Name: Vermehrung von Zahn- und Atmungszellen und -organen in Schwerelosigkeit (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 29 s
Description: Lernen Sie die Kultivierung von ameloblastenähnlichen Zellen in Mikrogravitation mit 3D-Bioreaktor-Technik. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Schmelzbildung und Zellbiologie in vitro.

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Die Studien wurden großzügig durch Zuschüsse des National Institute of Dental and Craniofacial Research (UG3-DE028869 und R01-DE027930) unterstützt.

Es wurden alle erforderlichen institutionellen Genehmigungen eingeholt, um sicherzustellen, dass die Studie den TAMU-Richtlinien für die institutionelle Tierhaltung entspricht.
1. Aufbau und Sterilisation von Bioreaktoren
<ol><li>Sterilisieren Sie vier Gefäße mit hohem Aspektverhältnis (HARV) für den Bioreaktor in einem Autoklaven im Kunststoff-Instrumentenzyklus für 20 Minuten bei 121 °C, wie vom Hersteller empfohlen.</li>
	<li>Nach der Sterilisation montieren Sie die Gefäße in einer Zellkulturhaube, indem Sie die mit dem Bioreaktor gelieferten Schrauben anziehen, wonach die Gefäße einsatzbereit sind.</li>
</ol>2. Gerüste für das Bioreaktor-Kokulturexperiment
<ol><li>Inkubieren Sie die Gerüste zusammen mit den Zellen, um die Zellanhaftung zu unterstützen, die für weiteres Wachstum notwendig ist.</li>
	<li>Wählen Sie zwischen PGA-basierten Gerüsten, Hydroxylapatit-Gerüsten, Graphenplatten, Gelatinescheiben und Kollagen-basierten Gerüsten für Kokulturstudien.</li>
</ol>3. Zervikale Schleife (CL) Dissektion und Einzelzellpräparation
<ol><li>Mäuse durch Enthauptung nach Atemstillstand durch CO2 -Überdosierung opfern. HINWEIS: Alle Tierversuche entsprechen den Richtlinien der TAMU für die institutionelle Tierpflege.</li>
	<li>Zervikale Schleifen von 6 Tagen postnatalen (DPN) Mäusen nach einer modifizierten Version eines zuvor veröffentlichten Protokolls23. HINWEIS: In unserer Studie ist der distale Teil der Zervixschleife enthalten, der nicht im zuvor veröffentlichten Protokoll gezeigt wurde (Abbildung 3).<ol><li>Waschen Sie das sezierte Gewebe vor der Verdauung mit kaltem sterilem PBS bei 37 °C für 30 Minuten.</li>
	</ol></li>
	<li>Die Lösung durch ein 70 μm steriles Zellsieb geben und 10 Minuten lang bei 800 x g weiter zentrifugieren.</li>
	<li>Verwerfen Sie den Überstand. Zentrifugieren Sie das Pellet und waschen Sie es zweimal mit kaltem PBS bei 800 x g. Verwerfen Sie den Überstand.</li>
	<li>Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer und fügen Sie 1 X 105 Zellen pro Gefäß hinzu.</li>
</ol>4. Zellkultur und Zelllinienexpansion der Zahnpulpa
<ol><li>Platte Zahnpulpazellen in einer 100 mm Gewebekulturplatte bei Durchgang 4 in einer Konzentration von 1 x 105.</li>
	<li>Bereiten Sie Medien für die Kultur vor, die aus DMEM-Medien mit hohem Glukosegehalt bestehen, ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum (FBS) und 1% Antibiotikum / Antimykotikum (P / S).</li>
	<li>Wenn die Zellen einen Zusammenfluss von 85-90% erreicht haben, saugen Sie das Medium an und waschen Sie die Platten zweimal mit vorgewärmtem PBS.</li>
	<li>Nach dem PBS-Waschen eine vorgewärmte 0,25% ige Trypsin-EDTA-Lösung auf die Platte geben und die zellhaltigen Platten der Zahnpulpa bei 37 °C für 3 Minuten inkubieren.</li>
	<li>Bestätigen Sie die Zellablösung durch visuelle Inspektion mit einem Mikroskop.</li>
	<li>Sammeln Sie das Medium zusammen mit den Zellen von der Kulturplatte und übertragen Sie es über eine 25-ml-Pipette in ein 50-ml-steriles konisches Röhrchen.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Zellen bei 800 x g für 8 Minuten und verwerfen Sie den Überstand. Resuspendieren Sie die Zellen in frischen Medien und zählen Sie mit einem Hämozytometer.</li>
	<li>Für die Kokultur mit Zervixschleifenzellen säen die Zahnpulpazellen im Bioreaktor in einer Konzentration von 1 x 104 pro Gefäß.</li>
</ol>5. Kokultur von Zervixschleifen-/Zahnpulpazellen auf einem Gerüst im RCCS-Bioreaktor
<ol><li>Fügen Sie beide Zelltypen, die Zervixschleife und die Zahnpulpa, dem Kulturmedium hinzu, das Keratinozyten-SFM-Medien mit ergänzten Wachstumsfaktoren, extrazellulären Matrixproteinen und Gerüsten enthält. HINWEIS: Wachstumsfaktoren werden in einer Konzentration von 0,03 μg/ml Knochenmorphogenetisches Protein 2 (BMP 2), 0,03 μg/ml Knochenmorphogenetisches Protein 4 (BMP-4), 10 ng/ml humaner rekombinanter Fibroblastenwachstumsfaktor (hFGF) und 15 ng/ml epidermaler Wachstumsfaktor (hEGF) hinzugefügt, während ECM-Komponenten 200 μg/ml Matrigel, 5 μg/ml Laminin und 5 μg/ml Fibronektin umfassten.</li>
	<li>Beschichten Sie Gerüste mit einer Mischung aus 500 μL Kollagengel, angereichert mit 1 mg LRAP (Leucin-reiches Amelogeninpeptid) Peptid, 1 mg lyophilisierter Schmelzmatrix im Frühstadium, hergestellt aus Schweinezähnen24, 5 μg / ml Laminin und 5 μg / ml Fibronektin. HINWEIS: Dies funktionierte am besten für unsere Experimente.</li>
	<li>Nach der Gerüstbeschichtung fügen Sie dem Bioreaktor sowohl Zellen als auch Gerüst hinzu und füllen den Bioreaktor mit 10 ml Medium pro Gefäß.</li>
	<li>Schließen Sie die Kappe des Füllanschlusses des Bioreaktorbehälters nach Zugabe von Medien, Zellen und Gerüsten.</li>
	<li>Befestigen Sie die sterilen Ventile zu Beginn des Experiments an den Spritzenöffnungen und halten Sie sie bis zum Ende des Experiments mit einer Abdeckung an Ort und Stelle.</li>
	<li>Sobald der Behälter zu 90% gefüllt ist und die Kappen der Einfüllöffnungen geschlossen und festgezogen sind, öffnen Sie die sterilen Ventile.</li>
	<li>Verwenden Sie zwei sterile Spritzen (3 ml) jedes Mal, wenn ein Medienwechsel erforderlich ist. Füllen Sie eine Spritze mit frischem Medium, während die andere Spritze leer bleibt.</li>
	<li>Öffnen Sie beide Spritzenventile und manövrieren Sie die Blasen vorsichtig in Richtung der leeren Spritzenöffnung.</li>
	<li>Sobald das frische Medium aus der vollen Spritze vorsichtig in das Gefäß injiziert wurde, entfernen Sie die Blasen durch den leeren Spritzenanschluss. HINWEIS: Dieser Vorgang wird durchgeführt, bis alle Mikrobläschen aus den Gefäßen entfernt sind.</li>
	<li>Schließen Sie die Spritzenöffnungen mit Kappen und entsorgen Sie die Spritzen in einem scharfen Abfallbehälter.</li>
	<li>Befestigen Sie jedes Gefäß am Rotatorenboden und legen Sie den Rotatorenboden in einen Inkubator mit einer Temperatur von 5% CO2 und 37 °C.</li>
	<li>Schalten Sie das Gerät ein und stellen Sie die Drehzahl auf 10,1 U/min ein. HINWEIS: Stellen Sie die Geschwindigkeit ein, um sicherzustellen, dass die Gerüste in der Schwebe sind, ohne die Behälterwand zu berühren.</li>
	<li>Stellen Sie die Gefäße für den Medienwechsel in eine aufrechte Position, um sicherzustellen, dass sich die Zellen am Boden absetzen. Öffnen Sie die Spritzenöffnungen und verbinden Sie die sterilen Spritzen mit den Öffnungen.</li>
	<li>Befolgen Sie das gleiche Verfahren, indem Sie 75% des nährstoffarmen Mediums absaugen und frisches Medium durch den anderen Anschluss injizieren.</li>
</ol>6. Lungenorganpräparation und Bioreaktor-basierte Kultur
HINWEIS: E15-Wildtyp-Mauswelpen wurden zur Vorbereitung von Lungenorganen verwendet.
<ol><li>Sezieren Sie das Lungengewebe nach dem Einschläfern einer trächtigen weiblichen Maus mit CO2 -Erstickung.<ol><li>Sobald der Tod nach Erstickung durch zervikale Dislokation bestätigt ist, verwenden Sie ein Skalpell, um die Brusthöhle freizulegen. Danach entfernen Sie die Welpen aus der Gebärmutter und euthanasieren durch Enthauptung.</li>
	</ol></li>
	<li>Bereiten Sie nach der Euthanasierung die Brusthöhle vor, indem Sie sie mit einem Skalpell öffnen, um die Lunge zu lokalisieren. Winzige Abschnitte des Lungengewebes mit sterilem PBS waschen und 2 Stunden lang mit Organkulturmedium in einem Inkubator mit 5% CO2 und 37 °C Temperatur auf eine vorsterilisierte Membran legen.</li>
	<li>Sobald sich das Lungengewebe an der Membran in einer 2D-Organkulturplatte festsetzt, werden die Proben in das Bioreaktorgefäß überführt.</li>
	<li>Bereiten Sie die Medien auf die Kultur vor. HINWEIS: Das Kontroll-DMEM-Hochglukosemedium enthält 10% fötales Rinderserum (FBS), 1% Antibiotikalösung (P / S) (Penicillin, 100 U / ml, Streptomycin, 50 μg / ml) und 100 μg / ml Ascorbinsäure (AA) und für die Induktion von entzündlichen Zuständen wird das Kontrollmedium mit 5 ng / ml IL-6-Protein ergänzt.</li>
	<li>Führen Sie das Lungenkulturexperiment für 10 Tage mit einem Medienwechsel alle 48 Stunden im Bioreaktor wie oben beschrieben durch.</li>
</ol>7. Beschichtetes Gerüst mit humaner Parodontalbandzellkultur (hPDL)
<ol><li>Kultur menschlicher Parodontalbandzellen. HINWEIS: Die Zellen werden in unserem Labor gemäß dem zuvor veröffentlichten Protokoll25 isoliert und kultiviert.</li>
	<li>Beschichten Sie die Kollagengerüstscheiben mit 30 μL PBS für die Kontrollgruppe und dem Neuropeptid Galanin (GAL) in einer Konzentration von 10-8 über Nacht.</li>
	<li>Säen Sie menschliche PDL-Zellen auf dem Kontroll- und GAL-beschichteten Gerüst für 2 Stunden bei 37 °C in einer Kulturplatte aus und übertragen Sie die gesäten Gerüste in ein Bioreaktorgefäß, wie oben erwähnt.</li>
	<li>Kultur der Zellgerüste für 14 Tage im Bioreaktor, bevor die Gerüste zur Analyse geerntet werden.</li>
</ol>8. Reinigung und Wartung von Bioreaktoren
<ol><li>Nachdem die Gerüste/Zellen aus dem Bioreaktor entnommen wurden, entfernen Sie die Spritzenöffnungen aus dem Behälter. HINWEIS: Die Schrauben um die Gefäße werden entfernt und das Gefäß wird vorsichtig mit Seifenwasser gewaschen.</li>
	<li>Spülen Sie die Gefäße mit klarem Wasser ab und ziehen Sie die Schrauben erneut fest.</li>
	<li>Lagern Sie die Gefäße nach dem Autoklavieren bis zur nächsten Verwendung.</li>
</ol>

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<li>Del Moral, P. M., Warburton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Explant+culture+of+mouse+embryonic+whole+lung%2C+isolated+epithelium%2C+or+mesenchyme+under+chemically+defined+conditions+as+a+system+to+evaluate+the+molecular+mechanism+of+branching+morphogenesis+and+cellular+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Explant culture of mouse embryonic whole lung, isolated epithelium, or mesenchyme under chemically defined conditions as a system to evaluate the molecular mechanism of branching morphogenesis and cellular differentiation.</a> Methods in Molecular Biology. 633, 71-79 (2010).</li>
<li>Hermanns, M. I., Unger, R. E., Kehe, K., Peters, K., Kirkpatrick, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+epithelial+cell+lines+in+coculture+with+human+pulmonary+microvascular+endothelial+cells%3A+development+of+an+alveolo-capillary+barrier+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">Lung epithelial cell lines in coculture with human pulmonary microvascular endothelial cells: development of an alveolo-capillary barrier in vitro.</a> Laboratory Investigation. 84 (6), 736-752 (2004).</li>
<li>Duell, B. L., Cripps, A. W., Schembri, M. A., Ulett, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+cell+coculture+models+for+studying+infectious+diseases%3A+benefits+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedicine+and+Biotechnolog%22%5BJournal%5D)">Epithelial cell coculture models for studying infectious diseases: benefits and limitations.</a> Journal of Biomedicine and Biotechnolog. 2011, 852419(2011).</li>
<li>Kuppan, P., Sethuraman, S., Krishnan, U. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+co-culture+of+epithelial+cells+and+smooth+muscle+cells+on+aligned+nanofibrous+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Materials+Science+and+Engineering%3A+C%22%5BJournal%5D)">In vitro co-culture of epithelial cells and smooth muscle cells on aligned nanofibrous scaffolds.</a> Materials Science and Engineering: C. 81, 191-205 (2017).</li>
<li>Navran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+application+of+low+shear+modeled+microgravity+to+3-D+cell+biology+and+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Annual+Review%22%5BJournal%5D)">The application of low shear modeled microgravity to 3-D cell biology and tissue engineering.</a> Biotechnology Annual Review. 14, 275-296 (2008).</li>
</ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Kritische Schritte des Protokolls für das Wachstum von Zellen in Schwerelosigkeit umfassen den Bioreaktor, das Gerüst, die für die 3D-Kultur verwendeten Zellen und die Gerüstbeschichtung als Mittel zur Induktion der Zelldifferenzierung. Der in unseren Studien verwendete Bioreaktortyp umfasst den RCCS-4-Bioreaktor, eine neue Modifikation des ursprünglichen rotierenden zylindrischen Gewebekulturgeräts Rotary Cell Culture System (RCCS), das von der NASA entwickelt wurde, um Zellen in simulierter Schwerelosigkeit zu züchten....

Die Schwerkraft beeinflusst alle Aspekte des Lebens auf der Erde, einschließlich der Biologie einzelner Zellen und ihrer Funktion innerhalb von Organismen. Zellen spüren die Schwerkraft durch Mechanorezeptoren und reagieren auf Änderungen der Schwerkraft, indem sie Zytoskelettarchitekturen neu konfigurieren und die Zellteilungverändern 1,2,3. Weitere Effekte der Schwerelosigkeit sind der hydrostatische Druck in flüssigkeitsgefüllten Vesikel, die Sedimentation von Organellen und die auftriebsgetriebene Konvektion von Strömung und Wärme4. Studien über die Auswirkungen des Gewichtsverlusts auf menschliche Zellen und Organe wurden ursprünglich durchgeführt, um die schwerelose Umgebung des Weltraums auf Astronauten während Raumflugmissionen zu simulieren5. In den letzten Jahren werden diese ursprünglich von der NASA entwickelten 3D-Bioreaktortechnologien zur Simulation der Schwerelosigkeit jedoch als neuartige Ansätze für die Kultur von Zellpopulationen, die sonst nicht für 2D-Kultursysteme zugänglich sind, immer relevanter.
3D-Bioreaktoren simulieren die Schwerelosigkeit, indem sie Zellen in Suspension züchten und so einen konstanten "Freifall"-Effekt erzeugen. Weitere Vorteile der rotierenden Bioreaktoren sind die fehlende Luftexposition in Organkultursystemen, eine Verringerung von Scherspannungen und Turbulenzen sowie eine kontinuierliche Exposition gegenüber einer sich ändernden Nährstoffversorgung. Diese dynamischen Bedingungen, die von einem Rotary Cell Culture System (RCCS) Bioreaktor bereitgestellt werden, begünstigen die räumliche Kolokalisierung und dreidimensionale Assemblierung einzelner Zellen zu Aggregaten 6,7.
Frühere Studien haben die Vorteile eines rotierenden Bioreaktors für die Knochenregeneration8, Zahnkeimkultur9 und für die Kultur menschlicher Zahnfollikelzellen10 gezeigt. Es gibt auch einen Bericht, der darauf hindeutet, dass RCCS die Proliferation und Differenzierung von EOE-Zellen in Ameloblasten verbessert11. Differenzierte Zellen wurden jedoch als Ameloblasten betrachtet, die auf Ameloblastin-Immunfluoreszenz und/oder Amelogenin-Expression allein11 basierten, ohne ihre längliche Morphologie oder polarisierte Zellform zu berücksichtigen.
Neben dem von der NASA entwickelten Bioreaktor Rotating Wall Vessels (RWV) gehören zu den weiteren Technologien zur Erzeugung von 3D-Aggregaten aus Zellen die Magnetschwebebahn, die Zufallspositioniermaschine (RPM) und der Klinostat12. Um eine Magnetschwebebahn zu erreichen, werden Zellen, die mit magnetischen Nanopartikeln markiert sind, mit einer externen Magnetkraft schweben, was zur Bildung von gerüstfreien 3D-Strukturen führt, die für die Biofabrikation von Adipozytenstrukturen verwendet wurden13,14,15. Ein weiterer Ansatz zur Simulation der Schwerelosigkeit ist die Erzeugung multidirektionaler G-Kräfte durch Steuerung der gleichzeitigen Rotation um zwei Achsen, was zu einer Aufhebung des kumulativen Schwerevektors im Zentrum eines Geräts namens Clinostat16 führt. Wenn Knochenmarkstammzellen in einem Klinostat kultiviert wurden, wurde die Knochenneubildung durch die Unterdrückung der Osteoblastendifferenzierung gehemmt, was eine der dedifferenzierenden Effekte der Mikrogravitation veranschaulicht16.
In-vitro-Systeme, die die getreue Kultur von Ameloblasten erleichtern, würden einen großen Schritt in Richtung Zahnschmelz-Tissue Engineering darstellen17. Leider war die Kultur der Ameloblasten bis heute ein herausforderndes Unterfangen18,19. Bisher wurden fünf verschiedene Ameloblasten-ähnliche Zelllinien beschrieben, darunter die Maus-Ameloblasten-Linien-Zelllinie (ALC), die Ratten-Zahnepithelzelllinie (HAT-7), die Maus-LS8-Zelllinie20, die porcine PABSo-E-Zelllinie 21 und die Ratten-SF2-24-Zelllinie22. Die Mehrheit dieser Zellen hat jedoch ihre charakteristische polarisierte Zellform in 2D-Kultur verloren.
In der vorliegenden Studie haben wir uns einem Rotary Cell Culture Bioreactor System (RCCS) zugewandt, um das Wachstum von Ameloblasten-ähnlichen Zellen aus zervikalen Schleifenepithelien zu erleichtern, die mit mesenchymalen Vorläuferzellen kokultiviert wurden, und um die Herausforderungen von 2D-Kultursystemen zu überwinden, einschließlich reduziertem Nährstofffluss und zytoskelettalen Veränderungen aufgrund der Schwerkraft. Darüber hinaus hat das RCCS neue Wege für die Untersuchung von Zell-Gerüst-Interaktionen im Zusammenhang mit parodontalen Tissue Engineering und zur Untersuchung der Auswirkungen von Entzündungsmediatoren auf Lungenalveolargewebe in vitro eröffnet. Zusammen unterstreichen die Ergebnisse dieser Studien die Vorteile von Mikrogravitations-basierten rotatorischen Kultursystemen für die Ausbreitung differenzierter Epithelien und für die Bewertung von Umweltauswirkungen auf in vitro gezüchtete Zellen, einschließlich Zell-Gerüst-Interaktionen und der Gewebereaktion auf entzündliche Zustände.

<table><tbody><tr><td>Antibiotikum-Antimykotikum</td><td>ThermoFisher Scientfic</td><td>15240096</td><td></td></tr><tr><td>Ascorbinsäure</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4544</td><td></td></tr><tr><td>BGJb Fitton-Jackson Modifikationsmedien</td><td>ThermoFisher Scientfic</td><td>12591</td><td></td></tr><tr><td>BIOST PGA Gerüst</td><td>Synthecon</td><td>Custom</td><td>Erhältlich von der Firma über eine Sonderbestellung</td></tr><tr><td>BMP-2</td><td>R & D Systems</td><td>355-BM</td><td></td></tr><tr><td>BMP-4</td><td>R& D Systems</td><td>314-BP</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Media</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D6429-500mL</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>ThermoFisher Scientfic</td><td>16140071</td><td></td></tr><tr><td>Fibricol</td><td>Advanced Biomatrix</td><td>5133-20mL</td><td></td></tr><tr><td>Fibronektin</td><td>Corning</td><td>354008</td><td></td></tr><tr><td>Galanin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G-0278</td><td></td></tr><tr><td>Gelatinescheibe</td><td>Advanced Biomatrix</td><td>CytoForm 500</td><td></td></tr><tr><td>Graphenblätter</td><td>Advanced Biomatrix</td><td>CytoForm 300</td><td></td></tr><tr><td>hEGF</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>hFGF</td><td>ThermoFisher Scientfic</td><td>AA1-155</td><td></td></tr><tr><td>Hydroxylapatit-Scheibe</td><td>Advanced Biomatrix</td><td>CytoForm 200</td><td></td></tr><tr><td>Il-6 Protein</td><td>PeproTech</td><td>200-06</td><td></td></tr><tr><td>Keratinozyten-SFM-Medien (1X)</td><td>ThermoFisher Scientfic</td><td>17005042</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Corning</td><td>354259 LRAP-Peptid</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Peptid 2.0</td><td>Maßgeschneiderte Sequenz: MPLPPHPGSPGYINLSYEVLT PLKWYQSMIRQPPLSPILPEL PLEAWPATDKTKREEVD</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>354234</td><td></td></tr><tr><td>Millipore Nitrozellulosemembran</td><td>Merck Millipore</td><td></td><td></td>AABP04700</tr><tr><td>RCCS Bioreactor</td><td>Synthecon</td><td>RCCS 4HD</td><td></td></tr><tr><td>SpongeCol</td><td>Advanced Biomatrix</td><td>5135-25EA</td><td></td></tr><tr><td>Spritzenventil Einweg-Absperrhahn mit drehbarem Luer-Lock</td><td>Smiths Medical</td><td>MX5-61L</td><td></td></tr><tr><td>Spritzen mit Nadel 3cc</td><td>McKESSON</td><td>16-SN3C211</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin EDTA (0,25%)</td><td>ThermoFisher Scientfic</td><td></td><td></td>25200056</tr></tbody></table>

vermehrung von zahn- und atmungszellen und -organen in schwerelosigkeit

Propagation of Dental and Respiratory Cells and Organs in Microgravity

Die Schwerkraft ist eine der Schlüsseldeterminanten der menschlichen Zellfunktion, Proliferation, Zytoskelettarchitektur und Orientierung. Rotationsbioreaktorsysteme (RCCSs) ahmen den Verlust der Schwerkraft nach, wie er im Weltraum auftritt, und bieten stattdessen eine Mikrogravitationsumgebung durch kontinuierliche Rotation von kultivierten Zellen oder Geweben. Diese RCCSs gewährleisten eine ununterbrochene Versorgung mit Nährstoffen, Wachstums- und Transkriptionsfaktoren sowie Sauerstoff und beheben einige der Mängel der Gravitationskräfte in bewegungslosen 2D-Zell- oder Organkulturschalen. In der vorliegenden Studie haben wir RCCSs verwendet, um zervikale Schleifenzellen und Zahnpulpazellen zu Ameloblasten zu kokulturieren, parodontale Vorläufer-Gerüst-Interaktionen zu charakterisieren und die Wirkung von Entzündungen auf Lungenbläschen zu bestimmen. Die RCCS-Umgebungen erleichterten das Wachstum von Ameloblasten-ähnlichen Zellen, förderten die parodontale Vorläuferproliferation als Reaktion auf Gerüstbeschichtungen und ermöglichten eine Bewertung der Auswirkungen entzündlicher Veränderungen auf kultivierte Lungenbläschen. Dieses Manuskript fasst die Umweltbedingungen, Materialien und Schritte auf dem Weg zusammen und hebt kritische Aspekte und experimentelle Details hervor. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass RCCSs innovative Werkzeuge sind, um die Kultur und das (dreidimensionale) 3D-Wachstum von Zellen in vitro zu beherrschen und die Untersuchung zellulärer Systeme oder Interaktionen zu ermöglichen, die klassischen 2D-Kulturumgebungen nicht zugänglich sind.

Die innere Kammer des Bioreaktors bietet eine Umgebung für die Zellen, um sich zu vermehren und zu differenzieren, sich an einem Gerüst zu befestigen oder sich zu versammeln, um gewebeähnliche Anordnungen zu bilden. Jedes HALV-Gefäß fasst bis zu 10 ml Medium und ermöglicht eine konstante Zirkulation von Nährstoffen, so dass jede Zelle eine ausgezeichnete Überlebenschance hat. Abbildung 1A zeigt die Befestigung der Spritzenöffnungen an der Frontplatte des Behälters, an der sterile Einstoppven...

Dieses Protokoll stellt eine Methode für die Kultur und das 3D-Wachstum von Ameloblasten-ähnlichen Zellen in Schwerelosigkeit vor, um ihre längliche und polarisierte Form sowie die schmelzspezifische Proteinexpression zu erhalten. Auch Kulturbedingungen für die Kultur von parodontalen Engineering-Konstrukten und Lungenorganen in Schwerelosigkeit werden beschrieben.

Vermehrung von Zahn- und Atmungszellen und -organen in Schwerelosigkeit

Gravity is one of the key determinants of human cell function, proliferation, cytoskeletal architecture and orientation. Rotary bioreactor systems (RCCSs) ...

Länglich und polarisiert der Amelogenin-sezernierende Ameloblast in Kultur. Dies ist auch das erste Protokoll für das Züchten von Ameloblastenzellen in Schwerelosigkeit. Das Wachstum von Ameloblasten in der Kultur war eine der größten Herausforderungen im Emailbereich.Und für uns ist es das erste Mal, dass wir dieses Markenzeichen in der Emailforschung erreicht haben. Dieses Modell kann verwendet werden, um die Biologie von Ameloblastenzellen zu verstehen. Dieses Modell wird von Dr. Mirali Pandya vorgeführt.Beginnen Sie, indem Sie das gesammelte Gewebe von sechstägigen postnatalen Mäusen unter das Dissektionsmikroskop und die sezierten Zervixschleifen legen. Richten Sie einen Bioreaktor ein, indem Sie die sterilen Ventile an den Spritzenöffnungen befestigen. Fügen Sie beide Zellen, die Zervixschleife und die Zahnpulpa, zusammen mit einem beschichteten Gerüst in den Bioreaktor und füllen Sie das Bioreaktorgefäß mit 10 Milliliter Keratinozyten-SFM-Medien, ergänzt mit Wachstumsfaktoren und extrazellulären Matrixproteinen.Schließen und straffen Sie die Kappe des Füllanschlusses des Bioreaktorbehälters und öffnen Sie dann die sterilen Ventile. Verwenden Sie zwei sterile Drei-Milliliter-

propagation-of-dental-and-respiratory-cells-and-organs-in-microgravity

Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Frühen embryonalen Lunge Organkultur ist ein sehr nützliches System epithelial-mesenchymale Interaktionen zu untersuchen. Beide epithelialen und mesenchymalen Morphogenese Erlös unter bestimmten Bedingungen, die leicht in das System manipuliert werden kann.

Embryonalen Maus-Lung Kultur, A-System, die molekularen Mechanismen des Branching Bewerten

Raumfahrt Blutdiagnostik brauchen Innovation. Wenige Demonstrationen wurden veröffentlicht Darstellung im Flug, reduzierte Schwerkraft Gesundheit Diagnosetechnik. Hier präsentieren wir eine Methode zur Konstruktion und den Betrieb einer Parabelflug-Prüfstand für einen Prototyp Point-of-Care-Durchflusszytometrie Design, mit Komponenten und Vorbereitung Strategien anpassbar an andere Setups.

Reduzierte Gravitationsbereich Hardware Demonstrationen eines Prototyps Miniaturisierte Durchflusszytometer und Companion Microfluidic Mischtechnik

Zellen in einem dreidimensionalen (3-D) -Umgebung wachsenden stellen eine deutliche Verbesserung gegenüber der Zellkultivierung in 2-D - Umgebungen (beispielsweise Kolben oder Geschirr). Hier beschreiben wir die Entwicklung eines vielzelligen 3-D organotypischen Modell der menschlichen Schleimhaut Darm unter Schwerelosigkeit kultiviert, die von rotierenden Wandgefäß (RWV) Bioreaktoren.

Entwicklung eines unter Schwerelosigkeits Vielzellige Dreidimensionale Organotypischen Modell des menschlichen Darmschleimhaut Grown

Eine vielversprechende Technik, um Gewebe zu generieren baut ohne Verwendung von Matrix an Zellkulturen in simulierter Schwerelosigkeit Zustand ist. Mit einem rotierenden Kultursystem, untersuchten wir Wachstum der Follikel und Eizellreifung Follikel überleben, Morphologie, Wachstums-und Eizelle Funktion unter der Bedingung der simulierten Schwerelosigkeit.

In-vitro- Wachstum der Maus Preantral Follikel in simulierter Schwerelosigkeit

Die NASA GeneLab-Plattform bietet ungehinderten Zugang zu wertvollen Omics Daten aus biologischen Raumfahrt Experimenten. Wir beschreiben, wie eine typische Maus-Experiment im Raum durchgeführt wird und wie Daten aus solchen Experimenten zugegriffen und analysiert werden können.

Auswirkungen der Raumfahrt auf Maus Physiologie mit dem offenen Zugang NASA GeneLab-Plattform erkunden

Der Artikel beschreibt die schrittweise gerichtete Differenzierung von induzierten pluripotenten Stammzellen zu dreidimensionalen ganzen Lungenorganoiden, die sowohl proximale als auch distale epitheliale Lungenzellen zusammen mit Mesenchym enthalten.

Generierung von 3D-Ganzlungenorganoiden aus induzierten pluripotenten Stammzellen zur Modellierung der Lungenentwicklungsbiologie und -krankheit

Dies ist eine Schritt-für-Schritt-Anleitung für die Verwendung eines kommerziell erhältlichen rotierenden Zellkultursystems zur Kultivierung von Lymphozyten in simulierter Schwerelosigkeit mit speziellen Einweg-Kulturgefäßen. Diese Kultivierungsmethode kann auf jede Suspensionszellkultur angewendet werden.

Kultivierung von Lymphozyten in simulierter Schwerelosigkeit mit einem rotierenden Zellkultursystem

Das Protokoll beschreibt einen bildgebenden Bioreaktor, der die selektive Entfernung des endogenen Epithels aus der Luftröhre der Ratten und die homogene Verteilung exogener Zellen auf der Lumenoberfläche ermöglicht, gefolgt von einer langfristigen In-vitro-Kultur des Zell-Gewebe-Konstrukts.

Imaging-geführter Bioreaktor zur Erzeugung von biotechnologisch hergestelltem Atemwegsgewebe

Dieses Protokoll beschreibt die Erzeugung von Organoiden aus A549-alveolären Epithelzellen und MRC-5-Lungenfibroblasten auf einem extrazellulären Matrix-Hydrogelgerüst, gefolgt von der Einbettung in 3D-Kollagen-Gelen und der Exposition gegenüber mechanischer Belastung mit einem zelldehnenden Bioreaktor zur Untersuchung der alveolaren Mechanobiologie.

Erzeugung von 3D-kollagen-eingebetteten A549/MRC-5 Alveolarorganoiden mit einem mechanischen Zellstreckungs-Bioreaktor

Dieses Protokoll beschreibt, wie eine kleine, kostengünstige Wachstumskammer gebaut und betrieben werden kann, die in der Lage ist, extreme Kohlendioxid- (exCO-2)-Werte für Pflanzenexperimente aufrechtzuerhalten. Die Kammer ermöglicht reproduzierbare Studien der mikrogrünen Physiologie unter raumfahrtrelevanten atmosphärischen Bedingungen unter Verwendung eines computergestützten Überwachungs- und Kontrollsystems auf einer eingeteilten Platine sowie eines passiven hydroponischen Wicking-Systems.

Bau und Betrieb einer kostengünstigen erhöhten Kohlendioxidwachstumskammer zur Bewertung der mikrogrünen Physiologie unter raumfahrtrelevantenCO2-Werten

Lernen Sie die Kultivierung von ameloblastenähnlichen Zellen in Mikrogravitation mit 3D-Bioreaktor-Technik. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Schmelzbildung und Zellbiologie in vitro.

Vermehrung von Zahn- und Atmungszellen und -organen in Schwerelosigkeit

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