Planarien-Ovarialdissektion für die Ultrastrukturanalyse und Antikörperfärbung
10. September 2021
Dieses Protokoll stellt die Schritte vor, die unternommen wurden, um die Eierstöcke der Süßwasserplanarien (Schmidtea mediterranea) zu sezieren.Die präparierten Eierstöcke sind für die Antikörper-Immunfärbung und die Ultrastrukturanalyse mit der Transmissionselektronenmikroskopie kompatibel, um die Zellbiologie der Eizellen und Körperzellen zu untersuchen, und bieten eine Bildgebungstiefe und -qualität, die bisher unzugänglich waren.
Ziel dieser Methode ist es, die Eierstöcke der Planarien Schmidtea mediterranea für die zelluläre und subzelluläre Analyse der Eizellbiologie mit TEM oder Antikörperfärbung zu präparieren. Dieses Protokoll verwendet einen kurzen Fixationsschritt, um die Lokalisierung und Dissektion von Planarien-Eierstöcken zu erleichtern, was eine Bildtiefe und -qualität bietet, die bisher nicht zugänglich waren. Die größte Herausforderung für jemanden, der diese Technik noch nie zuvor durchgeführt hat, wird darin bestehen, die Eierstöcke nach der Fixation zu lokalisieren.
Es ist hilfreich, sich vor dem Experiment mit der Anatomie der sexuellen Planarien vertraut zu machen. Bereiten Sie sich auf das Experiment vor, indem Sie Geschlechtsplanarien zweimal pro Woche mit Bio-Leberpaste füttern, um die Geschlechtsreife zu erreichen. Behandeln Sie geschlechtsreife Würmer mit 5%N-Acetyl-L-Cystein oder NAC in einer Schale bei Raumtemperatur für fünf Minuten.
Ersetzen Sie NAC durch 10 Milliliter frisch zubereitetes 4%iges Paraformaldehyd und fixieren Sie die Würmer eine Stunde lang bei Raumtemperatur unter gelegentlichem Schütteln. Beginnen Sie die Dissektion 10 Minuten nach Zugabe von 4%Paraformaldehyd, während die Würmer fixiert werden. Beobachten Sie die epitheliale Pigmentierung, um die ventralen Nervenstränge zu lokalisieren, die als zwei Linien mit hellerer Pigmentierung erscheinen, die von den vorderen Kopfganglien zum Schwanz verlaufen.
Lokalisieren Sie die mutmaßlichen Eierstöcke, indem Sie die Pigmentierung beobachten und ihre Position bestätigen. Führen Sie mit zwei chirurgischen Messern Schnitte hinter und vor den Eierstöcken durch, um die vorderen und hinteren Wurmfragmente vollständig zu entfernen. Verwenden Sie ein Messer, um die Wurm zu verankern, und das andere Messer für das Sezieren.
Reinige das Messer, mit dem du die Schnitte gemacht hast. Um die beiden Eierstöcke zu trennen, schneiden Sie die Mittellinie des Eierstockfragments ein und drehen Sie das Fragment dann mit der Bauchseite nach unten. Verwenden Sie zwei Paar spitze Pinzetten vom Typ 5-SA, um das Rückengewebe abzuziehen und den Darm freizulegen.
Entfernen Sie vorsichtig die Darmäste, die über dem Bauchgewebe sitzen, mit der Spitze der Pinzette oder einer weichen Bürste, um den Eierstock freizulegen. Entferne das umgebende Gewebe, um den Eierstock herauszunehmen. Nehmen Sie die Eierstöcke heraus und geben Sie sie in eine 1,5-Milliliter-Tube, um sie mit 1 Milliliter PBS zu waschen.
Die dorsalen und ventralen Pigmentmuster wurden verwendet, um die Position der Eierstöcke zu lokalisieren. Überschüssiges Gewebe wurde Schritt für Schritt entfernt. Sobald der Eierstock freigelegt war, wurde das umgebende Gewebe abgeschnitten.
Eierstöcke mit mehreren somatischen Zelltypen wurden sowohl für die Ultrastrukturanalyse als auch für die Immunfluoreszenzfärbung verwendet. Die präparierten Eierstöcke ermöglichen eine qualitativ hochwertige Bildgebung der zellulären und subzellulären Anatomie der Eizellen. Dieses Verfahren soll RNA-Interferenzexperimente ermöglichen, um molekulare Regulationen der Eizellbiologie zu untersuchen.
Diese Technik führte zur Entdeckung eines neuen Phänomens in den Eizellen von Plattwürmern, dass die Kernhülle in Vesikel zerfällt, die Kernproteine einkapseln, anstatt intakt zu bleiben, was als geschlossene Mitose bezeichnet wird, oder in Stücke zerbricht, auch bekannt als offene Mitose.
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Übersicht
Dieses Protokoll beschreibt die Dissektion von Ovarien im Süßwasserplanarien Schmidtea mediterranea, die darauf abzielt, die zelluläre und subzelluläre Analyse der Oozytenbiologie zu ermöglichen. Die Methode verbessert die Bildqualität und -tiefe durch Techniken wie die Transmissions-Elektronenmikroskopie (TEM) und die Antikörper-Immunfärbung.
Wesentliche Studienkomponenten
Forschungsbereich
- Zellbiologie
- Oozyten-Analyse
- Planarienbiologie
Hintergrund
- Die Anatomie von geschlechtsreifen Planarien ist entscheidend für eine effektive Dissektion.
- Die Fütterung von Planarien mit organischer Leberpaste fördert die Geschlechtsreife.
- Die Lage der Eierstöcke ergibt sich aus den Pigmentierungsmustern des Epithels.
Verwendete Methoden
- Chirurgische Dissektionsmethoden
- Süßwasserplanarie Schmidtea mediterranea
- Transmissions-Elektronenmikroskopie (TEM) und Immunfluoreszenzfärbung
Hauptergebnisse
- Effiziente Lokalisation und Dissektion von Eierstöcken aus geschlechtlichen Planarien.
- Hochwertige Abbildung zellulärer Strukturen und somatischer Zelltypen.
- Die Methode ermöglicht RNA-Interferenz-Experimente zur Untersuchung molekularer Regulationen.
Schlussfolgerungen
- Diese Studie stellt eine neuartige Technik zur Analyse von Fortpflanzungszellen bei Planarien bereit.
- Sie vertieft das Verständnis der Oozytenbiologie und unterstützt zukünftige genetische Untersuchungen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Der direkte Zugang zu intakten Planarien-Ovarien ermöglicht eine hochauflösende Analyse der Keimzellenentwicklung und unterstützt die mechanistische Risikominderung in der frühen Forschung. Dieses Protokoll erleichtert die quantitative Bildgebung und molekulare Untersuchung der Oozytenbiologie und verbessert die Vorhersagegenauigkeit in Keimbahnstudien. Der Ansatz ist geeignet, die Zielvalidierung und funktionelle Genomik in Arbeitsabläufen der Reproduktionsbiologie zu unterstützen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die präzise Untersuchung der Keimzellenentwicklung und meiotischer Prozesse.
- Ermöglicht die funktionelle Validierung von Genstörungen mittels RNA-Interferenz in Oozyten.
- Verbessert die mechanistische Klarheit bei der Auswahl und Entschärfung reproduktiver Zielstrukturen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Ermöglicht die standardisierte Aufbereitung intakter Eierstöcke für nachgeschaltete Bildgebung und antikörperbasierte Analysen.
- Erleichtert die reproduzierbare quantitative Analyse zellulärer und subzellulärer Strukturen.
- Ermöglicht eine robuste Beurteilung der Genfunktion unter kontrollierten experimentellen Bedingungen.
Translationale und präklinische Forschung
- Ermöglicht die Untersuchung keimbahnbezogener epigenetischer Prozesse und zellulärer Architektur an krankheitsrelevanten Modellen.
- Unterstützt die kontinuierliche Forschung von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung reproduktiver Zielstrukturen.
- Bietet vorhersagekräftige Erkenntnisse zu konservierten Mechanismen der Oozytenbiologie.
Pipeline- und Workflow-Integration
Dieses Dissektionsprotokoll lässt sich in die frühen Phasen der Entdeckung und Zielvalidierung integrieren und ermöglicht nachgeschaltete ultrasruckturelle sowie immunhistochemische Analysen. Es unterstützt Arbeitsabläufe von der Hypothesenprüfung bis zur Genfunktionsanalyse in Keimbahnsystemen.
- Entdeckungsbiologie: Ermöglicht hypothesengetriebene Untersuchungen zur Keimzellspezifikation und meiotischen Regulation.
- Screening: Stellt für Assays vorbereitetes Ovarialgewebe für quantitative Bildgebung und Antikörperscreening bereit.
- Analytik: Liefert zelluläre und subzelluläre Messgrößen mit hoher Auflösung für vergleichende Analysen.
- Translationale Forschung: Verbindet grundlegende Erkenntnisse mit der präklinischen Evaluierung reproduktiver Zielstrukturen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Etabliert ein wiederverwendbares Protokoll für vielfältige Untersuchungen zur Keimbahn und Genveränderungen.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit und verringert Mehrdeutigkeiten bei der Validierung von Keimbahnzielen.
- Operativer Wert: Standardisiert die Dissektion und Bildgebung von Eierstöcken, um Reproduzierbarkeit zu gewährleisten.
- Strategischer Wert: Ermöglicht fundierte Go/No-Go-Entscheidungen in Programmen der Fortpflanzungsbiologie.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung von Keimbahnzielen und Genfunktionsstudien.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der Planarienanatomie und Dissektionsmethoden.
- Benötigt Zugang zu einer Infrastruktur für die Transmissionselektronenmikroskopie und Immunfärbungen.
- Setzt eine standardisierte Vorgehensweise über Teamgrenzen hinweg für reproduzierbare Gewebepräparation und Bildgebung voraus.
- Kann Anpassungen erfordern, um sie auf andere wirbellose Organismen oder Keimbahn-Modellsysteme zu übertragen.
- Ist durch die geringe Anzahl und tiefe Lokalisation der Planarienoocyten begrenzt.
