3D-Bioprinting von murinen kortikalen Astrozyten für die Entwicklung von neuralähnlichem Gewebe

Der 3D-Bioprinting von Astrozyten stellt einen Fortschritt im Neuro Tissue Engineering dar und ermöglicht die Biofabrikation von In-vitro-Modellen, die nützlich sind, um die Mechanismen neurologischer Erkrankungen zu verstehen. Der Hauptvorteil des 3D-Bioprintings besteht darin, Zelladjunktstrukturen zu biofabrizieren, die die biochemischen und mechanischen Eigenschaften des Gewebes nachahmen und ein besseres Verständnis der Zelldynamik in Gesundheit und Krankheit ermöglichen. Dieses Protokoll kann auf die Biofabrikation anderer Weichteile angewendet werden, da es auf dem 3D-Bioprinting einer Biotinte basiert, die aus natürlichen Polymeren und extrazellulären Matrixkomponenten besteht.

Schneiden Sie zunächst das von der eingeschläferten Maus isolierte kortikale Gewebe mit einer gekrümmten Mikroschere in kleine Stücke. Waschen Sie die Gewebestücke dreimal mit einem Milliliter HBSS, indem Sie nach oben und unten pipettieren. Nachdem Sie HBSS zum dritten Mal entfernt haben, fügen Sie einen Milliliter 0,05% Trypsin hinzu und inkubieren Sie das Gewebe fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius.

Für die mechanische Gewebedissoziation die Gewebe-Trypsin-Mischung 15 Mal vorsichtig nach oben und unten pipettieren. Als nächstes übertragen Sie die dissoziierte Mischung in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen und fügen Sie ein gleiches Volumen FBS hinzu, um die Trypsinaktivität zu neutralisieren. Filtern Sie die Suspension durch einen 0,4 Mikrometer großen Zellsiebfilter, um nicht dissoziierte Fragmente zu entfernen.

Waschen Sie den Filter mit einem Milliliter Astrozytenmedium. Pellet durch Zentrifugation die gefilterte Zellsuspension herunter. Nachdem Sie den Überstand verworfen haben, suspendieren Sie das Zellpellet in einem Milliliter Astrozytenkulturmedium.

Die Zellsuspension wird in einen T25-Kulturkolben überführt. Bilden Sie ein mittleres Gesamtvolumen von 3,5 Millilitern und inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid. Zur Gewinnung des Fibrinogens in der Endkonzentration von drei Milligramm pro Milliliter werden 0,9 Milliliter à 10 Milligramm pro Milliliter Fibrinogenlösung in die Gelatine-Gelatine-Methacryloyl-Lösung überführt.

Um den Photoinitiator in der Endkonzentration von 0,5 Gew.-% Vol.-%, zu erhalten, werden 0,015 Gramm Photoinitiator zu der hergestellten Gelatine-Gelatine-Methacryloyl-Fibrinogen-Lösung gegeben. Halten Sie die Lösung nach dem Wirbeln bei 40 Grad Celsius, geschützt vor Licht, um pi-Degradation zu vermeiden. Als nächstes filtern Sie die Lösung durch einen 0,2-Mikrometer-Filter in ein steriles konisches 15-Milliliter-Röhrchen.

980 Mikroliter der Biomateriallösung werden in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen überführt. Um das Laminin in der Endkonzentration von zwei Mikrogramm pro Milliliter zu erhalten, werden 20 Mikroliter verdünntes Laminin in das Röhrchen gegeben, das Biotinte enthält. Mischen Sie vorsichtig, indem Sie auf und ab pipettieren, Blasen vermeiden und die Bio-Tintenlösung bei 37 Grad Celsius halten, bis sie bereit ist, mit den Zellen gemischt zu werden.

Trypsinisieren Sie die primären Astrozyten mit 0,05% Trypsin für 5 Minuten und neutralisieren Sie die Trypsinaktivität mit FPS in einem Verhältnis von eins zu eins. Dann die Zellen in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen übertragen und fünf Minuten lang bei 200 mal G zentrifugieren. Nach dem Zählen der Zellen 1 mal 10 zu den 6 Zellen in ein anderes konisches Rohr und eine andere Zentrifuge übertragen, wie gezeigt.

Lassen Sie nur 200 Mikroliter des Überstands im Röhrchen und suspendieren Sie das Zellpellet, indem Sie vorsichtig auf den Boden des konischen Rohres klopfen. Um eine Endkonzentration von 1 mal 10 auf die 6 Zellen pro Milliliter zu erhalten, einen Milliliter Gelatine-Gelatine-Methacryloyl-Fibrinogenlösung in das Röhrchen geben, das die Zellen enthält, und homogenisieren Sie es durch vorsichtiges Pipettieren auf und ab. Verwenden Sie eine 1000-Mikroliter-Pipette, um die in Gelatine-Gelatine-Methacryloyl-Fibrinogen-Biotintenlösung gelegten Astrozyten langsam auf eine Fünf-Milliliter-Kunststoffspritze zu übertragen und die Bildung von Blasen zu vermeiden.

Schließen Sie eine sterile stumpfe 22-Gauge-Nadel an die Spritze an. Den Bioprinter 15 Minuten lang UV-Licht aussetzen und dann den Bioprinter mit 70% Ethanol abwischen, dann die Spritze an den Bioprinter-Druckkopf anschließen und die Biotinte manuell spülen, um die verbleibenden Blasen zu entfernen. Um Bioprinting durchzuführen, legen Sie die 35-Millimeter-Kulturschale auf den Bioprinter-Tisch, positionieren Sie die Nadel 0,1 Millimeter von der Oberfläche der Kulturschale entfernt, um eine Bewegung der Nadel zu ermöglichen, und drücken Sie die Taste “Print”.

Sobald der Bioprinting abgeschlossen ist, stellen Sie sicher, dass sich die Spritze von der Schüssel entfernt und die Kulturschale verschließt. Stellen Sie die Kulturschale unter UV-Licht, um eine Gelatine-Methacryloyl-Vernetzung zu erhalten. Verwenden Sie einen sterilen Spatel, um das biogedruckte Konstrukt auf eine 24-Well-Platte zu übertragen.

Fügen Sie 500 Mikroliter Thrombin-Calciumchlorid-Lösung hinzu und lassen Sie sie 30 Minuten einwirken, um eine Fibrinvernetzung zu ermöglichen. Nachdem Sie die Vernetzungslösung entfernt haben, waschen Sie das Konstrukt mit zwei Millilitern PBS und ersetzen Sie dann das PBS durch einen Milliliter Astrozytenkulturmedium. Bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid inkubieren und das Medium alle drei Tage wechseln.

Verwenden Sie einen Spatel, um das biogedruckte Konstrukt in eine 35-Millimeter-Kulturschale zu übertragen. Waschen Sie das Konstrukt mit einem Milliliter PBS. Geben Sie 100 Mikroliter des lebenden toten Reagenzes über das Konstrukt und halten Sie es 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius, um es vor Licht zu schützen.

Nachdem Sie das lebende tote Reagenz entfernt haben, waschen Sie das Konstrukt wie gezeigt mit PBS. Übertragen Sie die Probe in eine konfokale Schale und beobachten Sie die Zellen innerhalb des Konstrukts unter einem konfokalen Mikroskop mit 488 und 570 Nanometer Anregung zur Bildaufnahme. Nach dem 3D-Bioprinting wurde die Integrität des biogedruckten Gerüsts geschätzt und die Bildung einer klar definierten Struktur mit Zellen beobachtet, die im Biomaterial eingeschlossen waren.

Nach Bioprinting- und Vernetzungsprozessen zeigten die meisten Zellen eine runde Morphologie, wenn das Konstrukt mit einem Astrozytenmedium inkubiert wurde. Die biogedruckten Gerüste behielten nach sieben Tagen Inkubation ihre Integrität bei, und obwohl einige runde Zellen beobachtet wurden, breiteten sich viele Astrozyten im gesamten Konstrukt aus und zeigten astrozytäre Morphologie und Verbindung. Die Zelllebensfähigkeit wurde direkt nach dem Bioprinting bewertet und die Ergebnisse zeigten, dass lebensfähige Zellen bei der niedrigeren Geschwindigkeit bis zu 74% der Gesamtzellen ausmachten, was signifikant höher ist als Zellen, die mit höherer Geschwindigkeit biogedruckt wurden.

Die Lebensfähigkeit von biogedruckten Astrozyten wurde auf 2D-kultivierte Astrozyten normalisiert und die Ergebnisse zeigten, dass die biogedruckten Astrozyten am siebten Tag die Lebensfähigkeit signifikant erhöht hatten. Unmittelbar nach dem Bioprinting zeigten die Astrozyten eine runde Morphologie und einen Live-Dead-Assay. Nach einer Woche breiteten sich die Astrozyten im gesamten Konstrukt aus und zeigten eine ausgeprägte Morphologie der Zellen, identisch mit der 2D-Kultur.

Die 3D-biogedruckten Astrozyten waren durch Immunfluoreszenz gekennzeichnet. Nach siebentägiger Inkubation im biogedruckten Konstrukt wurden hochdichte Astrozyten mit einer sternartigen Morphologie beobachtet. Die biogedruckten Astrozytenzellen exprimierten den spezifischen Astrozytenmarker Gliafibrillär saures Protein zeigt die Beibehaltung des astrozytären Phänotyps nach sieben Tagen Bioprinting an, und diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Biotintenzusammensetzung eine biokompatible Mikroumgebung bot, um die Adhäsion, Ausbreitung und das Wachstum der Astrozyten zu fördern.

Die Bewertung der Expression spezifischer Gene und Zellmarker durch die biogedruckten Astrozyten würde Hinweise auf die neurogewebeähnliche Funktion liefern, wie z.B. die astrozytäre Reaktivität nach spezifischen Reizen. Dieses Protokoll ebnet den Weg für die Biofabrikation komplexerer neuroähnlicher Strukturen, die aus verschiedenen Zelltypen in Biomolekülen bestehen und die Nachahmung spezifischer neurogener Nischen ermöglichen.