Name: Herstellung von Adeno-assoziierten Virusvektoren in Zellstapeln für präklinische Studien in Großtiermodellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 21 s
Description: Erfahren Sie die kosteneffiziente Produktion hochreiner AAV-Virusvektoren mit HEK293-Zellen für präklinische Studien in Großtiermodellen. Diese Methode liefert hohe Titer und unterstützt die Gentherapieforschung.

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Amira D. Rghei, Brenna A. Y. Stevens, Sylvia P. Thomas und Jacob G. E. Yates waren Empfänger von Ontario Veterinary College Student Stipends sowie Ontario Graduate Scholarships. Amira D. Rghei erhielt ein Mitacs Accelerate Studentship. Diese Arbeit wurde durch den Canadian Institutes for Health Research (CIHR) Project Grant (#66009) und einen Collaborative Health Research Projects (NSERC Partnered) Grant (#433339) an SKW finanziert.

<ol><li>Hastie, E., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+at+50%3A+A+golden+anniversary+of+discovery%2C+research%2C+and+gene+therapy+success-a+personal+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus at 50: A golden anniversary of discovery, research, and gene therapy success-a personal perspective.</a> Human Gene Therapy. 26 (5), 257-265 (2015).</li>
<li>Wang, D., Tai, P. W. L., Gao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+vector+as+a+platform+for+gene+therapy+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 18 (5), 358-378 (2019).</li>
<li>Nathwani, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+safety+and+efficacy+of+factor+IX+gene+therapy+in+hemophilia+B%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Long-term safety and efficacy of factor IX gene therapy in hemophilia B.</a> The New England Journal of Medicine. 371 (21), 1994-2004 (2014).</li>
<li>Kuzmin, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+clinical+landscape+for+AAV+gene+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">The clinical landscape for AAV gene therapies.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 20 (3), 173-174 (2021).</li>
<li>Ylä-Herttuala, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endgame%3A+glybera+finally+recommended+for+approval+as+the+first+gene+therapy+drug+in+the+European+union%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%3A+The+Journal+of+the+American+Society+of+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Endgame: glybera finally recommended for approval as the first gene therapy drug in the European union.</a> Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 20 (10), 1831-1832 (2012).</li>
<li>FDA approves novel gene therapy to treat patients with a rare form of inherited vision loss. FDA News Release. FDA. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/fda-approves-novel-gene-therapy-treat-patients-rare-form-inherited-vision-loss">https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/fda-approves-novel-gene-therapy-treat-patients-rare-form-inherited-vision-loss</a> (2020).</li>
<li>FDA approves innovative gene therapy to treat pediatric patients with spinal muscular atrophy, a rare disease and leading genetic cause of infant mortality. FDA News Release. FDA. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/fda-approves-innovative-gene-therapy-treat-pediatric-patients-spinal-muscular-atrophy-rare-disease">https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/fda-approves-innovative-gene-therapy-treat-pediatric-patients-spinal-muscular-atrophy-rare-disease</a> (2020).</li>
<li>Statement from FDA Commissioner Scott Gottlieb, MD and Peter Marks, MD Ph.D., Director of the Center for Biologics Evaluation and Research on new policies to advance development of safe and effective cell and gene therapies. FDA. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/statement-fda-commissioner-scott-gottlieb-md-and-peter-marks-md-phd-director-center-biologics">https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/statement-fda-commissioner-scott-gottlieb-md-and-peter-marks-md-phd-director-center-biologics</a> (2020).</li>
<li>Asokan, A., Schaffer, D. V., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+AAV+vector+toolkit%3A+poised+at+the+clinical+crossroads%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%3A+The+Journal+of+the+American+Society+of+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">The AAV vector toolkit: poised at the clinical crossroads.</a> Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 20 (4), 699-708 (2012).</li>
<li>Rose, J. A., Hoggan, M. D., Shatkin, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleic+acid+from+an+adeno-associated+virus%3A+chemical+and+physical+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Nucleic acid from an adeno-associated virus: chemical and physical studies.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 56 (1), 86-92 (1966).</li>
<li>Lusby, E., Fife, K. H., Berns, K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleotide+sequence+of+the+inverted+terminal+repetition+in+adeno-associated+virus+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Nucleotide sequence of the inverted terminal repetition in adeno-associated virus DNA.</a> Journal of Virology. 34 (2), 402-409 (1980).</li>
<li>Masat, E., Pavani, G., Mingozzi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humoral+immunity+to+AAV+vectors+in+gene+therapy%3A+challenges+and+potential+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Discovery+Medicine%22%5BJournal%5D)">Humoral immunity to AAV vectors in gene therapy: challenges and potential solutions.</a> Discovery Medicine. 15 (85), 379-389 (2013).</li>
<li>Ling, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+Transgene+Expression+from+Recombinant+Single-Stranded+D-Sequence-Substituted+Adeno-Associated+Virus+Vectors+in+Human+Cell+Lines+In+Vitro+and+in+Murine+Hepatocytes+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Enhanced Transgene Expression from Recombinant Single-Stranded D-Sequence-Substituted Adeno-Associated Virus Vectors in Human Cell Lines In Vitro and in Murine Hepatocytes In Vivo.</a> Journal of Virology. 89 (2), 952-961 (2014).</li>
<li>Cathomen, T., Stracker, T. H., Gilbert, L. B., Weitzman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+screen+identifies+a+cellular+regulator+of+adeno-associated+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A genetic screen identifies a cellular regulator of adeno-associated virus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (26), 14991-14996 (2001).</li>
<li>McCarty, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-complementary+AAV+vectors%3B+advances+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Self-complementary AAV vectors; advances and applications.</a> Molecular Therapy. 16 (10), 1648-1656 (2008).</li>
<li>Aschauer, D. F., Kreuz, S., Rumpel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+transduction+efficiency%2C+tropism+and+axonal+transport+of+aav+serotypes+1%2C+2%2C+5%2C+6%2C+8+and+9+in+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+One%22%5BJournal%5D)">Analysis of transduction efficiency, tropism and axonal transport of aav serotypes 1, 2, 5, 6, 8 and 9 in the mouse brain.</a> PLOS One. 8 (9), 76310(2013).</li>
<li>Zincarelli, C., Soltys, S., Rengo, G., Rabinowitz, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+AAV+serotypes+1-9+mediated+gene+expression+and+tropism+in+mice+after+systemic+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Analysis of AAV serotypes 1-9 mediated gene expression and tropism in mice after systemic injection.</a> Molecular Therapy. 16 (6), 1073-1080 (2008).</li>
<li>Pillay, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+%28AAV%29+serotypes+have+distinctive+interactions+with+domains+of+the+cellular+AAV+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus (AAV) serotypes have distinctive interactions with domains of the cellular AAV receptor.</a> Journal of Virology. 91 (18), (2017).</li>
<li>Merkel, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trafficking+of+adeno-associated+virus+vectors+across+a+model+of+the+blood-brain+barrier%3B+a+comparative+study+of+transcytosis+and+transduction+using+primary+human+brain+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Trafficking of adeno-associated virus vectors across a model of the blood-brain barrier; a comparative study of transcytosis and transduction using primary human brain endothelial cells.</a> Journal of Neurochemistry. 140 (2), 216-230 (2017).</li>
<li>van Lieshout, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+triple-mutant+AAV6+capsid+induces+rapid+and+potent+transgene+expression+in+the+muscle+and+respiratory+tract+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy.+Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">A novel triple-mutant AAV6 capsid induces rapid and potent transgene expression in the muscle and respiratory tract of mice.</a> Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 9, 323-329 (2018).</li>
<li>Wu, Z., Asokan, A., Grieger, J. C., Govindasamy, L., Agbandje-McKenna, M., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((single+amino+acid+changes+can+influence+titer%2C+heparin+binding%2C+and+tissue+tropism+in+different+adeno-associated+virus+serotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">single amino acid changes can influence titer, heparin binding, and tissue tropism in different adeno-associated virus serotypes.</a> Journal of Virology. 80 (22), 11393-11397 (2006).</li>
<li>Liu, J., Moon, Y. -A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+purification+of+adeno-associated+virus-DJ+for+liver-specific+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Yonsei+Medical+Journal%22%5BJournal%5D)">Simple purification of adeno-associated virus-DJ for liver-specific gene expression.</a> Yonsei Medical Journal. 57 (3), 790-794 (2016).</li>
<li>Grimm, D., Kern, A., Rittner, K., Kleinschmidt, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+tools+for+production+and+purification+of+recombinant+adeno-associated+virus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Novel tools for production and purification of recombinant adeno-associated virus vectors.</a> Human Gene Therapy. 9 (18), 2745-2760 (1998).</li>
<li>Kimura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+adeno-associated+virus+vectors+for+in+vitro+and+in+vivo+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Production of adeno-associated virus vectors for in vitro and in vivo applications.</a> Scientific Reports. 9 (1), 13601(2019).</li>
<li>Aurnhammer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+real-time+PCR+for+the+detection+and+quantification+of+adeno-associated+virus+serotype+2-derived+inverted+terminal+repeat+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy+Methods%22%5BJournal%5D)">Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences.</a> Human Gene Therapy Methods. 23 (1), 18-28 (2012).</li>
<li>dsDNA copy number calculator. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://cels.uri.edu/gsc/cndna.html">http://cels.uri.edu/gsc/cndna.html</a> (2021).</li>
<li>qPCR Efficiency Calculator - CA. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.thermofisher.com/ca/en/home/brands/thermo-scientific/molecular-biology/molecular-biology-learning-center/molecular-biology-resource-library/thermo-scientific-web-tools/qpcr-efficiency-calculator.html">http://www.thermofisher.com/ca/en/home/brands/thermo-scientific/molecular-biology/molecular-biology-learning-center/molecular-biology-resource-library/thermo-scientific-web-tools/qpcr-efficiency-calculator.html</a> (2021).</li>
<li>Lamb, R. A., Kolakofsky, D. Paramyxoviridae: The viruses and their replication. Fields Virology. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.scholars.northwestern.edu/en/publications/paramyxoviridae-the-viruses-and-their-replication">https://www.scholars.northwestern.edu/en/publications/paramyxoviridae-the-viruses-and-their-replication</a> (1996).</li>
<li>Boussif, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+vector+for+gene+and+oligonucleotide+transfer+into+cells+in+culture+and+in+vivo%3A+polyethylenimine%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (16), 7297-7301 (1995).</li>
<li>Kaludov, N., Brown, K. E., Walters, R. W., Zabner, J., Chiorini, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+serotype+4+%28AAV4%29+and+AAV5+Both+require+sialic+acid+binding+for+hemagglutination+and+efficient+transduction+but+differ+in+sialic+acid+linkage+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus serotype 4 (AAV4) and AAV5 Both require sialic acid binding for hemagglutination and efficient transduction but differ in sialic acid linkage specificity.</a> Journal of Virology. 75 (15), 6884-6893 (2001).</li>
<li>Burnham, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+ultracentrifugation+as+an+approach+to+characterize+recombinant+adeno-associated+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy+Methods%22%5BJournal%5D)">Analytical ultracentrifugation as an approach to characterize recombinant adeno-associated viral vectors.</a> Human Gene Therapy Methods. 26 (6), 228-242 (2015).</li>
<li>Dobnik, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+quantification+and+characterization+of+adeno-associated+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Accurate quantification and characterization of adeno-associated viral vectors.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 1570(2019).</li>
<li>Backovic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capsid+protein+expression+and+adeno-associated+virus+like+particles+assembly+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell+Factories%22%5BJournal%5D)">Capsid protein expression and adeno-associated virus like particles assembly in Saccharomyces cerevisiae.</a> Microbial Cell Factories. 11, 124(2012).</li>
</ol>

Sarah K. Wootton ist Erfinderin eines US-Patents US10806802B2 für das AAV6.2FF-Kapsid.

Die Herstellung von rekombinanten AAV (rAAV) -Vektoren, die in diesem Artikel beschrieben werden, verwendet gängige Materialien, Reagenzien und Geräte, die in den meisten molekularbiologischen Forschungslabors und -einrichtungen zu finden sind. Dieses Papier ermöglicht die Herstellung hochwertiger in vitro und in vivo rAAV durch das Lesegerät. Vor allem dieses Protokoll für die rAAV-Produktion ist im Vergleich zu langwierigeren Protokollen mit Cäsiumchloridreinigung effizient und vermeidet den Einsatz v...

Die Gentherapie unter Verwendung von Adeno-assoziierten Virus (AAV) -Vektoren hat in den letzten drei Jahrzehnten große Fortschritte gemacht1,2. Nachgewiesene Verbesserungen bei einer Vielzahl von genetischen Erkrankungen, einschließlich angeborener Blindheit, Hämophilie und Erkrankungen des Bewegungsapparates und des zentralen Nervensystems, haben die AAV-Gentherapie an die Spitze der klinischen Forschung gebracht3,4. Im Jahr 2012 genehmigte die Europäische Arzneimittel-Agentur (EMA) Glybera, einen AAV1-Vektor, der Lipoproteinlipase (LPL) zur Behandlung von LPL-Mangel exprimiert, und ist damit die erste Marktzulassung für eine Gentherapie in Europa oder den Vereinigten Staaten5. Seitdem haben zwei weitere AAV-Gentherapien, Luxturna6 und Zolgensma7,die FDA-Zulassung erhalten, und es wird erwartet, dass der Markt in den nächsten 5 Jahren mit bis zu 10-20 Gentherapien, die bis 2025 erwartet werden, schnell expandierenwird 8. Verfügbare klinische Daten deuten darauf hin, dass die AAV-Gentherapie eine sichere, gut verträgliche und wirksame Modalität ist, die sie zu einem der vielversprechendsten viralen Vektoren macht, mit über 244 klinischen Studien mit AAV, die bei ClinicalTrials.gov registriert wurden. Das zunehmende Interesse an klinischen Anwendungen mit AAV-Vektoren erfordert robuste und skalierbare Produktionsmethoden, um die Bewertung von AAV-Therapien in Großtiermodellen zu erleichtern, da dies ein kritischer Schritt in der translationalen Pipelineist 9.
Für die AAV-Vektorproduktion sind die beiden Hauptanforderungen das AAV-Genom und das Kapsid. Das Genom des Wildtyps (wt)-AAV ist eine einzelsträngige DNA mit einer Länge von etwa 4,7 kb10. Das wt-AAV-Genom umfasst invertierte terminale Wiederholungen (ITRs) an beiden Enden des Genoms, die für die Verpackung wichtig sind, sowie die Rep- und Cap-Gene 11. Die Rep- und Cap-Gene, die für die Genomreplikation, die Assemblierung des viralen Kapsids und die Verkapselung des Genoms in das virale Kapsid notwendig sind, werden aus dem viralen Genom entfernt und in trans für die AAV-Vektorproduktionbereitgestellt 12. Die Entfernung dieser Gene aus dem viralen Genom bietet Raum für therapeutische Transgene und alle notwendigen regulatorischen Elemente, einschließlich des Promotors und des PolyA-Signals. Die ITRs verbleiben im Vektorgenom, um eine ordnungsgemäße Genomreplikation und Virusverkapselung zu gewährleisten13,14. Um die Kinetik der Transgenexpression zu verbessern, können AAV-Vektorgenome so konstruiert werden, dass sie selbstkomplementär sind, was die Notwendigkeit einer Umwandlung von einzelsträngiger zu doppelsträngiger DNA-Umwandlung während der AAV-Genomreplikation verringert, aber die Kodierungskapazität auf ~ 2,4 kb15reduziert.
Über das AAV-Genomdesign hinaus bestimmt die Auswahl des Kapsidserotyps den Gewebe- und Zelltropismus des AAV-Vektors in vivo2. Zusätzlich zum Gewebetropismus wurde gezeigt, dass verschiedene AAV-Serotypen unterschiedliche Genexpressionskinetik aufweisen16. Zum Beispiel klassifizierten Zincarelli et al.17 verschiedene AAV-Serotypen in Serotypen mit niedriger Expression (AAV2, 3, 4, 5), Serotypen mit moderater Expression (AAV1, 6, 8) und Serotypen mit hoher Expression (AAV7 und 9). Sie kategorisierten auch AAV-Serotypen in langsam einsetzende Expression (AAV2, 3, 4, 5) oder schnell einsetzende Expression (AAV1, 6, 7, 8 und 9). Diese divergierenden Tropismen und Genexpressionskinetik sind auf Aminosäurevariationen in den Kapsidproteinen, Kapsidproteinbildungen und Wechselwirkungen mit Wirtszellrezeptoren / Co-Rezeptoren zurückzuführen18. Einige AAV-Kapside haben zusätzliche vorteilhafte Eigenschaften wie die Fähigkeit, die Blut-Hirn-Schranke nach intravaskulärer Verabreichung (AAV9) zu überwinden oder sich in langlebigen Muskelzellen für eine dauerhafte Transgenexpression zu befinden (AAV6, 6.2FF, 8 und 9)19,20.
Dieser Artikel zielt darauf ab, eine kostengünstige Methode zur Herstellung von hochreinen, hochtiterhaltigen AAV-Vektoren in Forschungsqualität für den Einsatz in präklinischen Großtiermodellen zu beschreiben. Die Produktion von AAV unter Verwendung dieses Protokolls wird durch Dual-Plasmid-Transfektion in adhärente menschliche embryonale Nieren (HEK) 293 Zellen erreicht, die in Zellstapeln gezüchtet werden. Darüber hinaus beschreibt die Studie ein Protokoll zur Aufreinigung der Heparinsulfataffinitätschromatographie, das für AAV-Serotypen verwendet werden kann, die Heparin-bindende Domänen enthalten, einschließlich AAV2, 3, 6, 6.2FF, 13 und DJ21,22.
Für die Herstellung von AAV-Vektoren stehen eine Reihe von Verpackungssystemen zur Verfügung. Unter diesen hat die Verwendung eines Zwei-Plasmid-Co-Transfektionssystems, bei dem die Rep- und Cap-Gene sowie die Ad-Helfergene (E1A, E1B55K, E2A, E4orf6 und VA-RNA) in einem Plasmid (pHelper) enthalten sind, einige praktische Vorteile gegenüber der üblichen Drei-Plasmid-(Dreifach-) Transfektionsmethode, einschließlich reduzierter Kosten für die Plasmidproduktion23,24 . Das AAV-Genomplasmid, das die Transgenexpressionskassette (pTransgene) enthält, muss von ITRs flankiert werden und darf eine Länge von ~4,7 kb nicht überschreiten. Vektortiter und Reinheit können durch das Transgen aufgrund möglicher zytotoxischer Wirkungen während der Transfektion beeinflusst werden. Die Beurteilung der Vektorreinheit wird hierin beschrieben. Mit dieser Methode hergestellte Vektoren, die jeweils 1 x10 13 vg/ml ergeben, wurden in Mäusen, Hamstern und Schafmodellen bewertet.
Tabelle 1: Zusammensetzung der erforderlichen Lösungen. Notwendige Informationen, einschließlich Prozentsätze und Volumen, von Komponenten, die für verschiedene Lösungen im gesamten Protokoll benötigt werden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62727/Table%201-%2062727_R2.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.</a>

<table><tbody><tr><td>0,22 μm m Filter</td><td>Millipore</td><td>Sigma S2GPU05RE</td><td></td></tr><tr><td>0,25% Trypsin</td><td>Fisher Scientific</td><td>SM2001C</td><td></td></tr><tr><td>1-Butanol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A399-4</td><td>VORSICHT. Verwendung unter einer Laminar-Flow-Haube. Tragen Sie Handschuhe</td></tr><tr><td>10-Kammer-Cellstack</td><td>Corning</td><td>3271</td><td></td></tr><tr><td>1L PETG-Flasche</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2019-1000</td><td></td></tr><tr><td>30% Acrylamid/Bis-Lösung</td><td>Bio-Rad</td><td>1610158</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Platte mit Rand</td><td>FroggaBio</td><td>FS-96</td><td></td></tr><tr><td>Klebeplattendichtungen</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>08-408-240</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumpersulfat (APS)</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0700</td><td>VORSICHT. Verwendung unter einer Laminar-Flow-Haube. Tragen Sie Handschuhe</td></tr><tr><td>Blut- und Gewebereinigungsset</td><td>Qiagen</td><td>69506</td><td>Zur DNA-Reinigung in Abschnitt 4.6 des Protokolls</td></tr><tr><td>verwenden Bromophenolblau</td><td>Fisher Scientific</td><td>B392-5</td><td>VORSICHT. Verwendung unter einer Laminar-Flow-Haube. Tragen Sie Handschuhe</td></tr><tr><td>Zellkulturschalen</td><td>Greiner bio-one</td><td>7000232</td><td>15 cm Platten</td></tr><tr><td>Kulturröhrchen</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>339650</td><td>15 mL konisches Röhrchen</td></tr><tr><td>Kulturröhrchen Konisches Röhrchen</td><td>Fisher Scientific</td><td>14955240</td><td>50 mL konisches Röhrchen</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) mit 1000 mg/L D-Glucose, L-Glutamin</td><td>Cytiva Life Sciences</td><td>SH30022.01</td><td></td></tr><tr><td>ECL Western Blotting Substrat</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>32209</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Greenfield</td><td>P016EA95</td><td>Verdünnen Sie Ethylalkohol (95 % vol) auf 20 % für Abschnitt 3.7.4 und 70 % für Abschnitt 6.1.1.1</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SH30396.03</td><td></td></tr><tr><td>Eisessig</td><td>Fisher Scientific</td><td>A38-500</td><td>VORSICHT. Verwendung unter einer Laminar-Flow-Haube. Tragen Sie Handschuhe</td></tr>: <tr><td>Glycerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP229-1</td><td></td></tr>, <tr><td>Glycine</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP381-500</td><td></td></tr><tr><td>HBSS mit Mg2+, und Ca2+</td><td>Thermo Fisher</td><td>Scientific SH302268.02</td><td></td></tr><tr><td>HBSS ohne Mg2+ und Ca2+</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SH30588.02</td><td></td></tr><tr><td>HEK293-Zellen</td><td>American Tissue Culture Collection</td><td>CRL-1573</td><td>Nach Erhalt die Zellen und die Kultur wie in der Herstellerbeschreibung beschrieben auftauen. s-Protokoll. Sobald die Zellen minimal durchgegangen sind und gut wachsen, frieren Sie eine Unterfraktion für die Zukunft in Aliquoten ein und lagern Sie sie in flüssigem Stickstoff. Verwenden Sie immer Zellen unterhalb der Passage Nummer 30. Sobald die kultivierten Zellen mehr als 30 Mal durchlaufen wurden, wird empfohlen, eine Kultur aus den gelagerten Aliquoten neu zu starten.</td></tr><tr><td>HEK293 Wirtszellprotein-ELISA-Kit</td><td>Cygnus Technologies</td><td>F650S</td><td> Anleitung</td></tr><tr><td>Heparinsulfat-Säule</td><td>Cytiva Life Sciences</td><td>17040703</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>KC34120</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; L-Glutamin (200 mM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SH30034.02</td><td></td></tr><tr><td>Großvolumige Zentrifugenröhrchen Stützkissen</td><td>Corning</td><td>CLS431124</td><td>Stützkissen müssen mit großvolumigen Zentrifugenröhrchen verwendet werden, es sei denn, der Zentrifugenrotor hat die entsprechenden V-Boden-Kissen Großvolumige</td></tr><tr><td>Zentrifugenröhrchen</td><td>Corning</td><td>CLS431123-6EA</td><td>500 mL Zentrifugenröhrchen</td></tr><tr><td>MgCl2&nbsp; </td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>7791-18-6</td><td></td></tr><tr><td>Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td>1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen, vor Gebrauch sterilisieren</td></tr><tr><td>Wasser in molekularer Qualität</td><td>Cytiva Life Sciences</td><td>SH30538.03</td><td></td></tr><tr><td>N-Lauroylsarcosin Natriumsalz</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L5125</td><td>VORSICHT. Tragen Sie Handschuhe</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP35810</td><td></td></tr><tr><td>Optimem, reduziertes Serummedium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>Pasteurpipetten</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20D</td><td>Vor Gebrauch sterilisieren</td></tr><tr><td>PBS (10x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>70011044</td><td>Zur Anwendung auf Zellen auf 1x verdünnen</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin-Lösung</td><td>Cytiva Life Sciences</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>pHelper Plasmid</td><td>De novo Design oder gewonnen aus Plasmid-Repository</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Pipettenbecken</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-681-502</td><td>Kaufen Sie sterile Pipettenbecken</td></tr><tr><td>Polyethylenglykol tert-octylphenylether (Triton X-100)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>9002-93-1</td><td>VORSICHT. Tragen Sie Handschuhe</td></tr><tr><td>Polyethylenimin (PEI)</td><td>Polyscience</td><td>24765-1</td><td>Hersteller folgen" s Anleitung zur Herstellung einer 1L-Lösung. 0,22 μm m filtrieren und bei 4° lagern; C</td></tr><tr><td>PCR-Platte aus Polypropylen mit halbem Rand</td><td>FroggaBio</td><td>WS-96</td><td></td></tr><tr><td>Polysorbat 20 (Tween 20)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP337-100</td><td>VORSICHT. Tragen Sie Handschuhe</td></tr>, <tr><td>Polyvinylidendifluorid (PVDF)-Membran</td><td>Cytiva Life Sciences</td><td>10600023</td><td>Verwenden Sie zum Manipulieren eine Pinzette. Tragen Sie Handschuhe.</td></tr><tr><td>Primärer Antikörper</td><td>Progen</td><td>65158</td><td></td></tr><tr><td>Protein Ladder</td><td>FroggaBio</td><td>PM008-0500</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM2546</td><td></td></tr><tr><td>pTragene Plasmid</td><td>De-novo-Design oder aus dem Plasmid-Repository</td><td>NA</td> gewonnen <td>Muss SV40 polyA im Genom enthalten, um mit der AAV-Titration in Abschnitt 5.0 kompatibel</td></tr><tr><td>zu sein Pumpenschlauch</td><td>Cole-Parmer</td><td>RK-96440-14</td><td>Optimierung der Schlauchlänge und Eindämmung des Virus in Fraktionen E1-E5</td></tr><tr><td>RQ1 Dnase 10 Reaktionspuffer</td><td>Promega</td><td>M6101</td><td>Verwendung bei 10-facher Konzentration im Protokoll aus Abschnitt 4.0</td></tr><tr><td>RQ1 Rnasefreies Dnase</td><td></td><td>Promega M6101</td><td></td></tr><tr><td>Probenverdünnungsmittel</td><td>Cygnus Technologies</td><td>I700</td><td>Muss für die Verwendung mit dem HEK293 Wirtszellprotein-ELISA-Kit</td></tr> <tr><td>separat erworben werdenSekundärer Antikörper, HRP</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>G-21040</td><td></td></tr><tr><td>Magermilchpulver</td><td>Oxoid</td><td>LP0033B</td><td></td></tr><tr><td>Natriumdodecylsulfat (SDS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>28312</td><td>VORSICHT. Verwendung unter einer Laminar-Flow-Haube. Tragen Sie Handschuhe</td></tr><tr><td>Natriumhydroxid (NaOH)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SS266-4</td><td></td></tr><tr><td>SV40 polyA Primersonde</td><td>IDT</td><td></td><td>Verwenden Sie die Sequenz in Tabelle X für das Zitat von IDT für die</td></tr><tr><td>Synthese Tetramethylethylendiamin (TEMED)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15524010</td><td>VORSICHT. Verwendung unter einer Laminar-Flow-Haube. Tragen Sie Handschuhe</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-5</td><td></td></tr><tr><td>Trypanblau</td><td>Bio-Rad</td><td>1450021</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-Filter</td><td>Millipore Sigma</td><td>UFC810024</td><td>Ultra-4 Centrifugal 10K Gerät muss verwendet werden, da es einen Molekulargewichts-Cutoff von 10000 hat</td></tr><tr><td>Universelle Nuklease für die Zelllyse</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88702</td><td></td></tr><tr><td>Universeller qPCR-Mastermix</td><td>NEB</td><td>M3003L</td><td></td></tr><tr><td>Whatman Paper</td><td>Millipore Sigma</td><td>WHA1001325</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Mercaptoethanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>21985023</td><td>VORSICHT. Verwendung unter einer Laminar-Flow-Haube. Tragen Sie Handschuhe</td></tr><tr><td>VORSICHT:&nbsp; In der Materialtabelle finden Sie Richtlinien zur Verwendung gefährlicher Chemikalien.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

herstellung von adeno-assoziierten virusvektoren in zellstapeln für präklinische studien in großtiermodellen

Production of Adeno-Associated Virus Vectors in Cell Stacks for Preclinical Studies in Large Animal Models

Adeno-assoziierte Virus (AAV) -Vektoren gehören zu den klinisch fortschrittlichsten Gentherapievektoren, wobei drei AAV-Gentherapien für den Menschen zugelassen sind. Die klinische Weiterentwicklung neuartiger Anwendungen für AAV beinhaltet den Übergang von Kleintiermodellen wie Mäusen zu größeren Tiermodellen, einschließlich Hunden, Schafen und nichtmenschlichen Primaten. Eine der Einschränkungen bei der Verabreichung von AAV an größere Tiere ist der Bedarf an großen Mengen an Hochtiterviren. Während die Suspensionszellkultur eine skalierbare Methode für die AAV-Vektorproduktion ist, verfügen nur wenige Forschungslabore über die Ausrüstung (z. B. Bioreaktoren) oder wissen, wie man AAV auf diese Weise herstellt. Darüber hinaus sind AAV-Titer oft signifikant niedriger, wenn sie in HEK 293-Suspensionszellen im Vergleich zu adhärenten HEK293-Zellen hergestellt werden. Hier beschrieben ist ein Verfahren zur Herstellung großer Mengen von High-Titer-AAV unter Verwendung von Zellstapeln. Ein detailliertes Protokoll zur Titerierung von AAV sowie Methoden zur Validierung der Vektorreinheit werden ebenfalls beschrieben. Abschließend werden repräsentative Ergebnisse der AAV-vermittelten Transgenexpression in einem Schafmodell vorgestellt. Dieses optimierte Protokoll für die Großproduktion von AAV-Vektoren in adhärenten Zellen wird es molekularbiologischen Labors ermöglichen, die Erprobung ihrer neuartigen AAV-Therapien in größeren Tiermodellen voranzutreiben.

Die Translation von kleinen Nagetiermodellen in größere Tiermodelle und die letztendliche klinische Anwendung stellt aufgrund der großen Menge an AAV, die erforderlich ist, um größere Tiere zu transduzieren und therapeutische Effekte zu erzielen, eine erhebliche Herausforderung dar. Um die Transduktionseffizienz des rational entwickelten AAV6.2FF-Kapsids zu vergleichen, das zuvor eine 101-fache Steigerung der Transduktionseffizienz in murinen Muskelzellen im Vergleich zu AAV63zeigte, wurde Mäusen,...

Hier bieten wir ein detailliertes Verfahren für die großtechnische Produktion von AAV-Vektoren in Forschungsqualität unter Verwendung von adhärenten HEK 293-Zellen, die in Zellstapeln gezüchtet wurden, und affinitätschromatographischer Aufreinigung. Dieses Protokoll liefert konsistent >1 x 1013 Vektorgenomen/ml und liefert Vektormengen, die für Großtierstudien geeignet sind.

Herstellung von Adeno-assoziierten Virusvektoren in Zellstapeln für präklinische Studien in Großtiermodellen

Adeno-associated virus (AAV) vectors are among the most clinically advanced gene therapy vectors, with three AAV gene therapies approved for humans. ...

Dieses Protokoll zur Herstellung von AAV-Virusvektoren ist kostengünstig und liefert ein AAV mit hoher Reinheit und hohem Titer in Forschungsqualität für den Einsatz in präklinischen, großen Tiermodellen. Diese Technik verwendet adhärente HEK293-Zellen in Zellkulturkammern, was zeiteffizient und weniger praktisch ist, was weniger Störungen der Zellen ermöglicht. Dieses Protokoll kann bei der viralen Vektorproduktion für den Bereich der Gentherapie sehr hilfreich sein und kann auch für die Produktion anderer AAV-Serotypen verwendet werden, die ebenfalls Heparansulfat binden.Um zu beginnen, sammeln Sie HEK293-Zellen aus der Kultur, wenn sie 80% Konfluenz erreicht. Saugen Sie das Medium ab, bevor Sie die Zellkulturplatte vorsichtig mit drei Millilitern PBS waschen. Dann aspirieren Sie PBS und fügen Sie drei Milliliter Trypsin hinzu.Die Platten zwei Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren. Nach der Inkubation neutralisieren Sie Trypsin, indem Sie sieben Milliliter vollständiges DMEM auf die Platte geben und den Überstand in konischen 50-Milliliter-Röhrchen sammeln. Drehen Sie die Röhren vorsichtig um, um sicherzustellen, dass die Zellen homogen sind.Um die Zelldichte zu bestimmen, mischen Sie 10 Mikroliter der Zellproben mit 10 Mikrolitern Trypanblau. Und fügen Sie die Mischung zu einem Zellzählobjektträger hinzu, um sie im Zellzähler zu analysieren. Mischen Sie die Zellsuspension mit einem Liter vorgewärmtem vollständigem DMEM, um die Kulturkammer zu sehen.Drehen Sie die Kammer vorsichtig, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen. Inkubieren Sie die Kammer bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid. Neben der Zellkulturkammer werden Zellen mit 10 bis vier Zellen pro Quadratzentimeter in einer 15 Zentimeter großen Platte als Referenz für die Konfluenz kultiviert.Nach 65 Stunden Inkubation, wenn die Zellen zu 80 bis 90% konfluent sind, fügen Sie langsam die Polyethylenimin-DNA- und DMEM-Mischung in den Zellkulturkammerport hinzu. Verteilen Sie die Flüssigkeit gleichmäßig auf alle Reihen, bevor Sie bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für 72 Stunden inkubieren. Schütteln Sie nach der Inkubation die Zellkulturkammer kräftig, um die Zellen zu entfernen, bis das Medium trüb erscheint, und gießen Sie es in vier oder 500 Milliliter Zentrifugenröhrchen.Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 18.000 mal G für 30 Minuten bei vier Grad Celsius. Gießen Sie den geklärten Überstand in eine Ein-Liter-PETG-Flasche und resuspenieren Sie die Zellpellets in 50 Milliliter lizenziertem Puffer in 500 Milliliter Zentrifugenröhrchen. Die Röhrchen 60 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren.Nach der Inkubation die Röhrchen 30 Minuten lang bei 18.000 mal G zentrifugieren und den Überstand in dieselbe Ein-Liter-PETG-Flasche geben. Bei minus 80 Grad Celsius lagern. Tauen Sie das Rohlysat über Nacht bei vier Grad Celsius auf.Nach dem Auftauen filtern Sie es mit einem 0,22-Mikron-Filter. Unmittelbar vor den Reinigungsschritten passivieren Sie den Zentrifugalkonzentrator durch Zugabe von vier Millilitern Filtervorbehandlungspuffer für jede verwendete Heparin-Sepharose-Säule. Legen Sie den Schlauch in eine Peristaltikpumpe.Führen Sie die Lösungen und Medien nacheinander aus. Bereiten Sie sich auf die Chromatographie vor, indem Sie eine Fünf-Milliliter-Heparin-Sepharose-Säule an den Schlauch anbringen und 25 Milliliter Bazell DMEM durch die Säule laufen lassen. Dann laden Sie 0,2 Mikromol des gefilterten Rohlysats mit einer Durchflussrate von ein bis zwei Tropfen pro Sekunde auf die Säule.Waschen Sie die Säule nacheinander, um fünf Milliliter fünfmal mit 300 Millimol Natriumchlorid HBSS, mit Magnesium und Kalzium zu eluieren und die fünf Elutionen als E1 bis E5 zu kennzeichnen. Wenn Sie fertig sind, drehen Sie den Zentrifugalkonzentrator, der den Vorbehandlungspuffer enthält, zwei Minuten lang bei 900 mal G. Verwerfen Sie den Durchfluss. Waschen Sie den Zentrifugalkonzentratorfilter mit vier Millilitern HBSS mit Magnesium und Kalzium, indem Sie sich zwei Minuten lang bei 1000 mal G drehen.Dann die Elution E2 zum Zentrifugalkonzentrator geben und fünf Minuten lang mit 1000 mal G drehen. Verwerfen Sie den Durchfluss. In ähnlicher Weise wird die Elution E3 in den Zentrifugalkonzentrator gedreht, bis das konzentrierte Virus etwa einen Milliliter beträgt.Entfernen Sie das konzentrierte Virus mit einer gefilterten P200-Spitze aus dem Zentrifugenkonzentrator und sammeln Sie es in einem sterilen 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Nach der Entnahme des Virus spülen Sie den Zentrifugalkonzentrator mit 200 Mikrolitern HBSS mit Magnesium und Kalzium aus. 30 Sekunden lang kräftig auf und ab pipettieren, um alle an der Membran haftenden Viren zu entfernen, und das konzentrierte Virus im selben 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen sammeln.Mischen Sie die Tube gut. Waschen Sie die Säule und sättigen Sie sie mit 20% Ethanol, bevor Sie sie bei vier Grad Celsius lagern. Lagern Sie den Pumpenschlauch in einem molaren Natriumhydroxid.Die Transduktionseffizienz des AAV6.2FF-Kapsids wurde bei Mäusen, Hamstern und Lämmern für 28 Tage bei intramuskulärer Verabreichung verglichen. Mäuse verabreichten fünfmal 10 an das 12. Vektorgenom pro Kilogramm AAV6.2FF humanes IgG, exprimiert zwischen 171 und 237 Mikrogramm pro Milliliter humanem IgG im Serum. Hamster wird zweimal 10 bis zum 13. Vektorgenom pro Kilogramm AAV6.2FF menschlichem IgG verabreicht, ausgedrückt viel höhere Konzentrationen von menschlichem IgG als die Mäuse.Während das Großtiermodell in der Lage war, durchschnittlich 35 Mikrogramm pro Milliliter an menschlichen IgG-Spiegeln im Plasma zu exprimieren. Große Tiermodelle können die Expression des AAV-Transgens in vivo bestimmen und bestimmen, ob die Transgene eine therapeutische Wirkung gegen die Störung oder Krankheit von Interesse haben. Die Studie hat die große Transduktionsfähigkeit von AAV6.2FF, einem neuartigen AAV 6-Serotyp-Vektor in der Skelettmuskulatur, sowie die geringe Immunogenität von AAV-Virusvektoren in vivo gezeigt.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Rekombinante Adeno-assoziierte Virus (rAAVs) Vektoren sind immer wertvoll...

Produktion und Titrierung von rekombinanten Adeno-assoziierte virale Vektoren

Wir zeigen die grundlegende Technik zur molekularen konstruieren und zu entwickeln synthetischen Adeno-assoziierte virale (AAV) Vektoren für die Gentherapie durch DNA-Shuffling Familie. Darüber hinaus bieten wir allgemeine Richtlinien und repräsentative Beispiele für die Auswahl und Analyse der einzelnen chimären Kapside mit verbesserten Eigenschaften auf Ziel-Zellen in Kultur oder in der Maus.

Engineering and Evolution of Synthetic Adeno-assoziierte Virus (AAV) Vektoren für die Gentherapie über DNA-Familie Shuffling

Source: Ehrke-Schulz, E., et al. Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the large-scale amplification of high-capacity adenoviral vectors in suspension-adapted human embryonic kidney cells expressing Cre recombinase for use in gene delivery applications requiring high-titer, helper-free vector preparations.

Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors 

Hier beschreiben wir eine effiziente und reproduzierbare Strategie zu produzieren, Titer und Qualitätskontrolle Chargen von Adeno-assoziierten Virus-Vektoren. Es ermöglicht dem Benutzer, eine Vektor-Vorbereitung mit hoher Titer zu erhalten (≥1 x 1013 Vektor Genome/mL) und eine hohe Reinheit, in Vitro oder in Vivo einsatzbereit.

Produktion, Reinigung und Qualitätskontrolle für Adeno-assoziierten Virus-basierte Vektoren

In diesem Protokoll wird der AAV2-Vektor durch Co-Kultivierung von Spodoptera frugiperda (Sf9) Insektenzellen mit Baculovirus (BV)-AAV2-grün fluoreszierendem Protein (GFP) oder therapeutischem Gen und BV-AAV2-rep-cap infizierten Sf9-Zellen in Suspensionskultur hergestellt. AAV-Partikel werden mittels Reinigungsmittel aus den Zellen freigesetzt, geklärt, durch Affinitätssäulenchromatographie gereinigt und durch tangentiale Strömungsfiltration konzentriert.

Prozessentwicklung zur Herstellung und Reinigung von Adeno-assoziiertem Virus (AAV)2 Vektor mit Baculovirus-Insekten-Zellkultursystem

In diesem Manuskript wird die subkonjunktivale Injektion als gültige Vektorabgabemethode für Augengewebe bei Mäusen unter Verwendung eines Injektionssystems demonstriert, das aus einer Infusions-/Entnahmespritzenpumpe und einer gasdichten herausnehmbaren Spritze in Verbindung mit Mikroinjektionsnadeln besteht. Dieses Injektionssystem ist auch für andere intraokulare Verabreichungswege anpassbar.

Subkonjunktivale Verabreichung von Adeno-assoziierten Virusvektoren in Kleintiermodellen

Hier wird ein zellbasiertes AAV-Produktionsprotokoll für HEK293-Suspensionen vorgestellt, das zu einem reduzierten Zeit- und Arbeitsaufwand für die Vektorproduktion mit Komponenten führt, die für Forschungszwecke von kommerziellen Anbietern erhältlich sind.

Herstellung von Adeno-assoziierten Vektorchargen mit hoher Ausbeute unter Verwendung von HEK293-Suspensionszellen

Da sich das Gebiet der Gentherapie ständig weiterentwickelt, besteht ein wachsender Bedarf an innovativen Methoden, die diese Herausforderungen bewältigen können. Hier wird eine einzigartige Methode vorgestellt, die den Prozess der Generierung von hochreinen und hochreinen AAV-Vektoren unter Verwendung einer Zellfabrikplattform rationalisiert und die Qualitätsstandards für In-vivo-Studien erfüllt.

Ein optimiertes und standardisiertes Verfahren zur Generierung von hochtiternden, qualitativ hochwertigen Adeno-assoziierten Virusvektoren unter Verwendung einer Zellfabrikplattform

Die Fluktuationsrate von Viren in Meer-und Süßwasser-Systeme können durch eine Reduktion und Wiederholung Technik geschätzt werden. Die Daten können die Forscher Raten von Virus-vermittelte mikrobielle Sterblichkeit in aquatischen Systemen zu schließen.

Die Schätzung Virus Produktionsraten in aquatischen Systemen

Dieser Artikel beschreibt verschiedene Verfahren für das Screening von Ratten und Mäusen zu Endo-oder ectoparasitism erkennen. Mehrere diagnostische Assays gezeigt werden, sowohl die für den Einsatz von lebenden Tieren und denen, die nach Euthanasie der Tiere verwendet. Fotos zur Identitätsfeststellung von Ratte und Maus Parasiten Hilfe einbezogen werden.

Diagnose von Ekto-und Endoparasiten in Laborratten und Labormäusen

Erfahren Sie die kosteneffiziente Produktion hochreiner AAV-Virusvektoren mit HEK293-Zellen für präklinische Studien in Großtiermodellen. Diese Methode liefert hohe Titer und unterstützt die Gentherapieforschung.

Herstellung von Adeno-assoziierten Virusvektoren in Zellstapeln für präklinische Studien in Großtiermodellen

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