Räumlich-zeitliche In-vivo-Bildgebung von okulären Wirkstoffabgabesystemen mittels faseroptischer konfokaler Lasermikroendoskopie

Dieses Protokoll erleichtert das Screening neuer Formulierungen, um besser zu verstehen, wie sich Modifikationen auf ihre Gewebeverweilzeiten auswirken, was für die Entwicklung eines optimalen Arzneimittelabgabesystems von entscheidender Bedeutung ist. Diese Technik ist nichtinvasiv und ermöglicht Echtzeit-Bildgebung, was den übermäßigen Einsatz von Tieren für die Probenahme reduziert. Drug-Delivery-Systeme können für bildgebende und therapeutische Anwendungen neu gestaltet werden, indem einfach das therapeutische Medikament und die bildgebende Einheit in einem Nano-Carrier zusammengefasst werden.

Dies hat nützliche Anwendungen sowohl bei der Behandlung von Krebs als auch bei Infektionskrankheiten. Das Verfahren wird Rasha Msallam, senior research fellow aus meinem Labor, demonstrieren. Zunächst wird die Maus zwei Stunden vor der subkonjunktivalen Injektion intravenös über den Schwanz mit 2,5 Milligramm pro Kilogramm Evans Blue oder EB injiziert. Nachdem Sie die Maus mit 5% Isofluran sediert haben, übertragen Sie die Maus auf einen Nasenkegel und halten Sie die sedierte Maus auf einem Heizkissen.

Schneiden Sie dann die Schnurrhaare in der Nähe des zu injizierenden Auges ab. Geben Sie einen Tropfen von 0,5% Proxymetacainhydrochlorid-Lösung direkt auf das Auge. Laden Sie als Nächstes eine 10-Mikroliter-Glasspritze, die mit einer 32-Gauge-Nadel mit fluoreszierenden Liposomen ausgestattet ist, und stellen Sie sicher, dass die Luftblasen nicht in der Spritze vorhanden sind.

Heben Sie mit einer Pinzette die Bindehaut an und injizieren Sie langsam Liposomen in den subkonjunktivalen Raum, dann ziehen Sie die Nadel langsam zurück, um den Rückfluss zu verhindern. Sorgen Sie für die Bildung von Bleb, die mit fluoreszierenden Liposomen gefüllt sind. Verabreichen Sie einen 1% igen Fusitsäuretropfen auf das Auge und überwachen Sie die Maus, bis sie wieder zu Bewusstsein kommt.

Schalten Sie das CLM-System ein. Schließen Sie die Sonde an das CLM-System an. Wählen Sie an dieser Stelle das Sichtfeld und den Speicherort für die Erfassungsdateien aus.

Passen Sie die Laserintensität an, um sicherzustellen, dass die Fluoreszenzdetektion für Fluorescein-DHPE im linearen Bereich liegt, und halten Sie die Intensität konsistent für den Vergleich zwischen Bildern, die zu verschiedenen Zeitpunkten aufgenommen wurden. Nachdem das System 15 Minuten lang aufgewärmt wurde, kalibrieren Sie das System gemäß den Anweisungen des Herstellers mit dem Kalibrierkit, das die Reinigungs-, Spül- und Fluoro-4-Lösungen für jeden Laser enthält. Beginnen Sie kurz mit der Kalibrierung, indem Sie die Spitze jeweils fünf Sekunden lang in die Reinigungsflasche und dann in die Spülflasche tauchen.

Lassen Sie die Spitze für die Hintergrundaufzeichnung in der Luft, um die Hintergrundwerte der verschiedenen Fasern der Sonden zu normalisieren und die Bildgleichmäßigkeit zu gewährleisten. Tauchen Sie die Spitze erneut fünf Sekunden lang in die Reinigungsflasche und dann in die Spülflasche. Als nächstes tauchen Sie die Spitze fünf Sekunden lang in die Durchstechflasche mit Fluor-4 488-Nanometer, um die Signalwerte zu normalisieren.

Wiederholen Sie das Eintauchen der Spitze für fünf Sekunden in die Reinigungsflasche, gefolgt von der Spülflasche. Bewahren Sie die Spitze in der Spülflasche auf, bis das im vorherigen Schritt aufgezeichnete Fluoreszenzsignal verschwindet. Übertragen Sie dann die Spitze in die Durchstechflasche, die Fluor-4 660-Nanometer enthält, um die Signalwerte von verschiedenen Fasern in der Sonde zu normalisieren.

Stellen Sie nach der Kalibrierung sicher, dass der Wert für den Hintergrund der Sonde kleiner als 100 ist. Andernfalls führen Sie eine wiederholte Reinigung der Sonde mit einem Baumwollspitzenapplikator durch. Schalten Sie den Tiertemperaturregler mit angeschlossenem Heizkissen ein und stellen Sie die Temperatur auf 37 Grad Celsius ein.

Nachdem Sie das Heizkissen mit einem chirurgischen Vorhang abgedeckt haben, befestigen Sie den Nasenkonus auf dem Heizkissen. Nachdem Sie die Maus mit 5% Isofluran in einer Induktionskammer sediert haben, übertragen Sie die Maus auf den Nasenkegel und halten Sie die sedierte Maus auf einem Heizkissen. Dann geben Sie einen Tropfen Anästhetikum 0,5% Proxymetacainhydrochlorid-Lösung auf das Auge.

Um die Augenoberfläche zu waschen und die Kristallisation der Linse zu vermeiden, halten Sie die Augen geschmiert, indem Sie ein paar Salztropfen fallen lassen. Drehen und justieren Sie dann das Okular des Mikroskops, um das Mausauge ergonomisch im direkten Fokus bei 0,67-facher Vergrößerung zu betrachten. Schalten Sie den Laser ein und legen Sie die Sonde wie einen Stift direkt auf die zu fotografierende Augenregion.

Beginnen Sie dann mit der Aufzeichnung der Erfassung, um die Fluoreszenz im Auge in der interessierenden Region zu beobachten. Stoppen Sie die Aufzeichnung, wenn alle Regionen gemäß der Augenkarte gekennzeichnet und beschriftet sind, um die genaue Sondenposition im genauen Rahmen zu kennen. Die Erfassungsdateien werden automatisch als Videodateien an dem zuvor ausgewählten Speicherort gespeichert.

Die Fluoreszenzbildgebung zeigte eine deutliche Differenzierung zwischen den Bereichen Sklera und Hornhaut. Eine hohe Vaskularisierung der Episklera und der Bindehaut führte dazu, dass sich die Skleraregion rot mit EB färbte. Die Hornhaut, der das Gefäßsystem fehlt, erschien schwarz. Die Kontrastfluoreszenz von Limbus und Sklera wurde in einer siebentägigen Studie beobachtet.

Fluorescein-Farbstoff-injizierte Kontrollmäuse bestätigten die Spezifität der Liposomen-abgeleiteten Fluoreszenz. Die Fluoreszenzintensitäten waren am ersten und dritten Tag hoch. Grüne Fluoreszenz proxizierte die Liposomenreduktion in den Limbus- und Skleraregionen im Laufe der Zeit.

Die Unterschiede in den Fluoreszenzsignalen vom ersten bis zum dritten Tag nach der Injektion an den Regionen des Temporal limbus und des oberen Limbus waren nicht signifikant, was auf die Präferenz neutraler Liposomen gegenüber der Limbusregion, insbesondere der Hornhautperipherie, hindeutet. Für die temporalen und oberen Regionen am ersten Tag nach der Injektion war die Fluoreszenz in der Sklera sechsmal höher als im Limbus. Am dritten und siebten Tag waren liposomen in der Sklera in den temporalen und oberen Regionen signifikant reduziert, was auf die Okulären Clearance-Mechanismen zurückzuführen ist.

Die geringste Menge an Fluoreszenz wurde aufgrund der Entfernung von der Injektionsstelle in den nasalen und unteren Regionen nachgewiesen. Es ist wichtig, die Fleckenrahmen entsprechend der Eyemap zu beschriften, bevor die Aufnahme gestoppt wird. Halten Sie die Laserintensität konsistent und definieren Sie den maximalen Hintergrundwert für einen ordnungsgemäßen Vergleich zwischen verschiedenen Experimenten.

Nach der Identifizierung von Leitformulierungen können umfassende pharmakokinetische und Biodistributionsstudien an Tieren durchgeführt werden, um die Bioverfügbarkeit des Arzneimittels zu untersuchen und die therapeutische Wirksamkeit ihrer Formulierungen zu validieren.