Stroma sind panCytokeratin (panCK) und CD456,7, aber zusätzliche Marker sind notwendig, um spezifische Zellpopulationen von Interesse anzusprechen. Darüber hinaus fehlt der Verwendung von direkt konjugierten fluoreszierenden Antikörpern die Amplifikation, was die Antikörperselektion auf reichlich vorhandene Marker beschränkt. Darüber hinaus unterliegen manuelle Assays einer größeren Variabilität als automatisierte Workflows8. Daher ist es wünschenswert, ein anpassbares, automatisiertes und erweitertes Visualisierungsprotokoll für die ROI-Auswahl zu haben.
Hier zeigt die Studie, dass die TSA-Technologie für räumliche Proteomik-Assays für Visualisierungsprotokolle auf einer automatisierten Plattform verwendet werden kann, was zu einem gezielteren und standardisierteren Assay führt. Darüber hinaus ermöglichen TSA-basierte Assays die Verwendung von Markern mit geringer Expression, wodurch der Bereich der Ziele, die für die Visualisierung ausgewählt werden können, erweitert wird. Ein 3-Plex-Assay für panCK, FAP und Antikörper X wurde unter Verwendung einer automatisierten Plattform entwickelt, auf der panCK und FAP zur Unterscheidung zwischen Tumor und Stroma verwendet wurden. Antikörper X ist ein Stromaprotein, das häufig in Tumoren vorkommt, aber seine Biologie und sein Einfluss auf die Anti-Tumor-Immunität sind nicht vollständig verstanden. Die Charakterisierung des Immunkontexts in Gebieten, die reich an Antikörper X sind, kann seine Rolle bei der Antitumorimmunität und der therapeutischen Reaktion sowie sein Potenzial als Wirkstoffziel aufklären.
Während sich kundenspezifische automatisierte TSA-Visualisierungspanels für räumliche Proteomik-Assays als erfolgreich erwiesen, konnte die Anwendung dieser Assays für räumliche Transkriptomik-Assays nicht bestätigt werden. Dies ist höchstwahrscheinlich auf die Reagenzien und das Protokoll zurückzuführen, die für die automatisierten Visualisierungsprotokolle verwendet werden, die die RNA-Integrität zu beeinträchtigen scheinen. Die Erkenntnis, dass ein automatisiertes Markierungsprotokoll für Visualisierungsmarker für räumliche Proteomik-Assays, nicht aber für räumliche Transkriptomik-Assays verwendet werden kann, bietet eine wichtige Orientierungshilfe für Assay-Designs der Spatial Omics-Technologie.
Darüber hinaus zeigt die Studie, dass der räumliche Transkriptomik-Assay verwendet werden kann, um Ziele in Regionen mit einem Durchmesser von nur 50 μm oder etwa 15 Zellen zu profilieren. Es wurden zwei unterschiedlich große ROIs ausgewählt, um die Fähigkeit des Assays zu testen, auch Transkripte in kleinen ROIs zu erkennen. Für jede Region von Interesse wurden Oligos, die 1.800 mRNA-Zielen entsprachen, gesammelt und gemäß dem Protokoll der räumlichen Profiling-Plattform in Bibliotheken umgewandelt. Bibliotheken wurden einzeln indiziert, anschließend gepoolt und sequenziert. Dies ermöglichte die Bewertung sowohl der Pooling-Effizienz als auch der Fähigkeit, spezifische Zellpopulationen in kleinen ROIs zu identifizieren.
Diese Arbeit zeigt, dass für räumliche Proteomik-Assays ein automatisiertes Protokoll zur Steuerung der ROI-Auswahl auf bestimmten Markern von Interesse verwendet werden kann, um die Abfrage relevanter Gewebebereiche selektiv zu steuern und die räumliche Umgebung des Gewebes zu charakterisieren. Darüber hinaus zeigen wir, dass kleinere ROIs für räumliche transkriptomische Assays verwendet werden können, um spezifische Zellpopulationen zu detektieren und zu charakterisieren.

<table><tbody><tr><td>10x Tris gepufferte Kochsalzlösung (TBS)</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>12498S</td><td>Verdünnt auf 1x TBS in DEPC-behandeltem Wasser</td></tr><tr><td>Antikörper X (nicht offengelegt)</td><td></td><td></td><td>Antikörper verblindet aufgrund von Vertraulichkeit</td></tr><tr><td>DEPC-behandeltes Wasser</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9922</td><td>Ein anderer kann verwendet werden</td></tr><tr><td>DISCOVERY Cell Conditioning (CC1)</td><td>Ventana</td><td>950-500</td><td></td></tr><tr><td>DISCOVERY Cy5 Kit</td><td>Ventana</td><td>760-238</td><td>bezeichnet als Cy5</td></tr><tr><td>DISCOVERY FAM Kit</td><td>Ventana</td><td>760-243</td><td>bezeichnet als FAM</td></tr><tr><td>DISCOVERY Goat Ig Block</td><td>Ventana</td><td>760-6008</td><td>bezeichnet als Gt Ig Block</td></tr><tr><td>DISCOVERY OmniMap anti-Ms HRP</td><td>Ventana</td><td>760-4310</td><td>bezeichnet als OMap anti-Ms HRP</td></tr><tr><td>DISCOVERY OmniMap anti-RB</td><td>HRP Ventana</td><td>760-4311</td><td>Bezeichnet als OMap anti-Rb HRP</td></tr><tr><td>DISCOVERY Rhodamin 6G Kit</td><td>Ventana</td><td>760-244</td><td>Bezeichnet als Rhodamin 6G</td></tr><tr><td>DISCOVERY ULTRA Automated Slide Preparation System</td><td>Ventana</td><td>05 987 750 001 / N750-DISU-FS</td><td>Auf dem Manuskript als Autostainer bezeichnet</td></tr><tr><td>FAP [EPR20021] Antikörper</td><td>Abcam</td><td>Ab207178</td><td></td></tr><tr><td>GeoMx Digital Spatial Profiler</td><td>NanoString</td><td>GMX-DSP-1Y</td><td>Bezeichnet als räumliche Profilierungsplattform auf dem Manuskript</td></tr><tr><td>Feuchtigkeitskammer</td><td>Simport</td><td>M920-2</td><td>Ein anderer kann verwendet werden</td></tr><tr><td>: Pan-Cytokeratin [AE1/AE3] Antikörper</td><td>Abcam</td><td>Ab27988</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Eindeckmittel</td><td>ThermoFisher</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>Python</td><td>Python</td><td></td><td>Statistische Analyse</td></tr><tr><td>Reaktionspuffer (10x)</td><td>Ventana</td><td>950-300</td><td></td></tr><tr><td>Software für die statistische Analyse</td><td>GraphPad</td><td>Prism 7</td><td>Statistische Analyse</td></tr><tr><td>SYTO 64</td><td>ThermoFisher</td><td>S11346</td><td></td></tr><tr><td>ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC2)</td><td>Ventana</td><td>950-223</td><td></td></tr><tr><td>Ventana Antikörper-Verdünnungsmittel mit Casein</td><td>Ventana</td><td>760-219</td><td>Im Manuskript</td></tr> <tr><td>als angegebenes Verdünnungsmittel bezeichnetVentana Primärantikörper-Dispenser</td><td>Ventana</td><td></td><td>Die Katalognummer hängt von der Spendernummer ab</td></tr></tbody></table>

räumliches profiling der protein- und rna-expression im gewebe: ein ansatz zur feinabstimmung der virtuellen mikrodissektion

Spatial Profiling of Protein and RNA Expression in Tissue: An Approach to Fine-Tune Virtual Microdissection

Multiplexing ermöglicht die Beurteilung mehrerer Marker auf demselben Gewebe bei gleichzeitiger Bereitstellung eines räumlichen Kontextes. Spatial Omics-Technologien ermöglichen sowohl Protein- als auch RNA-Multiplexing, indem sie photospaltbare oligomarkierte Antikörper bzw. Sonden nutzen. Oligos werden aus bestimmten Regionen des Gewebes gespalten und quantifiziert, um die zugrunde liegende Biologie aufzuklären. Hier zeigt die Studie, dass automatisierte benutzerdefinierte Antikörper-Visualisierungsprotokolle verwendet werden können, um die ROI-Auswahl in Verbindung mit räumlichen Proteomik-Assays zu steuern. Diese spezifische Methode zeigte keine akzeptable Leistung bei räumlichen Transkriptomik-Assays. Das Protokoll beschreibt die Entwicklung eines 3-Plex-Immunfluoreszenz-Assays (IF) für die Markervisualisierung auf einer automatisierten Plattform unter Verwendung von Tyramid-Signalamplifikation (TSA), um das Fluoreszenzsignal von einem bestimmten Proteinziel zu verstärken und den Antikörperpool zur Auswahl zu erhöhen. Das Visualisierungsprotokoll wurde mit einem gründlich validierten 3-Plex-Assay automatisiert, um Qualität und Reproduzierbarkeit sicherzustellen. Darüber hinaus wurde der Austausch von DAPI gegen SYTO-Farbstoffe evaluiert, um die Bildgebung von TSA-basierten IF-Assays auf der räumlichen Profilierungsplattform zu ermöglichen. Darüber hinaus testeten wir die Fähigkeit, kleine ROIs mit dem räumlichen Transkriptomik-Assay auszuwählen, um die Untersuchung hochspezifischer Interessengebiete zu ermöglichen (z. B. Bereiche, die für einen bestimmten Zelltyp angereichert sind). Es wurden ROIs von 50 μm und 300 μm Durchmesser gesammelt, was etwa 15 Zellen bzw. 100 Zellen entspricht. Die Proben wurden in Bibliotheken umgewandelt und sequenziert, um die Fähigkeit zu untersuchen, Signale von kleinen ROIs und profilspezifischen Regionen des Gewebes zu erkennen. Wir haben festgestellt, dass räumliche Proteomik-Technologien stark von automatisierten, standardisierten Protokollen profitieren, um die ROI-Auswahl zu steuern. Obwohl dieses automatisierte Visualisierungsprotokoll nicht mit räumlichen Transkriptomik-Assays kompatibel war, konnten wir testen und bestätigen, dass bestimmte Zellpopulationen auch bei kleinen ROIs mit dem standardmäßigen manuellen Visualisierungsprotokoll erfolgreich nachgewiesen werden können.

Automatisiertes Visualisierungsprotokoll zur Steuerung der ROI-Auswahl In diesem Artikel stellen wir die Verwendung eines automatisierten, benutzerdefinierten TSA-basierten IF-Protokolls vor, um das Gewebe zu visualisieren und spezifische ROIs auszuwählen. Die Entwicklung von Visualisierungspanels unter Verwendung von Melanomen und normaler menschlicher Haut als Kontrollgewebe bestand aus Epitopstabilitätstests, Feinabstimmung der Markerintensitäten und Durchblutungsbewertung durch Leave-One-Out-Kontr...

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Feinabstimmung von Regions of Interest (ROIs) für Spatial Omics-Technologien, um die Tumormikroumgebung besser zu charakterisieren und spezifische Zellpopulationen zu identifizieren. Für Proteomik-Assays können automatisierte, angepasste Protokolle die ROI-Auswahl leiten, während Transkriptomik-Assays mit ROIs von nur 50 μm fein abgestimmt werden können.

Räumliches Profiling der Protein- und RNA-Expression im Gewebe: Ein Ansatz zur Feinabstimmung der virtuellen Mikrodissektion

Multiplexing enables the assessment of several markers on the same tissue while providing spatial context. Spatial Omics technologies allow both protein ...

Dieses Protokoll hilft bei der Auswahl von Regionen von Interesse für Spatial Omics-Technologien, was eine gezieltere Charakterisierung von Geweben oder Zellpopulationen ermöglicht. Ein automatisiertes Protokoll für die ROI-Selektion in Proteomik-Assays ist robuster und reproduzierbarer als manuelle Protokolle, und die Verwendung von 50-Mikrometer-ROIs für Transkriptomik-Assays ermöglicht die Profilierung spezifischer Zellpopulationen. Beginnen Sie mit der Programmierung des Autostainers zum Auftragen von Fluoreszenz-Visualisierungsantikörpern.Klicken Sie in der Autostainer-Software auf die Home-Taste und wählen Sie Protokolle. Klicken Sie dann auf Protokolle erstellen/bearbeiten und wählen Sie RUO Discovery Universal als Prozedur aus. Klicken Sie auf Erste Sequenz und wählen Sie dann Deparaffinazation, gefolgt von Depar v2.Wählen Sie für Mediumstemperatur 72 Grad Celsius, klicken Sie dann auf Vorbehandlung und wählen Sie Zellkonditionierung und CC1-Reservoir. Wählen Sie für "Sehr hohe Temperatur" 100 Grad Celsius, klicken Sie dann auf CC1 acht Minuten und klicken Sie weiter, bis CC1 64 Minuten ausgewählt ist. Klicken Sie auf Inhibitor, wählen Sie dann DISCOVERY Inhibitor und wählen Sie für Inkubationszeit acht Minuten aus.Klicken Sie dann auf Antikörper, gefolgt von Hochtemperatur-Antikörper-Inkubation. Wählen Sie für niedrige Temperatur 37 Grad Celsius. Wählen Sie für Antikörper den ANTIKÖRPER 6 aus dem Spenderetikett aus.Wählen Sie für Plus Inkubationszeit 32 Minuten aus. Klicken Sie auf Multimer HRP und wählen Sie dann Multimer HRP Blocker. Wählen Sie dann für Antikörperblockierung die Option Gt Ig Block.Wählen Sie für Inkubationszeit vier Minuten aus. Wählen Sie als Nächstes für Multimer HRP Reagenz OMap Anti-Rb HRP aus, und wählen Sie für Inkubationszeit 16 Minuten aus. Klicken Sie dann auf Cy5 und wählen Sie für Lange Inkubationszeit null Stunde, acht Minuten.Klicken Sie auf Dual Sequence und wählen Sie Antikörper-Denaturierung. Wählen Sie dann Antikörper-Denaturierung CC2-1 und für eine sehr hohe Temperatur 100 Grad Celsius. Stellen Sie sicher, dass die Inkubationszeit acht Minuten beträgt.Klicken Sie anschließend auf DS Inhibitor und wählen Sie Neutralisieren. Klicken Sie auf DS Antikörper und wählen Sie für Sehr niedrige Temperatur 37 Grad Celsius. Wählen Sie dann unter Antikörper die Option ANTIKÖRPER 3 aus dem Spenderetikett aus.Wählen Sie für Plus Inkubationszeit 32 Minuten aus. Klicken Sie auf DS Multimer HRP und wählen Sie DS Multimer HRP Blocker. Wählen Sie dann für Antikörperblockierung die Option Gt Ig-Block und für Inkubationszeit vier Minuten aus.Wählen Sie als Nächstes auf Multimer HRP Reagenz OMap Anti-Ms HRP aus, und wählen Sie für Inkubationszeit 16 Minuten aus. Klicken Sie dann auf DS Rhodamine 6G und wählen Sie für Lange Inkubationszeit null Stunde, acht Minuten. Klicken Sie auf Triple Färbung und wählen Sie TS Antikörper-Denaturierung, dann wählen Sie Antikörper-Denaturierung CC2-2 und für Sehr hohe Temperatur wählen Sie 100 Grad Celsius.Stellen Sie sicher, dass die Inkubationszeit acht Minuten beträgt. Klicken Sie anschließend auf TS-Inhibitor und wählen Sie TS Neutralisieren. Klicken Sie auf TS-Antikörper und wählen Sie für Sehr niedrige Temperatur 37 Grad Celsius aus.Wählen Sie dann unter Antikörper den ANTIKÖRPER 7 auf dem Etikett des Spenders aus, und wählen Sie für Plus Inkubationszeit 32 Minuten aus. Klicken Sie auf TS Multimer HRP und wählen Sie TS Multimer HRP Blocker. Wählen Sie dann für Antikörperblockierung die Option Gt Ig-Block und für Inkubationszeit vier Minuten aus.Wählen Sie als Nächstes für Multimer HRP Reagenz OMap Anti-Rb HRP und für Inkubationszeit 16 Minuten aus. Klicken Sie dann auf TS FAM und wählen Sie für Lange Inkubationszeit die Option Null Stunde, acht Minuten. Klicken Sie auf Speichern und fügen Sie dem Protokoll einen Titel hinzu.Wählen Sie eine Protokollnummer aus, fügen Sie einen Kommentar hinzu und klicken Sie auf Aktiv, gefolgt von Speichern. Backen Sie vom Hersteller beschaffte formalinfixierte, in Paraffin eingebettete menschliche Gewebeschnitte in einem Ofen, der auf 70 Grad Celsius eingestellt ist, für 20 bis 60 Minuten. Drucken Sie Etiketten aus, indem Sie in der Autostainer-Software auf "Etikett erstellen" klicken.Klicken Sie anschließend auf Protokolle, wählen Sie die Protokollnummer aus und klicken Sie auf Schließen/Drucken. Fügen Sie relevante Informationen auf dem Folienetikett hinzu und klicken Sie auf Drucken. Dias aus dem Ofen nehmen und auf Raumtemperatur abkühlen lassen.Wenden Sie die zuvor gedruckten Protokollbeschriftungen auf die entsprechenden Folien an. Beladen Sie nachfüllbare Antikörperspender mit Antikörpern entsprechend den Antikörper-Label-Nummern. Verdünnen Sie jeden Antikörper in dem angegebenen Verdünnungsmittel und bereiten Sie die nachfüllbaren Antikörperspender vor.Sammeln Sie vorgefüllte Reagenzienspender zum Blockieren, Erkennen und Verstärken und legen Sie sie auf das Reagenzienfach des Instruments. Laden Sie die Folien in die Folienschubladen und klicken Sie auf Ausführen, gefolgt von Ja. Bestätigen Sie den Start des Laufs, indem Sie die Laufdauer in der Autostainer-Software überprüfen.Stellen Sie am nächsten Tag sicher, dass der Lauf abgeschlossen ist, indem Sie die grün blinkenden Lichter an den Schubladenschlitzen beobachten. Nehmen Sie dann die Objektträger vom Gerät ab und spülen Sie die Objektträger kräftig in 1x Reaktionspuffer ab, bis die flüssige Deckglaslösung vollständig entfernt ist. Ersetzen Sie SYTO 13 durch SYTO 64 bei 5.000 Nanomolaren, um die Integration von Fluorophoren zu ermöglichen.SYTO 64 in 1x TB verdünnen und 15 Minuten in einer Feuchtigkeitskammer inkubieren. Verwenden Sie FITC für DISCOVERY Fam und stellen Sie die Belichtung auf 200 Millisekunden ein. Verwenden Sie Cy3 für DISCOVERY Rhodamine 6G und stellen Sie die Belichtung auf 200 Millisekunden ein.Verwenden Sie Texas Red für SYTO 64 und stellen Sie die Belichtung auf 50 Millisekunden ein. Geben Sie SYTO 64 als Fokuskanal an und verwenden Sie schließlich Cy5 für DISCOVERY Cy5. Stellen Sie die Belichtung auf 200 Millisekunden ein und speichern Sie die Änderungen.Backen Sie formalinfixierte, in Paraffin eingebettete Zellpelletabschnitte in einem Ofen, der auf 70 Grad Celsius eingestellt ist, für 20 bis 60 Minuten. Scannen Sie Objektträger auf der räumlichen Profilierungsplattform und wählen Sie Größen von 50 Mikrometern und 300 Mikrometern aus. Das automatisierte Visualisierungsprotokoll wurde entwickelt, indem es Steuerelemente zum Auslassen von Eins enthält, um zu bestätigen, dass es kein Durchbluten von den benachbarten Kanälen gab.Die Log-2-Heatmap aller Marker, die im räumlichen Proteomik-Assay enthalten sind und das manuelle Pan-Cytokeratin-CD-45-Protokoll in Schwarz mit dem automatisierten 3-Plex-Protokoll in Grau vergleichen, zeigt einen Spearman-R-Wert von 0,88. Von den 31 Antikörpern, die in den Assays verwendet wurden, hatten 23 Antikörper einen Spearman-R-Wert größer oder gleich 0,5. Die Log-2-Heatmap ausgewählter Ziele, die im räumlichen Transkriptomik-Assay enthalten waren, der das manuelle Pan-Cytokeratin-CD-45-Protokoll in Schwarz mit dem automatisierten 3-Plex-Protokoll in Grau verglich, zeigte Unterschiede in diesen Werten.Die Sequenzierungsdaten für das automatisierte 3-Plex-Visualisierungsprotokoll wiesen im Vergleich zum manuellen Visualisierungsprotokoll Pan-Cytokeratin CD 45 niedrigere Werte auf, was sich auch in den niedrigen Spearman-R-Werten von 0,15 widerspiegelt. Außerdem wurde ein Verlust des Dynamikbereichs beobachtet, wenn das automatisierte 3-Plex-Visualisierungsprotokoll verwendet wurde. Die Detektion kleiner ROIs im räumlichen Transkriptomik-Protokoll erfolgte durch die Auswahl von kreisförmigen Regionen von Interesse bei 50 Mikrometer und 300 Mikrometer Durchmesser, RNA-Zählungen für ausgewählte Ziele auf verschiedenen Zelllinien waren zwischen den beiden Regionen mit interessierenden Größen nach der Normalisierung vergleichbar.Dieses Protokoll für automatisierte Visualisierungspanels kann von Forschern durch den Austausch von Markern angepasst werden, um Panels zu entwickeln, die ROIs genau definieren, um ihre räumlichen Proteomik-Fragen zu beantworten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

Krebsforschung

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Laser Mikrodissektion Angewandt auf Gene Expression Profiling von Untergruppe von Zellen aus dem Drosophila Wing Disc

Wir beschreiben ein Protokoll für die Lasermikrodissektion von Untersegmenten der menschlichen Niere, einschließlich des Glomerulus, proximalen Tubuli, dick aufsteigender Gliedmaße, Sammelkanal und Interstitium. Die RNA wird dann aus den erhaltenen Kompartimenten isoliert und die RNA-Sequenzierung wird durchgeführt, um Veränderungen in der transkriptomischen Signatur innerhalb jedes Teilsegments zu bestimmen.

Anwendung der Laser-Mikrodissektion zur Aufdeckung der regionalen Transkriptomik im menschlichen Nierengewebe

Die Netzhaut weist eine komplexe räumliche Organisation über ihre laminare Struktur auf. Moderne räumliche Transkriptomik- und Sequenzierungstechniken erfordern Gewebeschnitte mit einer Dicke von &lt; 20 μm, was ihre Anwendbarkeit in der Netzhautforschung einschränkt. Diese frisch gefrorene Kryosektionsmethode erzeugt dünne Gesichtsabschnitte der Netzhaut von Mäusen unter Beibehaltung planarer räumlicher Beziehungen und ermöglicht so eine umfassende molekulare Kartierung über Laminae hinweg.

En face Kryosektion der Netzhaut der Maus für die hochdimensionale räumliche molekulare Analyse

In diesem Artikel wird ein Protokoll vorgestellt, mit dem ein umfassendes räumliches Transkriptom-Profiling von Wirts-, Virus-, Pilz- und Mikrobiom-RNA aus formalinfixierten, in Paraffin eingebetteten Gewebeschnitten mittels Stereo-seq durchgeführt werden kann, das eine hochauflösende Kartierung verschiedener Transkriptome unter Beibehaltung der Gewebearchitektur ermöglicht.

Umfassendes räumliches Profiling von spezies-agnostischen Transkriptomen mittels Stereo-Seq

Dieses Protokoll beinhaltet einen Schritt-für-Schritt-Workflow für verkalkte Gefäßproben: Gewebehandhabung, Entkalkung, RNA-Validierung, Detektion von Verkalkungsniveaus und Strategien zur Auswahl von Interessenregionen auf dem Nanostring GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP). Das Ziel ist es, eine umfassende Methode zur Erhaltung der Gefäßgewebemorphologie und RNA für eine zuverlässige räumliche transkriptomische Analyse zu präsentieren.

Verkalkte Arterienvorbereitung und -verarbeitung mit erhaltener Morphologie und RNA für digitale räumliche Profilierung

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Isolierung von RNA aus definierten histologischen Regionen von paraformaldehydfixiertem, mit Optimal Cutting Temperatur eingebettetem Mauslebergewebe mittels Laser-Capture-Mikrodissektion, was eine gezielte nachgeschaltete Genexpressionsanalyse ermöglicht.

Laser-Capture-Mikrodissektion von paraformaldehydfixiertem Mauslebergewebe zur RNA-Analyse

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räumlich aufgelöste, integrierte einzelzellige multiomische Profilierung des Transkriptoms und epigenomischen Zielen in gefrorenen Gewebeschnitten

Dieses Protokoll zeigt , wie fluoreszierend markiert, genetisch definierten klonalen Tumoren im Auge von Drosophila melanogaster / antennal Imaginalscheiben (EAD) zu erzeugen. Es beschreibt, wie der EAD und Gehirn aus dem dritten Larvenstadium zu sezieren und wie sie zu verarbeiten, zu visualisieren und zu Veränderungen der Genexpression und Tumorinvasivität quantifizieren.

Das<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginalscheibe Tumormodell: Visualisierung und Quantifizierung von Genexpression und Tumorinvasivität mit Genetischen Mosaiken

Derzeit ist immunofluorescent Flecken auf festen Zellen die Methode der Wahl zur Bestimmung der Ausdruck proteingehalte wenn morphologische Informationen auch notwendig ist. Dieses Protokoll enthaltenen bietet für ein alternatives Verfahren zur Immunocytochemistry auf Paraffin-eingebetteten Zellenblöcken.

Bestimmung der Proteinexpressionsgrad in kultivierten Zellen von Immunocytochemistry auf Paraffin-eingebetteten Zellenblöcken

Das folgende Verfahren beschreibt eine Methode zur räumlichen und zeitlichen Kontrolle der melanozytischen Tumorinitiation in der Murin-Sdorsal-Haut mit Hilfe eines gentechnisch veränderten Mausmodells. Dieses Protokoll beschreibt sowohl die makroskopische als auch die mikroskopische kutane Melanom-Annenentzündung.

Räumliche und zeitweilige Kontrolle der Murine Melanom-Initiation aus Mutant Melanocyte Stammzellen

Erfahren Sie die automatisierte Auswahl von Regions of Interest für Spatial-Omics-Technologien. Diese Methode ermöglicht präzise Protein- und RNA-Profiling in Geweben mit verbesserter Reproduzierbarkeit.

Räumliches Profiling der Protein- und RNA-Expression im Gewebe: Ein Ansatz zur Feinabstimmung der virtuellen Mikrodissektion

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