Name: Ein intaktes ischämisches Nagetiermodell des Perikards (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 15 s
Description: Erfahren Sie ein intaktes ischämisches Nagetiermodell des Perikards bei Mäusen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung der Rolle des Perikards bei der Herzreparatur nach Myokardinfarkt.

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Für diese Experimente wurden männliche und weibliche C57BL/6J-Mäuse im Alter zwischen 8 und 14 Wochen verwendet. Dieses Protokoll wurde vom Animal Care Committee der University of Calgary ethisch genehmigt und entspricht allen Tierpflegerichtlinien.
1. Vorbereitung und Operation der Maus
<ol><li>Sterilisieren Sie chirurgische Instrumente (über Perlensterilisator oder Autoklav).</li>
	<li>Wiegen Sie die Maus für das präoperative Gewicht und die analgetische Dosis.</li>
	<li>Legen Sie die Maus in eine Induktionsbox mit 4% Isofluran und 800 ml/min Sauerstoff. Bestätigen Sie die Anästhesieebene, indem Sie die Zehen einklemmen und das Tier auf Mangel an Reflex beobachten.</li>
	<li>Injizieren Sie das Analgetikum subkutan (0,1 mg/kg Buprenorphin) (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Legen Sie die Maus während der Operation auf ein beheiztes OP-Pad und halten Sie die Anästhesie mit 3% Isofluran aufrecht, das über den Nasenkonus verabreicht wird. Tragen Sie eine Augensalbe auf, um trockene Augen für jedes Auge zu vermeiden.</li>
	<li>Rasieren Sie die Haare aus den Brust- und Nackenbereichen.</li>
	<li>Halten Sie die Pfoten der Maus fest und positionieren Sie sie auf dem OP-Tisch.</li>
	<li>Intubieren Sie die Maus, indem Sie einen 23-G-Katheter mit glatter Spitze durch den Mund und den Rachen in die Luftröhre einführen.<ol><li>Belüften Sie die Maus nach der Intubation mit 2 % Isofluran und 100 % Sauerstoff als Trägergas mit einem handelsüblichen Beatmungsgerät (siehe Materialtabelle) mit einer Geschwindigkeit von 110 Atemzügen/min, einem Atemzugvolumen von 250 μl und einem positiven endexspiratorischen Druck (PEEP) von 4 mmHg.</li>
	</ol></li>
	<li>Rollen Sie die Maus 30% auf der rechten Seite, um die linke Seite der Brust für die Operation zu positionieren.</li>
	<li>Reinigen Sie den Operationsbereich mit 3 abwechselnden Peelings aus 70% Ethanol und Betadin in kreisförmigen Bewegungen (sieheMaterialtabelle). Legen Sie sterile OP-Abdecktücher um den Operationsbereich herum.</li>
	<li>Machen Sie einen 2-3 cm langen seitlichen Schnitt in die Haut der Brust, um die Brustmuskeln auf der linken Seite sichtbar zu machen. Schneiden Sie den Pectoralis major und minor mit einem 1 cm langen Schnitt von der Mittellinie nach außen, um die Interkostalmuskulatur zwischen der dritten und vierten Rippe sichtbar zu machen. HINWEIS: Es sollte darauf geachtet werden, dass übermäßige Blutungen aus dem Musculus pectoralis durch Kauterisation blutender Gefäße vermieden werden.</li>
	<li>Machen Sie einen 2 cm langen Schnitt in den linken Interkostalmuskel, um Luft (durch passive Luftbewegung) in die Brusthöhle einzuführen, damit Herz und Lunge vom chirurgischen Schnitt abfallen können. Erweitern Sie die Öffnung mit Hilfe eines Kauterisationsgeräts (siehe Materialtabelle), um die Interkostale zu schneiden und Blutungen zu verhindern HINWEIS: Das Beatmungsgerät sollte während der Kauterisation vorübergehend gestoppt werden, um explosive Reaktionen mit Sauerstoff zu vermeiden. Es wird darauf geachtet, den Perikardsack nicht zu beschädigen.</li>
	<li>Ziehen Sie die Rippen mit Retraktoren zurück, um das Herz freizulegen.</li>
	<li>Beobachten Sie den Perikard und das darunter liegende Herz unter einem Stereomikroskop. HINWEIS: Das Perikard der Maus ist dünn genug, um das Gefäßsystem des Herzens sichtbar zu machen.</li>
	<li>Legen Sie eine Pinzette vorsichtig auf die Oberfläche des Perikards, um seine Bewegung und die des darunter liegenden Herzens zu reduzieren.</li>
	<li>Visuelle Markierung der linken vorderen absteigenden Koronararterie (LAD), indem sie ihren Austritt unter dem linken Anhängsel verfolgt.</li>
	<li>Führen Sie mit dem Mikronadeltreiber eine geeignete Naht (siehe Materialtabelle) durch das Perikard unter dem LAD, wobei die Naht auf der anderen Seite des LAD und des Perikards hervortritt. Binden Sie die Naht zusammen, um den Blutfluss durch die Koronararterie einzuschränken, und schneiden Sie die überschüssige Naht mit Hilfe einer Schere ab (Abbildung 1A). HINWEIS: Bei Einschränkung des Blutflusses zur Koronararterie sollte eine Blanchierung des vorderen Teils des linken Ventrikels sichtbar sein. Bei diesem Verfahren handelt es sich um ein permanentes Ligaturmodell. In diesem Stadium könnte jedoch auch ein transienter Ligationsansatz mit unterschiedlichen Ischämieperioden angewendet werden.</li>
	<li>Führen Sie unterhalb der Inzisionsstelle im sterilen Bereich einen 24-G-Katheter perkutan in den Brustkorb ein (entfernen Sie die Führungsnadel nach dem Eintritt in die Brusthöhle). Schließen Sie dann die Rippen, gefolgt von den Muskelschichten und der Haut mit einer geeigneten Naht (eine konische Nadel für den Muskel, eine herkömmliche Schneidnadel für die Haut).</li>
	<li>Sobald der Brustkorb geschlossen ist, entleeren Sie die verbleibende Luft aus der Brusthöhle über den 24-G-Katheter mit einer sanften Absaugung mit einer 3-ml-Spritze und Thoraxkompressionen. Sobald die Luft entfernt ist, ziehen Sie den 24-G-Katheter zurück.</li>
	<li>Reduzieren Sie das Isofluran auf 1%.</li>
	<li>Schalten Sie das Isofluran aus, während Sie die Beatmung mit Sauerstoff aufrechterhalten, damit sich die Maus von der Anästhesie erholen kann. Sobald das Tier Anzeichen einer selbstständigen Atmung zeigt, entfernen Sie den 23 G Trachealschlauch aus dem Maul und legen Sie die Maus in einen Aufwachkäfig, um die Wiederaufnahme der normalen Atmung zu überwachen.</li>
	<li>Warten Sie, bis sich die Maus im Käfig erholt hat, wobei ein Teil des Käfigs auf ein Wärmekissen gelegt wird, um eine externe Wärmequelle bereitzustellen.</li>
	<li>Erhaltungsinjektionen des Analgetikums (Buprenorphin 0,1 mg/kg, subkutan) alle 12 h für 72 h nach der Operation verabreichen.</li>
	<li>Überwachen Sie den Gesundheitszustand von Mäusen täglich für 7 Tage, einschließlich der Bewertung von Einschnitten und Beschwerden der Tiere. HINWEIS: Aufgrund der Invasivität dieses Verfahrens (Thorakotomie) kann die Verabreichung von Antibiotika erforderlich sein.</li>
</ol>2. Funktionelle Beurteilung der Herzfunktion mittels Echokardiographie (EKG)
<ol><li>Induzieren und halten Sie die Maus unter Vollnarkose mit 1,5-2% Isofluran und 800 ml/min Sauerstoff.</li>
	<li>Legen Sie die Maus in Rückenlage auf eine beheizte Bühnenplattform und befestigen Sie die Pfoten an den EKG-Elektroden.</li>
	<li>Rasieren Sie die Brust der Maus.</li>
	<li>Nehmen Sie Echokardiographie-Bilder mit einer 40-MHz-Linearwandlersonde und Kontaktgel auf und analysieren Sie sie mit der entsprechenden Software (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Schalten Sie das Isofluran aus und lassen Sie die Maus auf der Heizplattform regenerieren, bevor Sie den Käfig wieder in einen aktiven Zustand versetzen. HINWEIS: Die Echokardiographie-Beurteilung ist nicht-invasiv und kann daher während des gesamten Experiments longitudinal durchgeführt werden, um Veränderungen vor und nach der Koronarligatur zu bestimmen.</li>
</ol>3. Entnahme von Herzgewebe zur Fibrose-Färbung
<ol><li>Opfern Sie die Mäuse mit Inhalation von 100% CO2 und sezieren Sie das Herz vorsichtig. HINWEIS: Mit Schere und Pinzette wird dies erreicht, indem die großen Gefäße durchtrennt werden, die in das Herz eintreten (Vena cava, Lungenvene) und es verlassen (Lungenarterie, Aorta), um es aus dem Kreislaufsystem in der Brusthöhle zu lösen.</li>
	<li>Fixieren Sie das Herz in 10% Formalin für mindestens 24 Stunden.</li>
	<li>Schneiden Sie Proben mit einer geraden Rasierklinge durch den rechten Ventrikel, das interventrikuläre Septum und den linken Ventrikel, um sicherzustellen, dass der Schnitt durch das Zentrum der Infarktzone ging. Die Proben werden dann zur Einbettung von Paraffin an die Core Facility geschickt.</li>
	<li>Schneiden Sie Gewebeschnitte von 5 μm Dicke mit einem Mikrotom aus und legen Sie sie zum Färben auf Glasobjektträger.</li>
	<li>Entparaffinieren Sie mit handelsüblichem Xylol und abgestuftem Alkohol (2x 99%, 1x 95%, 1x 70%) mit deionisiertem Wasser, dann rehydrieren.</li>
	<li>Mit 0,1% Siriusrot in Pikrinsäure für 2 h bei Raumtemperatur färben.</li>
	<li>Abschnitte mit 0,5% Essigsäure für 3 min waschen und mit 70% Ethanol für 1 min spülen.</li>
	<li>Die Abschnitte werden in umgekehrter Reihenfolge der Wäschen wie in 3.4 beschrieben mit steigender und abgestufter Ethanolkonzentration und dann mit Xylol dehydriert.</li>
	<li>Montieren Sie Gewebeschnitte mit einer Befestigungslösung (siehe Materialtabelle) zur mikroskopischen Auswertung.</li>
</ol>4. Durchflusszytometrie der Herz- und Perikardhöhlenspülung
<ol><li>Opfern Sie die Mäuse mit Inhalation von 100%CO2 zur Wirkung.</li>
	<li>Legen Sie die Maus auf den Rücken und fixieren Sie die Arme und Beine mit Klebeband an einem OP-Brett.</li>
	<li>Öffnen Sie vorsichtig die linke Seite (rechte Seite aus der Sicht des Experimentators) der Brusthöhle, beginnen Sie mit dem Schneiden des Zwerchfells bis etwa zum Mittelpunkt und schneiden Sie anschließend durch die äußeren Rippen in Richtung Brustbein. HINWEIS: Vermeiden Sie es, große Blutgefäße einzuklemmen, insbesondere solche, die parallel zum Brustbein verlaufen.</li>
	<li>Ziehen Sie die Rippen mit einem Hämostat zurück, um das darunter liegende Herz und Perikard freizulegen. HINWEIS: Der Herzbeutel ist sehr zerbrechlich, achten Sie also darauf, ihn während des Schneidens nicht mit einer Schere zu fangen.</li>
	<li>Injizieren Sie 100 μl sterile Kochsalzlösung mit einem PE-10-Schlauch (siehe Materialtabelle), der in den Perikardraum in der Nähe der Verbindung von linkem Vorhof und linkem Ventrikel eingeführt wird.<ol><li>Lassen Sie Kochsalzlösung von der hinteren Seite des Herzens sammeln und sammeln, wobei Sie darauf achten, den Perikard dabei nicht zu durchstechen oder zu zerreißen. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal und geben Sie Lavageflüssigkeit auf Eis, während Sie das Herz bearbeiten.</li>
	</ol></li>
	<li>Schneiden Sie das Herz aus, indem Sie die Hauptgefäße (Aorta, Lungenarterie, Vene und Vena cava) schneiden, die in das Herz ein- und austreten. Entfernen Sie den rechten und linken Vorhof und wiegen Sie das ventrikuläre Herzgewebe.</li>
	<li>Zerkleinern Sie das Gewebe in kleinen 1 mm2 Stücken mit einer Schere und geben Sie 10 ml Verdauungspuffer mit 450 E / ml Kollagenase I, 125 E / ml Kollagenase XI, 60 E / ml DNase I und 60 E / ml Hyaluronidase in PBS für 1 h bei 37 ° C auf einen Orbitalschüttler.</li>
	<li>Herzgewebe homogenisiert durch ein 70 μm großes Zellsieb (siehe Materialtabelle) und schleudert bei 60 x g für 5 min bei 4 °C, um Herzparenchymzellen zu entfernen.</li>
	<li>Der Überstand wird gesammelt, durch ein 40-μm-Zellsieb (siehe Materialtabelle) für eine Einzelzellsuspension geleitet und bei 400 x g für 5 min bei 4 °C nach unten geschleudert, um die Zellen zu pelletieren.</li>
	<li>Fragmentkristallisierbare (Fc) Rezeptorblockierung und Färbung von zellulären Markern auf Perikard- und Herzzellen, wie zuvor beschrieben8.</li>
	<li>Lassen Sie Proben auf einem Durchflusszytometer laufen.</li>
</ol>5. Markierung von Perikardmakrophagen mit der Methode des Interkostalansatzes für den Pleuraraum (ICAPS)9
<ol><li>Sterilisieren Sie chirurgische Instrumente (über einen Perlensterilisator oder Autoklaven) und sprühen Sie 70% Ethanol ein, bevor Sie beginnen.</li>
	<li>Induzieren und halten Sie die Maus unter Vollnarkose mit 1,5-2% Isofluran und 800 ml/min Sauerstoff. Bestätigen Sie die Anästhesieebene, indem Sie die Zehen einklemmen und das Tier auf Mangel an Reflex beobachten.</li>
	<li>Analgetikum subkutan injizieren (Buprenorphin 0,1 mg/kg).</li>
	<li>Legen Sie die Maus während der Operation auf ein beheiztes OP-Pad.</li>
	<li>Rasieren Sie den rechten anterolateralen Brustbereich.</li>
	<li>Reinigen Sie den Operationsbereich mit Ethanol und Betadin.</li>
	<li>Machen Sie einen 3 cm langen Schnitt in die Haut und legen Sie den Brustkorb mit einer Pinzette frei.</li>
	<li>Laden Sie 5 μL fluoreszierende Kügelchen (handelsübliche fluoreszierende Mikrokugeln, 1 μm, siehe Materialtabelle) und 45 μL Kochsalzlösung in einen PE-10-Schlauchspritzenkatheter mit abgeschrägter Spitze.</li>
	<li>Führen Sie den Katheter wie zuvor beschrieben9 in den Interkostalraum, injizieren Sie langsam die Perlenlösung und entfernen Sie den Katheter in einer Bewegung.</li>
	<li>Verschließen Sie die Haut mit Klammern. HINWEIS: Klammern werden anstelle von Nähten verwendet, um ein mögliches Wiederöffnen des Einschnitts zu minimieren.</li>
	<li>Schalten Sie das Isofluran aus, legen Sie die Maus in den Aufwachkäfig und überwachen Sie die ersten 24 Stunden auf Komplikationen.</li>
</ol>

<ol><li>Virani, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+disease+and+stroke+statistics-2020+update%3A+A+report+from+the+American+Heart+Association%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Heart disease and stroke statistics-2020 update: A report from the American Heart Association.</a> Circulation. 141, 139(2020).</li>
<li>Iismaa, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+regenerative+mechanisms+across+different+mammalian+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Comparative regenerative mechanisms across different mammalian tissues.</a> NPJ Regenerative Medicine. 3 (6), eCollection 2018 (2018).</li>
<li>Bayat, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progressive+heart+failure+after+myocardial+infarction+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Research+in+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Progressive heart failure after myocardial infarction in mice.</a> Basic Research in Cardiology. 97 (3), 206-213 (2002).</li>
<li>Virag, J. A., Lust, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronary+artery+ligation+and+intramyocardial+injection+in+a+murine+model+of+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Coronary artery ligation and intramyocardial injection in a murine model of infarction.</a> Journal of Visualized Experiments. 52, 2581(2011).</li>
<li>De Villiers, C., Riley, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+myocardial+infarction%3A+comparing+permanent+ligation+and+ischaemia-reperfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Mouse models of myocardial infarction: comparing permanent ligation and ischaemia-reperfusion.</a> Disease Models & Mechanisms. 13 (11), (2020).</li>
<li>Borlaug, B. A., Reddy, Y. N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+pericardium+in+heart+failure%3A+Implications+for+pathophysiology+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22JACC+Heart+Failure%22%5BJournal%5D)">The role of the pericardium in heart failure: Implications for pathophysiology and treatment.</a> JACC Heart Failure. 7 (7), 574-585 (2019).</li>
<li>Pfaller, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+the+pericardium+for+cardiac+biomechanics%3A+from+physiology+to+computational+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Biomechanics+and+Modeling+in+Mechanobiology%22%5BJournal%5D)">The importance of the pericardium for cardiac biomechanics: from physiology to computational modeling.</a> Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 18 (2), 503-529 (2019).</li>
<li>Deniset, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gata6%28%2B%29+Pericardial+Cavity+Macrophages+Relocate+to+the+Injured+Heart+and+Prevent+Cardiac+Fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Gata6(+) Pericardial Cavity Macrophages Relocate to the Injured Heart and Prevent Cardiac Fibrosis.</a> Immunity. 51 (1), 131-140 (2019).</li>
<li>Weber, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+targeting+of+the+pleural+space+by+intercostal+approach%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Pulmonary+Medicine%22%5BJournal%5D)">Immune targeting of the pleural space by intercostal approach.</a> BMC Pulmonary Medicine. 15, 14(2015).</li>
<li>Nakatani, T., Shinohara, H., Fukuo, Y., Morisawa, S., Matsuda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericardium+of+rodents%3A+pores+connect+the+pericardial+and+pleural+cavities%5BTitle%5D)+AND+%22The+Anatomical+Record%22%5BJournal%5D)">Pericardium of rodents: pores connect the pericardial and pleural cavities.</a> The Anatomical Record. 220, 132-137 (1988).</li>
<li>Tyberg, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relationship+between+pericardial+pressure+and+right+atrial+pressure%3A+an+intraoperative+study%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">The relationship between pericardial pressure and right atrial pressure: an intraoperative study.</a> Circulation. 73, 428-432 (1986).</li>
<li>Hamilton, D. R., Sas, R., Semlacher, R. A., Kieser Prieur, T. M., Tyberg, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relationship+between+left+and+right+pericardial+pressures+in+humans%3A+an+intraoperative+study%5BTitle%5D)+AND+%22The+Canadian+Journal+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">The relationship between left and right pericardial pressures in humans: an intraoperative study.</a> The Canadian Journal of Cardiology. 27, 346-350 (2011).</li>
<li>Park, D. S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pericardial+proteoglycan+4+%28lubricin%29%3A+Implications+for+postcardiotomy+intrathoracic+adhesion+formation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Thoracic+and+Cardiovascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">Human pericardial proteoglycan 4 (lubricin): Implications for postcardiotomy intrathoracic adhesion formation.</a> The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 156 (4), 1598-1608 (2018).</li>
</ol>

Die Autoren haben keine Konflikte offenzulegen.

Die Induktion eines MI in einem geschlossenen Perikard bei Nagetieren ist einzigartig und kann potenziell bedeutende Anwendungen haben. Das Verfahren hängt stark von der Vertrautheit des Chirurgen mit dem Nagetiermodell und der Herzanatomie der Nagetiere ab. Der Erfolg hängt auch von der Pflege ab, die in drei kritischen Schritten angewendet wird: Interkostalmuskelschnitt und Rippenretraktion (Schritte 1.11-1.13), Entstehung des Infarkts (Schritt 1.17) und Genesung des Tieres (Schritte 1.22-1.24).
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Bis heute gelten Herz-Kreislauf-Erkrankungen weltweit als die häufigste Todesursache, was zu einer erheblichen finanziellen Belastung und einer Verringerungder Lebensqualität der Patienten führt1. Die koronare Herzkrankheit (KHK) ist ein Subtyp der Herz-Kreislauf-Erkrankung und spielt eine wesentliche Rolle bei der Entwicklung des Myokardinfarkts (MI), der einen Hauptfaktor für die Mortalität darstellt. Definitionsgemäß resultiert MI aus einer irreversiblen Verletzung des Myokardgewebes aufgrund längerer Ischämie und Hypoxie. Dem Myokardgewebe fehlt die Regenerationsfähigkeit, so dass Verletzungen dauerhaft sind und zum Ersatz des Herzmuskels durch eine fibrotische Narbe führen, die zunächst schützend sein kann, aber letztendlich zu einem ungünstigen Herzumbau und schließlich zu einer Herzinsuffizienz beiträgt2.
Obwohl sich die Behandlung von Patienten mit KHK in den letzten Jahrzehnten dramatisch verbessert hat, sind viele Patienten weltweit von chronischer Herzinsuffizienz (CHF) infolge von Ischämie betroffen. Um dieser Epidemie vorzubeugen und sie zu bewältigen, ist es notwendig, die zugrunde liegenden Mechanismen besser zu verstehen und neue Therapieansätze zu entwickeln. Darüber hinaus zeigen die bisherigen Befunde die Grenzen der systemischen Therapie und die Notwendigkeit, präzise Alternativen zu entwickeln. Angesichts der Tatsache, dass die Untersuchung der molekularen Folgen von MI beim Menschen von der Fähigkeit beeinflusst wird, Zugang zu infarktiertem Gewebe zu erhalten, sind Tiermodelle, die die Eigenschaften und die Entwicklung von humanem MI und CHF im Zusammenhang mit CVD rekapitulieren, unerlässlich.
Da ideale Tiermodelle in Bezug auf strukturelle und funktionelle Merkmale einer menschlichen Störung sehr ähnlich sind, sollte die Ätiologie der Krankheit ihre Konzeption leiten. Bei der KHK handelt es sich um die chronische atherosklerotische Stenose der Koronararterien oder einen akuten thrombotischen Verschluss. Verschiedene Methoden wurden entwickelt und bei verschiedenen Arten von Labortieren angewendet, um eine Verengung oder Okklusion der Koronararterien zu induzieren. Solche Strategien können grob in zwei Gruppen eingeteilt werden: (1) mechanische Manipulation einer Koronararterie, um einen MI zu induzieren, und (2) Beschleunigung der Atherosklerose, um die Koronarverengung zu erleichtern, die zu einem MI führt. Die erste Strategie beinhaltet in der Regel entweder die Ligatur einer Koronararterie oder die Platzierung eines Stents innerhalb der Arterie. Der zweite Ansatz neigt dazu, die Ernährung des Tieres zu ändern, um fettreiche / cholesterinreiche Nahrung aufzunehmen. Zu den Einschränkungen dieses letzteren Ansatzes gehört die mangelnde Kontrolle über den Zeitpunkt und den Ort der Koronarverschlüsse.
Im Gegensatz dazu hat die chirurgische Induktion von MI oder Ischämie in einem Tiermodell mehrere Vorteile, wie z. B. Ort, präzises Timing und Ausmaß des koronaren Ereignisses, was zu reproduzierbaren Ergebnissen führt. Die am weitesten verbreitete Methode ist die chirurgische Ligatur der linken vorderen absteigenden Koronararterie (LAD). Solche Modelle rekapitulieren die menschlichen Reaktionen auf akute ischämische Verletzungen sowie die Progression aufCHF 3. Ursprünglich bei größeren Tieren entwickelt, ist die LAD-Chirurgie an Kleintieren wie Nagetieren mit Fortschritten in der Technologie praktikabler geworden4. Bei der Etablierung solcher Modelle wurden Mäuse aus verschiedenen Gründen bevorzugt, darunter ihre relative Verfügbarkeit, geringe Kosten für die Unterbringung und ihre Fähigkeit zur genetischen Manipulation.
Zeitgenössische chirurgische Modelle der ischämischen Herzkrankheit mit LAD-Verschluss erfordern, dass der Forscher das Perikard öffnet, um die Arterie5 vorübergehend oder dauerhaft zu ligieren. Solche Strategien führen zu einer Störung des Perikardraums, der im Wesentlichen eine mechanische und schmierende Funktion hat, um eine ordnungsgemäße Herzfunktion zu gewährleisten. Ein weiterer Nachteil der Öffnung des Herzbeutels ist der Verlust der nativen Herzbeutelflüssigkeit des Tieres mit seinen verschiedenen Zell- und Proteinbestandteilen 6,7. Als Reaktion darauf wurde von uns eine Methode entwickelt, um MI zu induzieren und gleichzeitig das Perikard intakt zu halten. Neben der Minimierung der Störung dieser homöostatischen Umgebung ermöglicht dieser Ansatz das Markieren und Verfolgen bestimmter Zellen nach dem Verursachen eines MI. Darüber hinaus stellt dieser Ansatz die myokardiale ischämische Schädigung im menschlichen Umfeld besser dar.

<table><tbody><tr><td>Steri-350 Bead Sterilisator</td><td>Inotech</td><td>NC9449759</td><td></td></tr><tr><td>10% Formalin</td><td>Millipore Sigma</td><td>HT501128-4L</td><td></td></tr><tr><td>40 & Mikro; m Zellensieb</td><td>VWR</td><td>CA21008-949</td><td>Falcon, 352340</td></tr><tr><td>70 &micro; m Zellsieb</td><td>VWR</td><td>CA21008-952</td><td>Falcon, 352350</td></tr><tr><td>ACK Lysepuffer</td><td>Thermo Fisher</td><td>A1049201</td><td></td></tr><tr><td>BD Insyte-W Katheternadel 24 g x 3/4"</td> <td>CDMV Inc</td><td>108778</td><td></td></tr><tr><td>Betadin (10% Povidon-Jod topische Lösung)</td><td>CDMV Inc</td><td>104826</td><td></td></tr><tr><td>Blunt Pinzette</td><td>Fine Science Tools</td><td>FST 11000-12</td><td></td></tr><tr><td>BNP Ophthalmic Salbe</td><td>CDMV Inc</td><td>17909</td><td></td></tr><tr><td>Castroviejo Nadeltreiber</td><td>Fine Science Tools</td><td>FST 12061-01</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge 5810R</td><td>Eppendorf</td><td>22625101</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenase I</td><td>Millipore Sigma</td><td>SCR103</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenase XI</td><td>Millipore Sigma</td><td>C7657</td><td></td></tr><tr><td>Covidien 5-0 Polysorb Naht - CV-11 Taper Nadel</td><td>Medtronic Canada</td><td>GL-890</td><td></td></tr><tr><td>Covidien 5-0 Polysorb Nahtmaterial - PC-13 Schneidenadel</td><td>Medtronic Canada</td><td>SL-1659</td><td></td></tr><tr><td>Gebogene stumpfe Pinzette</td><td>Fine Science Tools</td><td>FST 11009-13</td><td></td></tr><tr><td>Dako Eindeckmedium</td><td>Agilen</td><td>CS70330-2</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Millipore Sigma</td><td>11284932001</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol, 100%</td><td>Millipore Sigma</td><td>MFCD00003568</td><td></td></tr><tr><td>Ethicon 8-0 Ethilon Naht - BV-130-4 Kegelnadel</td><td>Johnson & & Johnson Inc.</td><td>2815G</td><td></td></tr><tr><td>Faseroptisches Licht</td><td>Nikon</td><td>2208502</td><td></td></tr><tr><td>Feine Pinzette</td><td>Feine wissenschaftliche Werkzeuge</td><td>FST 11150-10</td><td></td></tr><tr><td>Fluoresbrite&reg; YG Carboxylat-Mikrosphären 1.00 & Mikro; m</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>15702</td><td></td></tr><tr><td>Geiger Thermal Cautery</td><td>Unit World Precision Instruments</td><td>501293</td><td>Modell 150-ST</td></tr><tr><td>Hyaluronidase</td><td>Millipore Sigma</td><td>H4272</td><td></td></tr><tr><td>Isofluoran-Verdampfer</td><td>Harvard Apparatur</td><td>75-0951</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran USP, 250 mL</td><td>CDMV Inc</td><td>108737</td><td></td></tr><tr><td>Magnetfixator Retraction System</td><td>Fine Science Tools</td><td>18200-20</td><td></td></tr><tr><td>MX550D - 40 MHz Sonde</td><td>Fujifilm - Visual Sonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nadeltreiber</td><td>Feinwissenschaftliche Werkzeuge</td><td>FST 12002-12</td><td></td></tr><tr><td>PE-10 Schlauch</td><td>Braintree Scienctific, Inc.</td><td>PE10 50 FT</td><td></td></tr><tr><td>Schere</td><td>Fine Science Tools</td><td>FST 14184-09</td><td></td></tr><tr><td>SMZ-1B Stereomikroskop</td><td>Nikon</td><td>SMZ1-PS</td><td></td></tr><tr><td>VentElite Kleintierbeatmungsgerät</td><td>Harvard Apparatur</td><td>55-7040</td><td></td></tr><tr><td>Vetergesic (10 mL, 0,3 mg/ml Buprenorphin))</td><td>CDMV Inc</td><td>124918</td><td>kontrolliertes Medikament</td></tr><tr><td>Vevo 2100 Software</td><td>Fujifilm-Visual Sonics</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ein intaktes ischämisches nagetiermodell des perikards

An Intact Pericardium Ischemic Rodent Model

Dieses Protokoll hat gezeigt, dass das Perikard und sein Inhalt eine wesentliche antifibrotische Rolle im ischämischen Nagetiermodell spielen (koronare Ligatur zur Induktion von Myokardverletzungen). Die Mehrzahl der präklinischen Myokardinfarktmodelle erfordert die Störung der Perikardintegrität mit Verlust des homöostatischen zellulären Milieus. In jüngster Zeit wurde jedoch von uns eine Methode entwickelt, um einen Myokardinfarkt zu induzieren, der den Perikardschaden minimiert und die im Herzen ansässige Immunzellpopulation erhält. Bei Mäusen mit intaktem Perikardraum nach koronarer Ligatur wurde eine verbesserte kardiale Funktionserholung beobachtet. Diese Methode bietet die Möglichkeit, Entzündungsreaktionen im Perikardraum nach einem Myokardinfarkt zu untersuchen. Die Weiterentwicklung der Markierungstechniken kann mit diesem Modell kombiniert werden, um das Schicksal und die Funktion von perikardialen Immunzellen bei der Regulierung der Entzündungsmechanismen zu verstehen, die den Umbau im Herzen, einschließlich der Fibrose, vorantreiben.

Dieses modifizierte Koronarligaturmodell wurde optimiert, um Reproduzierbarkeit und Überleben der Tiere zu erreichen. Aufgrund der erheblichen Verletzung, die im Herzen induziert wird, sind jedoch einige erwartete intraoperative und postoperative Mortalitäten mit dem Eingriff verbunden. Die Standardsterblichkeit ist typischerweise bei Männern höher (~ 25-35%) als bei Frauen (~ 10-15%).
Die erfolgreiche Induktion eines MI mit der modifizierten koronaren Ligatur sollte durch Veränderungen der fu...

Dieses Protokoll beschreibt die Schritte zur Induktion eines Myokardinfarkts bei Mäusen unter Beibehaltung des Perikards und seines Inhalts.

Ein intaktes ischämisches Nagetiermodell des Perikards

This protocol has shown that the pericardium and its contents play an essential anti-fibrotic role in the ischemic rodent model (coronary ligation to ...

Diese Methode wird es uns ermöglichen, die Rolle der Perikardhöhle, die das Herz und seinen Inhalt umgibt, bei der Herzreparatur nach einem Myokardinfarkt zu bewerten. Im Vergleich zu herkömmlichen Koronarligaturmethoden zur Modellierung von Myokardinfarkt erhält unsere Methode eine intakte Perikardhöhle, die die Bestimmung von Inhaltsstoffen ermöglicht und deren Rolle nach einer ischämischen Herzverletzung verfolgt. Das Verständnis des Beitrags der Perikardhöhle und der Reaktion des Herzens auf Verletzungen wird wichtige Einblicke in therapeutische Strategien liefern, die auf das Perikard abzielen, um die Herzheilung zu verbessern.Um mit der Postanästhesie zu beginnen, halten Sie die Pfoten der Maus zurück und positionieren Sie sie auf dem OP-Tisch. Nachdem Sie die Maus auf die Operation vorbereitet haben, wie im Manuskript beschrieben, belüften Sie die Maus mit 2 % Isofluran und 100 % Sauerstoff als Trägergas mit einem handelsüblichen Beatmungsgerät. Stellen Sie dann eine Rate von 110 Atemzügen pro Minute, ein Tidalvolumen von 250 Mikrolitern und einen positiven exspiratorischen Enddruck von vier Millimetern Quecksilbersäule ein.Rollen Sie die Maus um 30% auf der rechten Seite, um die linke Seite des Brustkorbs für die Operation zu positionieren. Dann machen Sie einen zwei bis drei Zentimeter großen seitlichen Schnitt in die Brusthaut, um die Brustmuskeln auf der linken Seite sichtbar zu machen. Machen Sie einen Schnitt von einem Zentimeter von der Mittellinie nach außen, um den Pectoralis major und minor zu schneiden.Vermeiden Sie übermäßige Blutungen während der Kauterisation blutender Gefäße. Visualisieren Sie die Interkostalmuskulatur zwischen der dritten und vierten Rippe. Machen Sie einen zwei Zentimeter langen Schnitt in den linken Interkostalmuskel, um Luft in die Brusthöhle einzuführen und das Herz und die Lunge von der Inzision abfallen zu lassen.Um die Interkostale ohne Blutung zu schneiden, stoppen Sie vorübergehend das Beatmungsgerät und erweitern Sie die Öffnung mit einem Kauterisationsgerät. Ziehen Sie die Rippen mit Retraktoren zurück, um das Herz freizulegen. Beobachten Sie dann den Perikard und das darunter liegende Herz unter einem Stereomikroskop.Legen Sie die Pinzette vorsichtig auf die Perikardoberfläche, um den Perikard und die darunter liegende Herzbewegung zu reduzieren. Visuelle Markierung der LAD-Koronararterie, indem sie ihre Entstehung unter dem linken Anhängsel verfolgt. Führen Sie mit dem Mikronadeltreiber eine geeignete Naht durch den Perikard unter dem LAD.Beobachten Sie die Naht, die auf der anderen Seite des LAD und des Perikards entsteht. Um das permanente Ligaturmodell darzustellen, binden Sie die Naht, um den Blutfluss durch die Koronararterie einzuschränken und das Blanchieren des vorderen Teils des linken Ventrikels sichtbar zu machen. Schneiden Sie dann die überschüssige Naht mit Hilfe einer Schere ab.Erhaltungsinjektionen von Analgetika subkutan alle 12 Stunden für 72 Stunden nach der Operation. Nachdem Sie das Isofluran auf 1% reduziert haben, schalten Sie das Isofluran aus, während die Belüftung mit Sauerstoff aufrechterhalten wird. Sobald das Tier Anzeichen einer Atmung zeigt, entfernen Sie den 23-Gauge-Trachealschlauch aus dem Maul und legen Sie die Maus in einen Aufwachkäfig, um die Wiederaufnahme der Atmung zu überwachen.Warten Sie, bis sich die Maus im Käfig erholt hat, wobei ein Teil des Käfigs auf ein Wärmekissen gelegt wird, um eine externe Wärmequelle bereitzustellen. Überwachen Sie den Gesundheitszustand der Maus täglich für sieben Tage, indem Sie die Schnitte und das Unbehagen der Tiere auswerten. Falls erforderlich, Verabreichen Sie Antibiotika für eine erfolgreiche Genesung nach der invasiven Operation.Nachdem Sie die Maus unter Vollnarkose mit Sauerstoff gehalten haben, legen Sie die Maus in Rückenlage auf eine beheizte Bühnenplattform und befestigen Sie die Pfoten an den EKG-Elektroden. Dann scheuern Sie die Brust. Erfassen Sie EKG-Bilder mit Schallkopfsonde und Kontaktgel und analysieren Sie sie mit der entsprechenden Software.Schalten Sie nach der nichtinvasiven EKG-Beurteilung das Isofluran aus und bringen Sie die Maus in den Käfig zurück. Fixieren Sie das Herz in 10% Formalin für mindestens 24 Stunden. Schneiden Sie die Probe mit einer geraden Rasierklinge durch den rechten Ventrikel, das interventrikuläre Septum und den linken Ventrikel und stellen Sie sicher, dass der Schnitt durch die Mitte der Infarktzone verläuft.Und dann bettet Paraffin die Gewebeproben ein. Die geschnittenen Abschnitte werden dann in eine Montagekassette gelegt, um sie weiter in Paraffin einzubetten und anschließend in fünf Mikrometer dicke Abschnitte zu zerlegen. Nach dem Platzieren der Gewebeschnitte auf Objektträgern wird mit Toluol entparaffiniert und Alkohol mit entionisiertem Wasser gewaschen.Dann rehydrieren. Als nächstes färben Sie den Abschnitt mit 0,1% Siriusrot in Pikrinsäure für zwei Stunden bei Raumtemperatur. Waschen Sie den Abschnitt drei Minuten lang mit 0,5% Essigsäure, gefolgt von einer Minute lang mit 70% Ethanol.Entwässern Sie den Abschnitt in umgekehrter Reihenfolge der Wäschen mit steigenden und abgestuften Ethanolkonzentrationen vor der Montage für die mikroskopische Auswertung. Die erfolgreiche Myokardinfarktinduktion mit der modifizierten Koronarligatur wurde durch die Untersuchung der funktionellen Parameter und strukturellen Merkmale des Herzens beurteilt. In Bezug auf die Funktion wurde die verminderte Ejektionsfraktion des linken Ventrikels innerhalb von drei bis vier Wochen nach dem Myokardinfarkt durch Echokardiographie beurteilt.Die histologische Färbung zeigte, dass die funktionellen Veränderungen mit einer signifikanten Fibrose der linken Ventrikelwand einhergingen, die durch die Quantifizierung der picrosiriusrot gefärbten Fibrose in den Querschnitten des Herzens vier Wochen nach dem Infarkt mit den gestörten oder intakten perikardialen Koronarligaturmodellen bestätigt wurden. Die Kombination der Fluoreszenzperlenmarkierungsmethode mit der Durchflusszytometrie lieferte einen Ansatz, um die residenten Gata6-positiven Perikardmakrophagen zu verfolgen. Wichtig ist, dass wenig bis gar keine Markierung im Herzen oder Blut nachgewiesen wurde.Nach einem Myokardinfarkt kann die Verlagerung der Zellen durch Durchflusszytometrie und Bildgebung verfolgt werden. Die Quantifizierung der fluoreszierenden perlenmarkierten perikardialen myeloischen Zellen mit oder ohne Myokardinfarkt wird gezeigt. Es ist darauf zu achten, dass das dünne Perikard während des Eingriffs nicht versehentlich gestört oder gerissen wird.Diese Methode kann mit einer Zell- oder Effektorblockade kombiniert werden, die es ermöglicht, den Einfluss der Perikardkomponente auf die Heilungsreaktion im infarktierten Herzen zu verfolgen und zu bestimmen. Wir haben festgestellt, dass die Perikardhöhle das Herz nach einer Verletzung schützt, die teilweise durch residente Perikardmakrophagen vermittelt wird. Dieser Ansatz eröffnet ein neues Forschungsgebiet für Herz-Kreislauf-Erkrankungen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Das Rattenmodell der akuten Myokardinfarkt (AMI) ist nützlich, um die Folge eines MI auf die kardiale pathophysiologischen und physiologischen Funktion zu untersuchen.

Akuter Myokardinfarkt bei Ratten

Chirurgisches Trauma eine entzündliche Reaktion induziert. Zytokine und endogene Liganden bekannt zu modulieren Myokardinfarkt Größe nach Ischämie und Reperfusion. Wir präsentieren eine modifizierte geschlossener Brust Modell der murinen Ischämie und Reperfusion mit hängenden Gewichte zu Auswirkungen der Thorakotomie zu minimieren.

Ein Maus-Closed-Brust-Modell von Myokardischämie und Reperfusion

Das Ziel dieses Protokolls ist die Beurteilung der myokardialen Betäubung nach ischämischem kardioplegischem Stillstand bei Nagetieren.

Murine isolierten Herzmodell Myocardial Stunning Verbunden mit Kardioplegische Arrest

Isolierte Arbeitsherzmodelle können verwendet werden, um die Wirkung von Belastungsbedingungen, Herzfrequenz und Medikamenten auf die myokardiale Leistung und den Sauerstoffverbrauch zu messen. Wir beschreiben Methoden zur Erstellung eines Arbeitsmodells für das linke Herz von Nagetieren, das die Untersuchung der systolischen und diastolischen Leistung und des Sauerstoffverbrauchs unter verschiedenen Bedingungen ermöglicht.

Nagetier Arbeits Herz Modell für die Untersuchung der myokardialen Leistung und Sauerstoffverbrauch

Während der murinen myokardialen Ischämie/Reperfusionsoperation wird die korrekte Platzierung der okkludierenden Ligatur typischerweise durch sichtbare Beobachtung der Myokardblässe bestätigt. Hierin wird ein Verfahren zur elektrokardiographischen Bestätigung von Ischämie und Reperfusion zur Ergänzung der beobachteten Myokardblässe an männlichen C57Bl/6-Mäusen demonstriert.

Die Bestätigung der myokardialen Ischämie und Reperfusion Injury in Mäusen Oberflächen Pad Elektrokardiographie

Hierin beschreiben wir ein chirurgisches Verfahren, das zeigt, wie eine dauerhafte Ligation der links-vorderen absteigenden Herzkranzgefäße bei Mäusen erreicht werden kann. Dieses Modell ist von hoher Relevanz für die Untersuchung der Pathophysiologie des Myokardinfarkts und der damit einhergehenden biologischen Prozesse.

Murine Myokardinfarkt Modell mit permanenten Ligation der linken Anterior absteigende Koronararterie

Dieser Artikel stellt eine effiziente Methode zur Durchführung von Myokard-Ischämie und anschließender chronischer Reperfusion bei Ratten mit einem minimal-invasiven Ansatz dar. Darüber hinaus wird die linksventrikuläre hämodynamische Funktion von Ratten durch Echokardiographie und isolierte Arbeitsherzmethoden beurteilt.

Semi-Minimal Invasive Methode zur Induzieren von Myokardinfarkt bei Ratten und der Beurteilung der Herzfunktion durch ein isoliertes funktionierendes Herzsystem

Das Myokardischämie-Reperfusionsmodell des Rattenherzens wird durch die Verwendung eines selbst hergestellten Retraktors, einer Polyvinylchloridröhre und einer einzigartigen Knotenmethode verbessert. Die Ergebnisse der Elektrokardiogramm-, Triphenyltetrazoliumchlorid- und histologischen Färbung sowie die Ergebnisse der prozentualen Überlebensanalyse zeigten, dass die verbesserte Modellgruppe höhere Erfolgs- und Überlebensraten aufweist als die bereits bestehende Modellgruppe.

Verbessertes Nagetiermodell der Myokardischämie und Reperfusionsverletzung

Die vorliegende Studie zeigt ein hochgradig reproduzierbares Tiermodell der akuten regionalen myokardialen Ischämie und Reperfusionsschädigung bei Kaninchen unter Verwendung einer linken Mini-Thorakotomie für Überlebensfälle oder einer Mittellinien-Sternotomie für Nicht-Überlebensfälle.

Modell der Ischämie und Reperfusionsschädigung bei Kaninchen

Eine Methode des Gentransfers für die Behandlung von ischämischen Herzinsuffizienz wird anhand einer Schweinegrippe-Modell des Myokardinfarkts. Unsere einfache und reproduzierbare Methode ermöglicht es uns, leicht Beurteilung der Wirksamkeit verschiedener Gen-Transfers mit einer sehr einfachen und reproduzierbaren Art und Weise.

Gentransfer bei ischämischen Herzinsuffizienz in einem vorklinischen Modell

Erfahren Sie ein intaktes ischämisches Nagetiermodell des Perikards bei Mäusen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung der Rolle des Perikards bei der Herzreparatur nach Myokardinfarkt.

Ein intaktes ischämisches Nagetiermodell des Perikards

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