Hochdruck-NMR-Experimente zum Nachweis von proteinarmen Konformationszuständen

Hochdruck ist die Methode der Wahl, um die relative Population einer Proteinkonformationsprobe zu verändern. Es ist äußerst nützlich für die Isolierung und Charakterisierung hochenergetischer Konformationszustände. Im Vergleich zu allen Störungsmethoden, wie pH-Wert oder Temperatur, ist die Druckstörungen einfach anzuwenden und vollständig reversibel.

Es ist auch eine lokale Störung, die hauptsächlich Regionen mit Glashohlräumen oder Hohlraumvolumina betrifft. Führen Sie zunächst die mit Stickstoff 15 markierte Probe mit einer Glaspipette in das Zirkonoxidröhrchen ein und stellen Sie sicher, dass die Probe am Boden des Röhrchens sitzt. Um zu verhindern, dass sich die Probe mit der Transmissionsflüssigkeit vermischt, überlagern Sie die Probe mit 200 Mikrolitern Mineralöl und füllen Sie dann den Rest des Röhrchens mit Transmissionsflüssigkeit.

Legen Sie einen Einweg-O-Ring auf das Zirkonoxidrohr und schieben Sie das Rohr in die Basis. Verbinden Sie dann das Rohr mit der Hochdruck-Haltelinie und ziehen Sie die Basis von Hand an der Zelle fest. Wenden Sie dann ein Drehmoment von 14,7 Newtonmetern an, um Leckagen bei niedrigerem Druck zu vermeiden.

Um die Integrität der Druckzellenanordnung zu überprüfen, drücken Sie das Rohr bis zu 300 bar außerhalb des Spektrometers mit Zellunterstützung und Containment-Gefäß unter Druck. Setzen Sie den Druck nach 15 Minuten auf einen Bar zurück und überprüfen Sie mit einem sauberen, fusselfreien Tuch auf Lecks. Setzen Sie das drucklose Rohr in das Spektrometer ein, indem Sie die Seillinie vorsichtig führen.

Schieben Sie das Röhrchen in das Spektrometer, bis das Röhrchen die Sitzposition der Probe erreicht. Sperren, shimen, passen und stimmen Sie die Protium- und Stickstoffkanäle ab und speichern Sie die optimierten Shims für die Zukunft. Richten Sie eine transversale Relaxationsoptimierte Spektroskopie mit Hetero-Einzelquantums-kohärenter Spektroskopie ein und fahren Sie mit der Aufzeichnung eines Referenzexperiments unter atmosphärischen Bedingungen fort.

Zeichnen Sie eine Reihe von 2D-Experimenten von einem Balken bis zu 2,5 Kilobar pro 500 Balken auf. Wenn die genauen Falt- oder Entfaltungsraten bekannt sind, lassen Sie die Probe nach jedem 500-bar-Inkrement für 15 bis 20 Minuten ausgleichen. Wenn der Wendepunkt des Falt- oder Entfaltungsübergangs erreicht ist, zeichnen Sie zusätzliche Experimente auf, um die Präzision der Passform zu verbessern.

Mit diesem Protokoll wurde die Druckabhängigkeit von RRM2, dem zweiten RNA-Erkennungsmotiv des heterogenen kernen Ribonukleoproteins A1, untersucht. Die transversale Relaxationsoptimierte Spektroskopie mit Hetero-Einzelquantenkohärenzspektroskopiespektren wurde an einem Bar, 1,5 Kilobar, zwei Kilobar und 2,5 Kilobar gesammelt. Der RRM2 ist im 2,5-Kilobar-Bereich nahezu vollständig entfaltet. Individuelle Druckintensitätsprofile wurden nach der hier gezeigten Gleichung angepasst, um die entsprechenden Änderungen der freien Energie und des Volumens der Gibbs-Standardgibs zu erhalten, die mit der Entfaltungsreaktion verbunden sind.

Bei der Kartierung auf die Domänenstruktur wurden die Rückstände mit der größten Größe der Volumenänderung innerhalb des Domänenstrukturkerns gefunden, während sich diejenigen mit der geringsten Volumenänderung hauptsächlich in den Verbindungsschleifen zwischen den Beta-Strängen und dem Beta-Strang zur C-Terminal-Helix befanden. Um den Grad der Kompressibilität und Konformationsheterogenität des gefalteten Zustandsensembles zu untersuchen, wurden die protiumchemischen Verschiebungen analysiert. Individuelle Profile von protiumchemischen Verschiebungen in Abhängigkeit vom Druck wurden mit der gezeigten Gleichung angepasst, um die ortsspezifischen linearen und nichtlinearen Koeffizienten zu extrahieren.

Die Rückstände mit den größten nichtlinearen Koeffizienten befanden sich meist im strukturellen Kern der Domäne, während Rückstände mit den kleinsten nichtlinearen Koeffizienten meist in Schleifen lagen, die die verschiedenen Strukturmotive miteinander verbanden. Es ist wichtig, das Rohr korrekt als Druck einzustellen, um Leckagen zu vermeiden. Wenn ein Leck auftritt, müsste die Sonde wahrscheinlich entfernt werden, um jede Spur von Mineralöl zu entfernen.