Name: Makrophagendifferenzierung und Polarisation in einen M2-ähnlichen Phänotyp unter Verwendung einer humanen Monozyten-ähnlichen THP-1-Leukämie-Zelllinie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 38 s
Description: Erfahren Sie die Differenzierung und Polarisation von THP-1-Zellen zu M2-ähnlichen Makrophagen innerhalb von 14 Tagen. Dieses standardisierte Protokoll ermöglicht reproduzierbare Ergebnisse zur Untersuchung anti-inflammatorischer Mechanismen im Tumormikromilieu.

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Das Price Institute of Surgical Research, University of Louisville, wird vom John W. Price and Barbara Thruston Atwood Price Trust finanziell unterstützt. Die Finanzierungsquellen spielten keine Rolle bei der Konzeption und Durchführung der Studie sowie bei der Erhebung, Verwaltung, Analyse und Interpretation der Daten.

HINWEIS: Eine Übersicht über die in diesem Protokoll beschriebenen Schritte finden Sie in Abbildung 1. Die humane monozytenähnliche Leukämiezelllinie THP-1 wurde gekauft. Zur Authentifizierung der THP-1-Zelllinie wurde eine kurze Tandem-Wiederholungsanalyse durchgeführt. Führen Sie alle Schritte unter sterilen Bedingungen durch. Die monozytäre Zelllinie THP-1 wächst in Suspension und haftet nicht an Zellkulturoberflächen. Die Adhärenz kann durch Differenzierung von Monozyten in makrophagenähnliche Zellen induziert werden, z.B. durch mechanische Belastung oder spezifische Behandlung mitPMA.
1. Kultivierung und Erhaltung von THP-1-Monozyten-ähnlichen Zellen
<ol><li>Stellen Sie einen Timer für 150 s ein. Die gefrorene Durchstechflasche mit der THP-1-Zelllinie ( Materialtabelle ) aus demflüssigenStickstoff entfernen und sofort in einem Reinwasserbad (37 °C) auftauen. Starten Sie den Timer, sobald die Durchstechflasche in das Wasserbad gelegt wird. Lösen Sie die Kappe, um den Druck freizusetzen, der sich aufgrund des Auftauvorgangs aufbaut, aber stellen Sie sicher, dass die Rohröffnung nicht mit dem Wasser in Kontakt kommt, um eine Kontamination zu vermeiden. Der optimale Zeitraum für das Auftauen der Zellen liegt zwischen 120-150 s. Fahren Sie mit dem Auftauen der Zellsuspension fort, bis ein Eischip von etwa 4 mm Größe in der Durchstechflasche verbleibt. Fahren Sie dann sofort mit dem nächsten Schritt fort.</li>
	<li>Die flüssige Phase der Zellsuspension wird in ein 15 mL Röhrchen mit 9 mL warmem (37 °C) Wachstumsmedium überführen (Materialtabelle). Anschließend 1 ml der warmen mittelzelligen Suspension in die THP-1-Durchstechflasche und zurück in das 15-ml-Röhrchen geben, um den verbleibenden Eischip zu schmelzen und die Durchstechflasche zu spülen, um sicherzustellen, dass keine Zellen zurückbleiben.</li>
	<li>Mischen Sie die Suspension vorsichtig durch Pipettieren auf und ab mit einer 1000 μL Pipette. Entfernen Sie eine kleine Probe (ca. 10 μL), um die Zellen auf Lebensfähigkeit zu zählen (mit Trypanblau zum Ausschluss), während sie gesponnen werden. Drehen Sie die warmzellige Suspension bei 200 x g für 7 min bei 37 °C herunter.</li>
	<li>Entfernen Sie den Überstand vollständig und resuspendieren Sie mit einem bestimmten Volumen des warmen Wachstumsmediums, um eine Zelldichte von 5 x 105/ml zu erreichen. Mischen Sie die Suspension vorsichtig und geben Sie 22 ml Volumen in T-75-Zellkulturkolben (Materialtabelle). Lagern Sie die Kolben aufrecht in einem Inkubator bei 37 °C mit 5% Kohlendioxid (CO2) Konzentration. Tauschen Sie die Wachstumsmedien alle 3-4 Tage aus.</li>
</ol>2. Aussaat von THP-1-Zellen und Differenzierung in M0-Makrophagen
<ol><li>Bereiten Sie die Zelle, die das Wachstumsmedium mit der jeweiligen Zelldichte enthält, um Zellen mit einer Dichte von 3 x 105/ml/well in 24-Well-Zellkulturplatten zu säen (Materialtabelle). Mischen Sie das Medium vorsichtig und bereiten Sie Aliquoten von 26 ml vor, die jeweils in ein 50-ml-Röhrchen gegeben werden. Verwenden Sie jeweils 26 ml Aliquot, um die Zellen in eine entsprechende Platte zu säen.</li>
	<li>1 ml des zellhaltigen Mediums in jede Vertiefung einer 24-Well-Platte geben. Mischen Sie das Medium vorsichtig, indem Sie zwischen den Übertragungen auf und ab pipettieren.</li>
	<li>Bereiten Sie eine Stammlösung von PMA vor (lösen Sie 1 mg PMA in 100 μL Dimethylsulfoxid (DMSO) = ~16 mM Lösung von PMA in DMSO) und verdünnen Sie sie mit kalter phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) auf eine endgültige Arbeitskonzentration von 10 ng / μL kurz vor der Zellbehandlung (Materialtabelle). Halten Sie die Lösung auf Eis und verwenden Sie sie sofort. Nicht wieder einfrieren. Fügen Sie 100 ng PMA pro Vertiefung hinzu. Lassen Sie jede Zellplatte ohne weitere Behandlung für 72 h im Inkubator sitzen.</li>
	<li>Nach 72 h das Wachstumsmedium entfernen und durch 1 ml frisches Wachstumsmedium ersetzen. Berühren Sie den Boden der Vertiefungen nicht mit Pipettenspitzen. Lassen Sie die Zellen weitere 96 h im Inkubator ruhen.</li>
	<li>Wiederholen Sie nach 96 h Schritt 2.4 (Medienwechsel) und lassen Sie die Zellen weitere 24 h ruhen. HINWEIS: Die M0-Makrophagen sind jetzt bereit für Experimente (Abbildung 2). Unmittelbar vor der Behandlung der Zellen im Rahmen weiterer Experimente sollten Sie einen Medienwechsel nur mit RPMI (Materialtabelle) in Betracht ziehen, da Wachstumsmedienergänzungen Interferenzen mit Reagenzien verursachen können, die zur Zellbehandlung hinzugefügt werden. Falls M2-ähnliche Makrophagen benötigt werden, fahren Sie mit Abschnitt 3 fort.</li>
</ol>3. Polarisation von M0-Makrophagen in M2-ähnliche Makrophagen
<ol><li>Bereiten Sie eine Stammlösung von IL-4 und IL-13 vor (lösen Sie 20 μg IL-4 oder IL-13 in 200 μL nukleasefreiem Wasser auf) und verdünnen Sie sie unmittelbar vor der Zellbehandlung mit PBS auf eine endgültige Arbeitskonzentration von 2 ng / μL. Halten Sie die Lösung auf Eis und verwenden Sie sie sofort. Nicht wieder einfrieren.</li>
	<li>Entfernen Sie das Wachstumsmedium und ersetzen Sie es durch 1 ml frisches Wachstumsmedium. Fügen Sie 20 ng Interleukin 4 (IL-4) und 20 ng Interleukin 13 (IL-13) pro Vertiefung hinzu. Lassen Sie die Zellen 48 h im Inkubator ruhen.</li>
	<li>Wiederholen Sie nach 48 h Schritt 3.2. Lassen Sie die Zellen weitere 48 h im Inkubator ruhen.</li>
	<li>Entfernen Sie das Wachstumsmedium und ersetzen Sie es durch 1 ml frisches Wachstumsmedium. Lassen Sie die Zellen 48 h im Inkubator ruhen. HINWEIS: M2-ähnliche Makrophagen sind jetzt bereit für Experimente (Abbildung 2). Unmittelbar vor der Behandlung der Zellen im Rahmen weiterer Experimente sollten Sie einen Medienwechsel nur mit RPMI (Table of Materials) in Betracht ziehen, da Wachstumsmedienergänzungen Interferenzen verursachen können.</li>
</ol>4. Ablösen und Entnehmen von Makrophagen für die Durchflusszytometrie
HINWEIS: Verwenden Sie eine mechanische Methode, die Kälteschälte und Zellabkratzen kombiniert, um die polarisierten Makrophagen von Platten für die Durchflusszytometrie zu lösen und zu ernten.
<ol><li>Entfernen Sie das warme Zellmedium und ersetzen Sie es durch eine Mischung aus eiskaltem PBS (ohne Kalzium und Magnesium) und 5% fetalem Rinderserum (FBS), 1 ml pro Vertiefung. Unmittelbar danach legen Sie die Zellplatte für 45 Minuten auf Eis. Legen Sie die Zellplatte nicht auf Eis, bevor das warme Zellmedium entfernt wird, da dies die Zelllebensfähigkeit erheblich verringert. Halten Sie die Zellen erst auf Eis, nachdem Sie einen Kälteschock mit eiskaltem PBS / 5% FBS-Gemisch induziert haben.</li>
	<li>Nach 45 Minuten auf Eis die Zellen mit Mini-Zellschabern abkratzen (Materialtabelle). Die abgelösten Makrophagen in kaltem PBS/5% FBS vorsichtig in ein 15 mL Rohr geben. Halten Sie das Röhrchen immer auf Eis, bis die Zellen gefärbt sind. HINWEIS: Poolen Sie acht Zellschächte, um eine ausreichende Zellzahl für die Färbung zu erreichen.</li>
</ol>

<ol><li>Zhang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer-associated+fibroblasts+enhance+tumor-associated+macrophages+enrichment+and+suppress+NK+cells+function+in+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Disease%22%5BJournal%5D)">Cancer-associated fibroblasts enhance tumor-associated macrophages enrichment and suppress NK cells function in colorectal cancer.</a> Cell Death and Disease. 10 (4), 273(2019).</li>
<li>Wang, J., Li, D., Cang, H., Guo, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crosstalk+between+cancer+and+immune+cells%3A+Role+of+tumor-associated+macrophages+in+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Medicine%22%5BJournal%5D)">Crosstalk between cancer and immune cells: Role of tumor-associated macrophages in the tumor microenvironment.</a> Cancer Medicine. 8 (10), 4709-4721 (2019).</li>
<li>Soncin, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tumor+microenvironment+creates+a+niche+for+the+self-renewal+of+tumor-promoting+macrophages+in+colon+adenoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The tumor microenvironment creates a niche for the self-renewal of tumor-promoting macrophages in colon adenoma.</a> Nature Communications. 9 (1), 582(2018).</li>
<li>Mosser, D. M., Edwards, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+full+spectrum+of+macrophage+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Exploring the full spectrum of macrophage activation.</a> Nature Reviews Immunology. 8 (12), 958-969 (2008).</li>
<li>Mazzone, M., Menga, A., Castegna, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolism+and+TAM+functions-it+takes+two+to+tango%5BTitle%5D)+AND+%22Federation+of+European+Biochemical+Societies+Journal%22%5BJournal%5D)">Metabolism and TAM functions-it takes two to tango.</a> Federation of European Biochemical Societies Journal. 285 (4), 700-716 (2018).</li>
<li>Eum, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-promoting+macrophages+prevail+in+malignant+ascites+of+advanced+gastric+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Tumor-promoting macrophages prevail in malignant ascites of advanced gastric cancer.</a> Experimental and Molecular Medicine. 52 (12), 1976-1988 (2020).</li>
<li>Qian, B. Z., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+diversity+enhances+tumor+progression+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Macrophage diversity enhances tumor progression and metastasis.</a> Cell. 141 (1), 39-51 (2010).</li>
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<li>Bosshart, H., Heinzelmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((THP-1+cells+as+a+model+for+human+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">THP-1 cells as a model for human monocytes.</a> Annals of Translational Medicine. 4 (21), 438(2016).</li>
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<li>Lund, M. E., To, J., O'Brien, B. A., Donnelly, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+choice+of+phorbol+12-myristate+13-acetate+differentiation+protocol+influences+the+response+of+THP-1+macrophages+to+a+pro-inflammatory+stimulus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">The choice of phorbol 12-myristate 13-acetate differentiation protocol influences the response of THP-1 macrophages to a pro-inflammatory stimulus.</a> Journal of Immunological Methods. 430, 64-70 (2016).</li>
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<li>Luig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation-induced+IL-6+functions+as+a+natural+brake+on+macrophages+and+limits+gn%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Inflammation-induced IL-6 functions as a natural brake on macrophages and limits gn.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 26 (7), 1597-1607 (2015).</li>
<li>Maruyama, K., Nemoto, E., Yamada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+regulation+of+macrophage+function+-+cyclic+tensile+force+inhibits+NLRP3+inflammasome-dependent+IL-1beta+secretion+in+murine+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammation+and+Regeneration%22%5BJournal%5D)">Mechanical regulation of macrophage function - cyclic tensile force inhibits NLRP3 inflammasome-dependent IL-1beta secretion in murine macrophages.</a> Inflammation and Regeneration. 39, 3(2019).</li>
<li>Gatto, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PMA-Induced+THP-1+Macrophage+Differentiation+is+Not+Impaired+by+Citrate-Coated+Platinum+Nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomaterials+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">PMA-Induced THP-1 Macrophage Differentiation is Not Impaired by Citrate-Coated Platinum Nanoparticles.</a> Nanomaterials (Basel). 7 (10), (2017).</li>
<li>Maess, M. B., Wittig, B., Cignarella, A., Lorkowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+PMA+enhances+the+responsiveness+of+transfected+THP-1+macrophages+to+polarizing+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Reduced PMA enhances the responsiveness of transfected THP-1 macrophages to polarizing stimuli.</a> Journal of Immunological Methods. 402 (1-2), 76-81 (2014).</li>
<li>Daigneault, M., Preston, J. A., Marriott, H. M., Whyte, M. K., Dockrell, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+identification+of+markers+of+macrophage+differentiation+in+PMA-stimulated+THP-1+cells+and+monocyte-derived+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The identification of markers of macrophage differentiation in PMA-stimulated THP-1 cells and monocyte-derived macrophages.</a> PLoS One. 5 (1), 8668(2010).</li>
<li>Raggi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+human+macrophage+M1-M2+polarization+balance+by+hypoxia+and+the+triggering+receptor+expressed+on+myeloid+cells-1%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Regulation of human macrophage M1-M2 polarization balance by hypoxia and the triggering receptor expressed on myeloid cells-1.</a> Frontiers in Immunology. 8, 11097(2017).</li>
<li>Neutelings, T., Lambert, C. A., Nusgens, B. V., Colige, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+mild+cold+shock+%2825+degrees+C%29+followed+by+warming+up+at+37+degrees+C+on+the+cellular+stress+response%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Effects of mild cold shock (25 degrees C) followed by warming up at 37 degrees C on the cellular stress response.</a> PLoS One. 8 (7), 69687(2013).</li>
<li>Kurashina, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme-free+release+of+adhered+cells+from+standard+culture+dishes+using+intermittent+ultrasonic+traveling+waves%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+Biology%22%5BJournal%5D)">Enzyme-free release of adhered cells from standard culture dishes using intermittent ultrasonic traveling waves.</a> Communications Biology. 2, 393(2019).</li>
<li>Chen, S., So, E. C., Strome, S. E., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+Detachment+Methods+on+M2+Macrophage+Phenotype+and+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Impact of Detachment Methods on M2 Macrophage Phenotype and Function.</a> Journal of Immunological Methods. 426, 56-61 (2015).</li>
<li>Bailey, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+murine+bone+marrow-derived+macrophages+for+nitric+oxide+and+redox+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nitric+Oxide%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of murine bone marrow-derived macrophages for nitric oxide and redox biology.</a> Nitric Oxide. 100-101, 17-29 (2020).</li>
</ol>

Die Autoren erklären keine potenziellen Interessenkonflikte.

Dieses Protokoll zur Differenzierung und Polarisierung von THP-1-Monozyten-ähnlichen Zellen innerhalb von 14 Tagen bietet eine Methode, um Makrophagen mit einem ausgeprägten M2-ähnlichen Phänotyp aufgrund einer langen Behandlungsinkubation von Zellen mit ausreichenden Ruhezeiten zwischen den Schritten zu erhalten.
Bestimmte Schritte sind für dieses Protokoll von entscheidender Bedeutung. Die Verdopplungszeit der THP-1-Monozyten beträgt ca. 26 h. Zellen können mit einer Zelldichte von 9 x 10<su...

Tumorassoziierte Makrophagen (TAM) und ihre Rolle bei chronischen Entzündungen, dem Auftreten von Krebs und der Tumorentwicklung sind wichtige Ziele in der neueren Forschung1,2. Periphere Blutmonozyten, die in die Gewebemikroumgebung des sich entwickelnden Tumors rekrutiert werden, differenzieren sich zu Makrophagen und können in zwei Hauptsubtypen von Makrophagen polarisiert werden3. Der klassisch aktivierte Makrophage stellt den primär entzündungsfördernden M1-ähnlichen Phänotyp dar und der alternativ aktivierte M2-ähnliche Subtyp zeigt überwiegend entzündungshemmende Eigenschaften4. Makrophagen können dynamisch zwischen diesen beiden Hauptphänotypen wechseln, abhängig von ihrem Zellstoffwechsel, wobei intermediäre Subtypen sowohl entzündliche als auch entzündungshemmende Eigenschaftenaufweisen 5. TAM stellt eine heterogene Population beider Phänotypen dar. Eine tumorfördernde Funktion und schlechte Prognose bei verschiedenen Krebsarten ist jedoch besonders mit M2-ähnlichen Makrophagen verbunden6,7,8.
Die funktionellen Profile von Makrophagen und ihre Interaktion mit anderen Zellen innerhalb der Tumormikroumgebung sind komplex und schwierig in einer sich ständig verändernden Umgebung während der laufenden Tumorentwicklung zu erfassen. Zelllinien können eine homogene Zellpopulation mit stabiler Lebensfähigkeit in Kultur bieten, was den Prozess des Nachweises definierter zellulärer und interzellulärer Mechanismen erleichtern kann. Die monozytenartige THP-1-Zelllinie ist ein legitimes Modellsystem für primäre humane Monozyten9. Diese spontan verewigte Zelllinie wurde aus dem peripheren Blut eines einjährigen Säuglings mit akuter monozytärer Leukämie gewonnen9,10. Die Differenzierung und Polarisation von THP-1-Zellen wurde in mehreren Studien berichtet und auf verschiedene Arten durchgeführt11,12,13,14. Auf die Aktivierung und damit die Polarisation von Makrophagen in einen M1-ähnlichen Phänotyp folgt ein kompensatorischer entzündungshemmender Rebound-Mechanismus, der einen M2-ähnlichen Phänotyp durch Zytokine fördert, die von entzündlichen Makrophagen wie Interleukin 6 (IL-6) oder Itaconat15,16produziert werden. Dies könnte als Bruchmechanismus dienen, um eine überschießende Entzündungsreaktion nach Zellaktivierung abzuschwächen17. Der Prozess der Differenzierung und Polarisierung von Monozyten und THP-1-monozytenähnlichen Zellen zu einem entzündungshemmenden M2-ähnlichen Phänotyp wird selbst auch von entzündungsfördernden Reizen begleitet, die überwunden werden müssen. Eine entzündliche Zytokinreaktion kann durch mechanischen Stress18verursacht werden, z. B. durch Den Wechsel von Medien, um die Zellen zu refetieren, oder durch Zugabe chemischer Verbindungen zur Differenzierung von THP-1-Zellen, wie Phorbol-12-Myristat-13-Acetat (PMA), und induzieren die Produktion von Tumornekrosefaktor α (TNFα), Interleukin 1β (IL-1β) oder IL-619. Dieses veränderte Zytokinexpressionsprofil als Reaktion auf PMA kann die nachfolgende Makrophagenpolarisation beeinflussen und verhindern20. Ausreichende Ruhezeiten, wie zuvor nach der PMA-Behandlung berichtet, ermöglichen es diesen Entzündungsreaktionen, die Zellpolarisation in einen ausgeprägten M2-ähnlichen Phänotyp21zu verringern und zu erleichtern.
Dieses Protokoll demonstriert eine Methode, um THP-1-Monozyten-ähnliche Zellen innerhalb von 14 Tagen in einen M2-ähnlichen Phänotyp von Makrophagen zu differenzieren und zu polarisieren.

<table><tbody><tr><td>0,4 % Trypanblau</td><td>VWR, Radnor, USA</td><td>152-5061</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>USA Scientific, Ocala, USA</td><td>1615-5510</td><td></td></tr><tr><td>10 mL serologische Pipette</td><td>VWR, Radnor, USA</td><td>&nbsp; 89130-898</td><td></td></tr><tr><td>1000 &mu; L TipOne Pipettenspitzen</td><td>USA Scientific, Ocala, USA</td><td>1111-2821</td><td></td></tr><tr><td>15 mL&nbsp; Zentrifugenröhrchen</td><td>VWR, Radnor, USA</td><td>89039-664</td><td></td></tr><tr><td>20 &mu; L TipOne Pipettenspitzen</td><td>USA Scientific, Ocala, USA</td><td>1120-1810</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu; L TipOne Pipettenspitzen</td><td>USA Scientific, Ocala, USA</td><td>1120-8810</td><td></td></tr><tr><td>25 mL serologische Pipette</td><td>VWR, Radnor, USA</td><td>&nbsp; 89130-900</td><td></td></tr><tr><td>5 mL serologische Pipette</td><td>VWR, Radnor, USA</td><td>&nbsp; 89130-896</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Zentrifugenröhrchen</td><td>VWR, Radnor, USA</td><td>89039-662</td><td></td></tr><tr><td>Accutase Lösung 500</td><td>mL Sigma, St. Louis, USA</td><td>A6964</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotische Antimykotische Lösung (100x), stabilisiert</td><td>Sigma, St. Louis, USA</td><td>A5955-100 mL</td><td>mit 10.000 Einheiten Penicillin, 10 mg Streptomycin und 25 & mu; g Amphotericin B pro ml, steril filtriert, BioReagenz, geeignet für Zellkulturen</td></tr><tr><td>Binder CO2 Inkubator</td><td>VWR, Radnor, USA</td><td>C170-ULE3</td><td></td></tr><tr><td>CytoOne T-75cm Kolben mit Filterkappe</td><td>USA Scientific, Ocala, USA</td><td>CC7682-4875</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Sigma, St. Louis, USA</td><td>D8537-500 mL</td><td>PBS ohne Calciumchlorid und Magnesiumchlorid sollte verwendet werden, da beide die Makrophagenpolarisation verändern können</td></tr><tr><td>Eppendorf Centrifuge 5804 R (gekühlt)</td><td>Eppendorf, Enfield,</td> <td>USA-Ethylalkohol</td><td></td></tr> <tr><td>(70%)</td><td>-</td><td></td><td></td></tr><tr><td>-FACSCalibur Durchflusszytometer</td><td>BD Biosciences, San Diego, USA-</td><td></td><td>Das Durchflusszytometer arbeitet mit der CellQuest-Software (BD Biosciences)</td></tr><tr><td>Falcon 24-Well-Platte</td><td>VWR, Radnor, USA</td><td>353504</td><td></td></tr><tr><td>Fetales Rinderserum (FBS)</td><td>ATCC, Manassas, USA</td><td>30-2020</td><td></td></tr><tr><td>FITC Maus Anti-Human CD14</td><td>BD Biosciences, San Diego, USA</td><td>555397</td><td>Durchflusszytometrie, myeloischer Zellmarker (100 Tests)</td></tr><tr><td>FITC Maus Anti-Human CD80</td><td>BD Pharmingen, San Diego, USA</td><td>557226</td><td>Durchflusszytometrie, M1-Marker (100 Tests)</td></tr><tr><td>FITC Maus IgG1 & kappa; Isotypkontrolle</td><td>BD Pharmingen, San Diego, USA</td><td>555748</td><td>Durchflusszytometrie, Isotypkontrolle für CD80 (100 Tests)</td></tr><tr><td>FITC Maus IgG2a, &kappa; Isotypkontrolle</td><td>BD Biosciences, San Diego, USA</td><td>553456</td><td>Durchflusszytometrie, Isotypkontrolle für CD14 (100 Tests)</td></tr><tr><td>Human BD Fc Block</td><td>BD Biosciences, San Diego, USA</td><td>564220</td><td>Durchflusszytometrie, Fc-Block (0,25 mg)</td></tr><tr><td>Humanes Interleukin 13 (IL-13)</td><td>R& D, Minneapolis, USA</td><td>IL-771-10 &mu; g</td><td></td></tr><tr><td>Humanes Interleukin 4 (IL-4)</td><td>R& D, Minneapolis, USA</td><td>SRP3093-20 &mu; g</td><td></td></tr><tr><td>Labconco Biosicherheitswerkbank (Delta Series 36212/36213)</td><td>Labconco, Kansas City,</td> USA-L-Glutamin <td></td><td></td></tr><tr><td>Solution, 200 mM</td><td>ATCC, Manassas, USA</td><td>30-2214</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolysaccharid (LPS) aus E. coli 0111:B4</td><td>Sigma, St. Louis, USA</td><td>L2630-100 mg</td><td></td></tr><tr><td>Mini Cell Scrapers</td><td>Biotium, Fremont, USA</td><td>22003</td><td></td></tr><tr><td>Neubauer Hämozytometer</td><td>Fisher Scientific, Waltham, USA</td><td>02-671-5</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse inverses Mikroskop TS100</td><td>Nikon, Melville,</td> <td>USA-Nukleasefreies</td><td></td></tr> <tr><td>Wasser</td><td>Invitrogen, Carlsbad, USA</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>Olympus Lichtmikroskop RH-2</td><td>Microscope Central, Feasterville, USA</td><td>40888</td><td></td></tr><tr><td>P10 variable Pipette - Gilson</td><td>VWR, Radnor, USA</td><td>76180-014</td><td></td></tr><tr><td>P1000 variable Pipette - Gilson</td><td>VWR, Radnor, USA</td><td>76177-990 P200</td><td></td></tr><tr><td>variable Pipette - Gilson</td><td>VWR, Radnor, USA</td><td>76177-988</td><td></td></tr><tr><td>PE Maus Anti-Human-CD11b</td><td>BD Biosciences, San Diego, USA</td><td>555388</td><td>Durchflusszytometrie, myeloischer Zellmarker (100 Tests)</td></tr> <tr><td>PE Maus IgG1, & kappa; Isotypkontrolle</td><td>BD Biosciences, San Diego, USA</td><td>555749</td><td>Durchflusszytometrie, Isotypkontrolle für CD11b (100 Tests)</td></tr><tr><td>PE-Cy 5 Maus Anti-Human CD206</td><td>BD Pharmingen, San Diego, USA</td><td>551136</td><td>Durchflusszytometrie, M2-Marker (100 Tests)</td></tr><tr><td>PE-Cy 5 Maus IgG1 & kappa; Isotypkontrolle</td><td>BD Pharmingen, San Diego, USA</td><td>555750</td><td>Durchflusszytometrie, Isotypkontrolle für CD206 (100 Tests)</td></tr><tr><td>Phorbol 12-Myristat-13-acetat (PMA)</td><td>Sigma, St. Louis, USA</td><td>P8139</td><td></td></tr><tr><td>Powerpette Plus Pipettier</td><td>VWR, Radnor, USA</td><td>75856-448</td><td></td></tr><tr><td>Präzisionswasserbad (Modell 183)</td><td>Precision Scientific, Chicago, USA</td><td>66551</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 Medium</td><td>ATCC, Manassas, USA</td><td>30-2001</td><td></td></tr><tr><td>THP-1 Zelllinie, American Type Culture Collection (ATCC)</td><td>ATCC, Manassas, USA</td><td>TIB-202</td><td></td></tr></tbody></table>

makrophagendifferenzierung und polarisation in einen m2-ähnlichen phänotyp unter verwendung einer humanen monozyten-ähnlichen thp-1-leukämie-zelllinie

Macrophage Differentiation and Polarization into an M2-Like Phenotype using a Human Monocyte-Like THP-1 Leukemia Cell Line

Tumorassoziierte Makrophagen (TAM) können ihre Expression und ihr Zytokinprofil entsprechend äußerer Reize umschalten. Diese bemerkenswerte Plastizität ermöglicht es TAM, sich an laufende Veränderungen in der Mikroumgebung des Tumors anzupassen. Makrophagen können entweder primär entzündungsfördernd (M1-ähnlich) oder entzündungshemmend (M2-ähnlich) Eigenschaften aufweisen und können kontinuierlich zwischen diesen beiden Hauptzuständen wechseln. M2-ähnliche Makrophagen innerhalb der Tumorumgebung sind mit Krebsprogression und schlechter Prognose bei verschiedenen Krebsarten verbunden. Viele verschiedene Methoden zur Induktion der Differenzierung und Polarisation von THP-1-Zellen werden verwendet, um zelluläre und interzelluläre Mechanismen und die Auswirkungen von TAM in der Mikroumgebung von Tumoren zu untersuchen. Derzeit gibt es kein etabliertes Modell für die M2-ähnliche Makrophagenpolarisation mit der THP-1-Zelllinie, und die Ergebnisse von Expressions- und Zytokinprofilen von Makrophagen aufgrund bestimmter In-vitro-Reize variieren zwischen den Studien. Dieses Protokoll dient als detaillierte Anleitung, um THP-1-Monozyten-ähnliche Zellen in M0-Makrophagen zu differenzieren und Zellen innerhalb von 14 Tagen weiter in einen M2-ähnlichen Phänotyp zu polarisieren. Wir zeigen die morphologischen Veränderungen von THP-1-Monozyten-ähnlichen Zellen, differenzierten Makrophagen und polarisierten M2-ähnlichen Makrophagen mittels Lichtmikroskopie. Dieses Modell ist die Grundlage für Zelllinienmodelle, die die entzündungshemmende Wirkung von TAM und deren Wechselwirkungen mit anderen Zellpopulationen der Tumormikroumgebung untersuchen.

M2-ähnliche Makrophagen wurden charakterisiert und die M2-Polarisation wurde mittels Durchflusszytometrie für Cluster of Differentiation Marker (CD) CD14, CD11b, CD80 (M1-like Marker) und CD206 (M2-like marker) validiert. Die Durchflusszytometrie-Färbung wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Makrophagen wurden mit PBS/5% FBS gewaschen und mit Fcγ-Rezeptorblock inkubiert, um eine unspezifische Bindung zu vermeiden. Die Zellen wurden dann mit FITC-konjugierten Maus-Anti-Human-CD14- und CD80-Antikörpern,...

M2-ähnliche tumorassoziierte Makrophagen (TAM) sind mit Tumorprogression und schlechter Prognose bei Krebs assoziiert. Dieses Protokoll dient als detaillierte Anleitung, um THP-1-Monozyten-ähnliche Zellen innerhalb von 14 Tagen reproduzierbar in M2-ähnliche Makrophagen zu differenzieren und zu polarisieren. Dieses Modell ist die Grundlage, um die entzündungshemmende Wirkung von TAM in der Tumormikroumgebung zu untersuchen.

Makrophagendifferenzierung und Polarisation in einen M2-ähnlichen Phänotyp unter Verwendung einer humanen Monozyten-ähnlichen THP-1-Leukämie-Zelllinie

Tumor-associated macrophages (TAM) can switch their expression and cytokine profile according to external stimuli. This remarkable plasticity enables TAM ...

Entzündungshemmende tumorassoziierte Makrophagen sind mit Progression und schlechter Prognose bei Krebs verbunden. Dieses Protokoll ist ein Leitfaden, um THP-1-Monozyten-ähnliche Zellen innerhalb von 14 Tagen in M2-ähnliche Makrophagen zu differenzieren und zu polarisieren. Derzeit gibt es kein etabliertes Modell für die entzündungshemmende THP-1-Polarisation.Dieses Protokoll verwendet angemessene Ruhezeiten und einen längeren Polarisationsprozess, um einen eindeutigen M2-ähnlichen Makrophagen-Subtyp zu erzeugen. Tumorentwicklungen, zum Beispiel bei Darmkrebs und Gewebeumbau, werden durch entzündungshemmende Makrophagen gesteuert. Unter den Studien, die ihre Funktion untersuchen, sorgt die standardisierte Erzeugung eines ausgeprägten M2-ähnlichen Subtyps für reproduzierbare Befunde.Stellen Sie zunächst einen Timer für 150 Sekunden ein. Entfernen Sie die gefrorene Durchstechflasche mit der THP-1-Zelllinie aus dem flüssigen Stickstoff und tauen Sie die Durchstechflasche sofort bei 37 Grad Celsius in einem sauberen Wasserbad auf, wobei der Timer gestartet wird, sobald die Durchstechflasche in das Wasserbad gelegt wird. Lösen Sie die Kappe, um den durch den Auftauprozess aufgebauten Druck abzulassen, und stellen Sie sicher, dass die Rohröffnung nicht mit dem Wasser in Kontakt kommt, um verunreinigungen zu vermeiden.Tauen Sie die Zellsuspension auf, bis ein etwa vier Millimeter kleiner Eischip in der Durchstechflasche verbleibt, und fahren Sie sofort mit dem nächsten Schritt fort. Übertragen Sie die flüssige Phase der Zellsuspension in ein 15-Milliliter-Röhrchen mit neun Millilitern warmer Wachstumsmedien. Dann einen Milliliter dieser warmen medium zelligen Suspension in die THP-1-Durchstechflasche und zurück in das 15-Milliliter-Röhrchen geben, um den verbleibenden Eischip zu schmelzen, und spülen Sie die Durchstechflasche, um sicherzustellen, dass keine Zellen zurückbleiben.Mischen Sie die Suspension vorsichtig, indem Sie sie mit einer Ein-Milliliter-Pipette auf und ab pipettieren. Entfernen Sie etwa 10 Mikroliter der Probe, um die Zellen mit Trypanblau auf Lebensfähigkeit zu zählen. Die Zellen mit klarem Zytoplasma sind lebensfähig, ein blaues Zytoplasma zeigt den Zelltod an.Drehen Sie beim Zählen die warme Zellsuspension bei 200 mal G für sieben Minuten bei 37 Grad Celsius herunter. Entfernen Sie den Überstand vollständig und resuspendieren Sie die Zellen im Wachstumsmedium, um eine Zelldichte von 500.000 Zellen pro Milliliter zu erreichen. Mischen Sie die Suspension vorsichtig und geben Sie jeweils 22 Milliliter in T75-Zellkulturkolben.Lagern Sie die Kolben aufrecht in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius mit einer Kohlendioxidkonzentration von 5% und tauschen Sie die Wachstumsmedien alle drei bis vier Tage aus. Bereiten Sie die Zellsuspension vor, um die Zellen mit einer Dichte von 300.000 pro Milliliter pro Vertiefung in 24-Well-Zellkulturplatten zu säen. Mischen Sie das Medium vorsichtig und bereiten Sie Aliquoten von 26 Millilitern in 50 Milliliterr Röhrchen vor.Geben Sie einen Milliliter des zellhaltigen Mediums in jede Vertiefung einer 24-Well-Platte. Mischen Sie das Medium vorsichtig, indem Sie es zwischen den Übertragungen auf und ab pipettieren. Halten Sie die frisch zubereitete Arbeitslösung von PMA auf Eis und fügen Sie 100 Nanogramm PMA pro Vertiefung hinzu.Inkubieren Sie die Platten im Inkubator ohne weitere Behandlung für 72 Stunden. Entfernen Sie nach 72 Stunden das Wachstumsmedium und ersetzen Sie es durch einen Milliliter frisches Wachstumsmedium, um sicherzustellen, dass der Boden der Vertiefungen nicht mit Pipettenspitzen berührt wird. Lassen Sie die Zellen weitere 96 Stunden im Inkubator ruhen.Entfernen Sie das Wachstumsmedium und ersetzen Sie es durch einen Milliliter frisches Wachstumsmedium. Fügen Sie 20 Nanogramm Interleukin 4 und 20 Nanogramm Interleukin 13 pro Vertiefung hinzu. Dann lassen Sie die Zellen 48 Stunden im Inkubator ruhen.Wiederholen Sie den gesamten Vorgang nach 48 Stunden und lassen Sie die Zellen weitere 48 Stunden im Inkubator ruhen. Entfernen Sie das Wachstumsmedium und ersetzen Sie es durch einen Milliliter frisches Wachstumsmedium. Dann lassen Sie die Zellen 48 Stunden im Inkubator ruhen.Entfernen Sie das warme Zellmedium aus jedem Brunnen und ersetzen Sie es durch eine ein Milliliter Mischung aus eiskaltem PBS ohne Kalzium und Magnesium und 5% FBS. Dann legen Sie die Zellplatte sofort für 45 Minuten auf Eis. Nach 45 Minuten auf Eis die Zellen mit Mini-Zellabstreifern abkratzen.Übertragen Sie die abgelösten Makrophagen vorsichtig auf kaltes PBS und 5% FBS in einem 15-Milliliter-Rohr, das auf Eis gehalten wird. Die von der Polarisisationsmethode abgeleiteten Makrophagen zeigen die Expression von CD14- sowie CD11b-Markern. Die Monozyten- und Makrophagenmarker CD14 und CD11b wurden in 70,9% bzw. 74,7% der Zellen exprimiert.Die Zellen zeigten niedrige Oberflächenniveaus des M1-ähnlichen Markers CD80 in 0,2% der Zellen und hohe Oberflächenniveaus des M2-ähnlichen Markers CD206 in 62,6% der Zellen. Da THP-1-Zellen in Medium dazu neigen, auf den Boden einer Durchstechflasche zu sinken und durch mechanische Beanspruchung leicht zu aktivieren sind, ist eine schonende Durchmischung und Handhabung der Zellen wichtig. M2-ähnliche Makrophagen werden reproduzierbar erzeugt und mit QR-TPCR, ELISA und Durchflusszytometrie charakterisiert.Dies ist die Grundlage für die Untersuchung entzündungshemmender Mechanismen bei der Krebsentfaltung oder dem Gewebeumbau.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

In diesem Video demonstrieren wir ein Verfahren zur Induktion der Differenzierung und Polarisation von Monozyten aus peripherem Blut in M1- oder M2-Makrophagen. Die Inkubation mit Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierendem Faktor, Lipopolysaccharid und Interferon-gamma ergibt proinflammatorische M1-Makrophagen, während die Inkubation mit Makrophagen-Kolonie-stimulierendem Faktor und Interleukin-4 die entzündungshemmende Produktion von M2-Makrophagen induziert.

Differenzierung und Polarisation von Monozyten-abgeleiteten Zellen in Makrophagen-ähnliche Zellen

Der Artikel beschreibt eine leicht einfach...

Untersuchung von Makrophagen-Polarisation mit Knochenmark-Makrophagen

Monozyten abgeleiteten Makrophagen sind wichtige Zellen des angeborenen Immunsystems. Hier beschreiben wir eine einfach zu...

Ein<em&gt; In-vitro-</em&gt; Modell zur Heterogenität des menschlichen Makrophagen Differenzierung und Polarisierung Studieren

Wir stellen ein einfaches und effizientes Protokoll für die Herstellung von menschlichen Makrophagen. Buffy Coats werden durch Doppel Dichtegradientenzentrifugation isoliert verarbeitet und Monozyten werden dann an Makrophagen in Teflon-beschichtete Zellkulturbeutel differenziert. Dies maximiert Makrophagen-Renditen und erleichtert die Zellernte für nachfolgende Experimente.

Isolierung humaner Monozyten durch Doppel-Zentrifugation und ihre Differenzierung zu Makrophagen in Teflon-beschichteten Zellkultur-Taschen

Es wird ein Protokoll für die Zellkultur von Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (M-CSF) differenzierten menschlichen Monozyten-abgeleiteten Makrophagen vorgestellt. Das Protokoll nutzt die Kryokonservierung von Monozyten in Verbindung mit ihrer Massendifferenzierung in Makrophagen. Dann können geerntete Makrophagen in Kulturvertiefungen mit den erforderlichen Zelldichten für die Durchführung von Experimenten ausgesät werden.

Kultur von M-CSF Differentiated Menschliche Monozyten abgeleiteten Makrophagen

Wir präsentieren Ihnen ein Protokoll zur Proteomic Unterschriften von menschlichen Makrophagen und wenden Sie diese zur Bestimmung der Auswirkungen einer sauerstoffarmen Umgebung auf Makrophagen Polarisation.

Proteomic Analysen der menschlichen Makrophagen Polarisierung in einer sauerstoffarmen Umgebung

Dieses Protokoll bietet eine Methode zur Untersuchung der Mycobacterium tuberculosis-Infektion bei menschlichen M1- oder M2-polarisierten Makrophagen auf der Grundlage der Differenzierung von peripheren Blutmonozyten zu Makrophagen-ähnlichen Zellen, die mit dem GFP-markierten virulenten Stamm H37Rv infiziert und mit Durchflusszytometrie mit einem 10-Farben-Panel einschließlich der Expression ausgewählter M1/M2-Marker analysiert werden.

Polarisation von M1 und M2 Human Monocyte-Derived Cells und Analyse mit Durchflusszytometrie bei Mycobacterium tuberculosis Infection

Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Bewertung des immunmodulatorischen Potenzials von Implantatoberflächen in vitro vor, um die Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit aktueller Protokolle zu verbessern und die weitere Forschung zu fördern. Sekretorische Zytokinprofile, mRNA-Expression und Zelloberflächenmarker wurden mit Hilfe von Blutmonozyten-abgeleiteten Makrophagen überwacht, um die Makrophagenpolarisation auf Titan zu untersuchen.

Polarisation und Charakterisierung von M1- und M2-humanen Monozyten-abgeleiteten Makrophagen auf Implantatoberflächen 

Monozyten und Makrophagen sind sehr plastische und reprogrammierbare Immunzellen, die für Gesundheit und Krankheit entscheidend sind. Sie spüren und reagieren auf ein breites Spektrum von Reizen, indem sie spezifische Differenzierungsprogramme und Phänotypen übernehmen. Wir haben ein In-vitro-Modell standardisiert, um die Polarisation und Reprogrammierung von Makrophagen zu untersuchen, was ein wertvolles Werkzeug für die Forschung darstellt.

Reprogrammierungsmodell von humanen Monozyten-abgeleiteten Makrophagen für In-vitro-Assays

Wir haben Verbesserungen und aktualisierte Methoden für den bestehenden Monozyten-Monolayer-Assay (MMA) entwickelt, bei dem Makrophagen verwendet werden, um die klinische Relevanz von Erythrozyten-Alloantikörpern in der Transfusionsmedizin und Immunologie besser vorhersagen zu können. Dieser Assay wird als Monozyten-Makrophagen-Assay (M-MA) bezeichnet.

Vorhersage der Bedeutung von Antikörpern roter Blutkörperchen mit dem Monozyten-Makrophagen-Assay

Erfahren Sie die Differenzierung und Polarisation von THP-1-Zellen zu M2-ähnlichen Makrophagen innerhalb von 14 Tagen. Dieses standardisierte Protokoll ermöglicht reproduzierbare Ergebnisse zur Untersuchung anti-inflammatorischer Mechanismen im Tumormikromilieu.

Makrophagendifferenzierung und Polarisation in einen M2-ähnlichen Phänotyp unter Verwendung einer humanen Monozyten-ähnlichen THP-1-Leukämie-Zelllinie (Video) | JoVE Journal

Makrophagendifferenzierung und Polarisation in einen M2-ähnlichen Phänotyp unter Verwendung einer humanen Monozyten-ähnlichen THP-1-Leukämie-Zelllinie

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