Makrophagendifferenzierung und Polarisation in einen M2-ähnlichen Phänotyp unter Verwendung einer humanen Monozyten-ähnlichen THP-1-Leukämie-Zelllinie
2. August 2021
M2-ähnliche tumorassoziierte Makrophagen (TAM) sind mit Tumorprogression und schlechter Prognose bei Krebs assoziiert. Dieses Protokoll dient als detaillierte Anleitung, um THP-1-Monozyten-ähnliche Zellen innerhalb von 14 Tagen reproduzierbar in M2-ähnliche Makrophagen zu differenzieren und zu polarisieren. Dieses Modell ist die Grundlage, um die entzündungshemmende Wirkung von TAM in der Tumormikroumgebung zu untersuchen.
Entzündungshemmende tumorassoziierte Makrophagen sind mit Progression und schlechter Prognose bei Krebs verbunden. Dieses Protokoll ist ein Leitfaden, um THP-1-Monozyten-ähnliche Zellen innerhalb von 14 Tagen in M2-ähnliche Makrophagen zu differenzieren und zu polarisieren. Derzeit gibt es kein etabliertes Modell für die entzündungshemmende THP-1-Polarisation.
Dieses Protokoll verwendet angemessene Ruhezeiten und einen längeren Polarisationsprozess, um einen eindeutigen M2-ähnlichen Makrophagen-Subtyp zu erzeugen. Tumorentwicklungen, zum Beispiel bei Darmkrebs und Gewebeumbau, werden durch entzündungshemmende Makrophagen gesteuert. Unter den Studien, die ihre Funktion untersuchen, sorgt die standardisierte Erzeugung eines ausgeprägten M2-ähnlichen Subtyps für reproduzierbare Befunde.
Stellen Sie zunächst einen Timer für 150 Sekunden ein. Entfernen Sie die gefrorene Durchstechflasche mit der THP-1-Zelllinie aus dem flüssigen Stickstoff und tauen Sie die Durchstechflasche sofort bei 37 Grad Celsius in einem sauberen Wasserbad auf, wobei der Timer gestartet wird, sobald die Durchstechflasche in das Wasserbad gelegt wird. Lösen Sie die Kappe, um den durch den Auftauprozess aufgebauten Druck abzulassen, und stellen Sie sicher, dass die Rohröffnung nicht mit dem Wasser in Kontakt kommt, um verunreinigungen zu vermeiden.
Tauen Sie die Zellsuspension auf, bis ein etwa vier Millimeter kleiner Eischip in der Durchstechflasche verbleibt, und fahren Sie sofort mit dem nächsten Schritt fort. Übertragen Sie die flüssige Phase der Zellsuspension in ein 15-Milliliter-Röhrchen mit neun Millilitern warmer Wachstumsmedien. Dann einen Milliliter dieser warmen medium zelligen Suspension in die THP-1-Durchstechflasche und zurück in das 15-Milliliter-Röhrchen geben, um den verbleibenden Eischip zu schmelzen, und spülen Sie die Durchstechflasche, um sicherzustellen, dass keine Zellen zurückbleiben.
Mischen Sie die Suspension vorsichtig, indem Sie sie mit einer Ein-Milliliter-Pipette auf und ab pipettieren. Entfernen Sie etwa 10 Mikroliter der Probe, um die Zellen mit Trypanblau auf Lebensfähigkeit zu zählen. Die Zellen mit klarem Zytoplasma sind lebensfähig, ein blaues Zytoplasma zeigt den Zelltod an.
Drehen Sie beim Zählen die warme Zellsuspension bei 200 mal G für sieben Minuten bei 37 Grad Celsius herunter. Entfernen Sie den Überstand vollständig und resuspendieren Sie die Zellen im Wachstumsmedium, um eine Zelldichte von 500.000 Zellen pro Milliliter zu erreichen. Mischen Sie die Suspension vorsichtig und geben Sie jeweils 22 Milliliter in T75-Zellkulturkolben.
Lagern Sie die Kolben aufrecht in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius mit einer Kohlendioxidkonzentration von 5% und tauschen Sie die Wachstumsmedien alle drei bis vier Tage aus. Bereiten Sie die Zellsuspension vor, um die Zellen mit einer Dichte von 300.000 pro Milliliter pro Vertiefung in 24-Well-Zellkulturplatten zu säen. Mischen Sie das Medium vorsichtig und bereiten Sie Aliquoten von 26 Millilitern in 50 Milliliterr Röhrchen vor.
Geben Sie einen Milliliter des zellhaltigen Mediums in jede Vertiefung einer 24-Well-Platte. Mischen Sie das Medium vorsichtig, indem Sie es zwischen den Übertragungen auf und ab pipettieren. Halten Sie die frisch zubereitete Arbeitslösung von PMA auf Eis und fügen Sie 100 Nanogramm PMA pro Vertiefung hinzu.
Inkubieren Sie die Platten im Inkubator ohne weitere Behandlung für 72 Stunden. Entfernen Sie nach 72 Stunden das Wachstumsmedium und ersetzen Sie es durch einen Milliliter frisches Wachstumsmedium, um sicherzustellen, dass der Boden der Vertiefungen nicht mit Pipettenspitzen berührt wird. Lassen Sie die Zellen weitere 96 Stunden im Inkubator ruhen.
Entfernen Sie das Wachstumsmedium und ersetzen Sie es durch einen Milliliter frisches Wachstumsmedium. Fügen Sie 20 Nanogramm Interleukin 4 und 20 Nanogramm Interleukin 13 pro Vertiefung hinzu. Dann lassen Sie die Zellen 48 Stunden im Inkubator ruhen.
Wiederholen Sie den gesamten Vorgang nach 48 Stunden und lassen Sie die Zellen weitere 48 Stunden im Inkubator ruhen. Entfernen Sie das Wachstumsmedium und ersetzen Sie es durch einen Milliliter frisches Wachstumsmedium. Dann lassen Sie die Zellen 48 Stunden im Inkubator ruhen.
Entfernen Sie das warme Zellmedium aus jedem Brunnen und ersetzen Sie es durch eine ein Milliliter Mischung aus eiskaltem PBS ohne Kalzium und Magnesium und 5% FBS. Dann legen Sie die Zellplatte sofort für 45 Minuten auf Eis. Nach 45 Minuten auf Eis die Zellen mit Mini-Zellabstreifern abkratzen.
Übertragen Sie die abgelösten Makrophagen vorsichtig auf kaltes PBS und 5% FBS in einem 15-Milliliter-Rohr, das auf Eis gehalten wird. Die von der Polarisisationsmethode abgeleiteten Makrophagen zeigen die Expression von CD14- sowie CD11b-Markern. Die Monozyten- und Makrophagenmarker CD14 und CD11b wurden in 70,9% bzw. 74,7% der Zellen exprimiert.
Die Zellen zeigten niedrige Oberflächenniveaus des M1-ähnlichen Markers CD80 in 0,2% der Zellen und hohe Oberflächenniveaus des M2-ähnlichen Markers CD206 in 62,6% der Zellen. Da THP-1-Zellen in Medium dazu neigen, auf den Boden einer Durchstechflasche zu sinken und durch mechanische Beanspruchung leicht zu aktivieren sind, ist eine schonende Durchmischung und Handhabung der Zellen wichtig. M2-ähnliche Makrophagen werden reproduzierbar erzeugt und mit QR-TPCR, ELISA und Durchflusszytometrie charakterisiert.
Dies ist die Grundlage für die Untersuchung entzündungshemmender Mechanismen bei der Krebsentfaltung oder dem Gewebeumbau.
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Übersicht
Dieses Protokoll bietet eine umfassende Anleitung zur Differenzierung und Polarisation von THP-1-ähnlichen Monozytenzellen in M2-ähnliche Makrophagen innerhalb von 14 Tagen. M2-ähnliche tumorassoziierte Makrophagen (TAM) sind mit Tumorprogression und einer ungünstigen Prognose bei Krebserkrankungen verknüpft, weshalb dieses Modell essenziell für die Untersuchung ihrer antiinflammatorischen Wirkungen im Tumormikromilieu ist.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Zellbiologie
- Krebsforschung
Hintergrund
- M2-ähnliche TAM sind mit der Krebsprogression assoziiert.
- Es fehlen etablierte Modelle für die antiinflammatorische Polarisation von THP-1-Zellen.
- Die standardisierte Erzeugung definierter Makrophagensubtypen ist entscheidend für reproduzierbare Forschungsergebnisse.
- Antiinflammatorische Makrophagen spielen eine Rolle bei der Tumorentwicklung und der Gewebereorganisation.
Zweck der Studie
- Eine reproduzierbare Methode zur Erzeugung von M2-ähnlichen Makrophagen bereitzustellen.
- Die Rolle von Tumor-assoziierten Makrophagen (TAM) im Tumormikroumfeld zu untersuchen.
- Das Verständnis von antiinflammatorischen Mechanismen im Kontext von Krebs zu vertiefen.
Verwendete Methoden
- Differenzierung von THP-1-Monozyten in Makrophagen.
- Verlängerter Polarisationsprozess zur Erzielung eines M2-ähnlichen Phänotyps.
- Einbindung von Ruhephasen während des Protokolls.
- Standardisierung der Methoden zur Sicherstellung der Reproduzierbarkeit.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Differenzierung und Polarisation von THP-1-Zellen in M2-ähnliche Makrophagen.
- Entwicklung eines zuverlässigen Modells zur Untersuchung der Funktionen von Tumormakrophagen (TAM).
- Erkenntnisse über die antiinflammatorischen Rollen von M2-ähnlichen Makrophagen bei Krebs.
- Mögliche Implikationen für therapeutische Strategien, die auf Tumormakrophagen (TAM) abzielen.
Schlussfolgerungen
- Das Protokoll ermöglicht die reproduzierbare Generierung von M2-ähnlichen Makrophagen.
- Das Verständnis der Funktionen von TAM kann Ansätze zur Krebsbehandlung informieren.
- Weitere Forschung ist erforderlich, um das therapeutische Potenzial der gezielten Beeinflussung von M2-ähnlichen Makrophagen zu untersuchen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Dieses Protokoll schließt eine wichtige Lücke in der Immuno-Onkologie-Forschung, indem es eine standardisierte Methode zur Erzeugung M2-ähnlicher, tumorassoziiierter Makrophagen aus THP-1-Zellen bereitstellt, die eine reproduzierbare Untersuchung immunsuppressiver Mechanismen in der Krebsentwicklung ermöglicht. Das Modell unterstützt die Zielvalidierung und die mechanistische Absicherung von Therapien, die auf die Modulation der Makrophagenpolarisation im Tumormikroumfeld abzielen. Durch die Etablierung eines zuverlässigen M2-ähnlichen Phänotyps erhöht es die Vorhersagesicherheit in präklinischen Studien, die die Funktion tumorassoziiierter Makrophagen mit der Tumorprogression und der Gewebeumgestaltung verknüpfen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Untersuchung des M2-ähnlichen Makrophagenphänotyps als therapeutisches Ziel bei der Krebsprogression.
- Operativer Wert: Bietet ein konsistentes zelluläres Modell zur Validierung von Zielstrukturen, die an den Signalwegen der Makrophagenpolarisierung beteiligt sind.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt eine standardisierte Makrophagenpopulation zur Untersuchung immunmodulierender Substanzen, die die Expression von M2-Markern beeinflussen.
- Operationaler Wert: Unterstützt die Assay-Entwicklung mit definierten Endpunkten wie den Expressionsniveaus von CD206 und CD80 für die Charakterisierung von Substanzen.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die präklinische Bewertung von Wirkstoffen, die die TAM-Polarisierung in tumoraehnlichen Kontexten modulieren.
- Operativer Wert: Ermöglicht die longitudinale Beurteilung der Stabilität und Funktion M2-ähnlicher Makrophagen über den 14-tägigen Polarisationszeitraum.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode integriert sich in frühe Entdeckungsworkflows, indem sie ein validiertes Makrophagenmodell für die Zielstrukturnbindung und funktionelle Bildschirmung vor der Leitstruktur-Optimierung bereitstellt.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung hinsichtlich M2-polarisierender Signale und ihrer Rolle bei tumorfördernder Entzündung.
- Screening: Ermöglicht reproduzierbare Makrophagenpräparationen zur quantitativen Beurteilung der Wirkung von Substanzen auf Polarisationmarker.
- Analytik: Ermöglicht Durchflusszytometrie-, qRT-PCR- und ELISA-Analysen zur Messung von CD206, CD80, CD14 und CD11b als Polarisationsindikatoren.
- Translationale Forschung: Modelliert die Beteiligung M2-ähnlicher Tumormakrophagen (TAM) an Tumorprogression und Gewebereorganisation für die präklinische Übertragbarkeit.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform für Immunologie- und Onkologieteams, die makrophagenvermittelte Arzneimittelresistenz untersuchen.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Verringert mechanistische Unschärfen bei TAM-assoziierten Phänotypen durch standardisierte Erzeugung M2-ähnlicher Makrophagen.
- Operationaler Wert: Stellt die Reproduzierbarkeit zwischen verschiedenen Laboren sicher, indem definierte Differenzierungs-, Ruhe- und Polarisationsphasen vorgegeben werden.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch von Projekten, indem zuverlässige präklinische Daten zu makrophagenzielgerichteten Interventionen bereitgestellt werden.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung immunmodulatorischer Kandidaten basierend auf konsistenten Reaktionen M2-ähnlicher Makrophagen.
Umsetzungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der Kultur primärer Zellen, der Durchflusszytometrie und im Umgang mit Zytokinen.
- Setzt den Zugang zu Inkubatoren, Biosicherheitswerkbänken sowie Geräten zur Zellzählung und Bestimmung der Zellviabilität voraus.
- Erfordert eine Standardisierung der Dosierung und Applikationszeitpunkte von PMA, IL-4 und IL-13 zwischen verschiedenen Anwendern.
- Beinhaltet Anpassungsüberlegungen bei der Übertragung der Ergebnisse auf primäre humane Monozyten oder In-vivo-Modelle.
- Umfasst praktische Einschränkungen wie die Spendervariabilität bei primären Zellen und die Notwendigkeit aseptischer Techniken während längerer Kultivierung.
Biopharma-Häufige Fragen
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:56
Culturing and Maintenance of THP‐1 Monocyte-like Cells
2:59
Seeding of THP‐1 cells and Differentiation into M0 Macrophages
4:01
Polarization of M0 Macrophages into M2‐like Macrophages
4:39
Detaching and Harvesting Macrophages for Flow Cytometry
5:14
Results: Macrophage Differentiation and Polarization into an M2‐Like Phenotype
5:56
Conclusion
