Schnelle, enzymatische Methoden zur Amplifikation minimaler, linearer Templates für das Protein-Prototyping mit zellfreien Systemen
14. Juni 2021
Die Studie beschreibt ein Protokoll zur Erzeugung großer (μg-mg) Mengen an DNA für Protein-Screening-Kampagnen aus synthetischen Genfragmenten ohne Klonen oder Verwendung lebender Zellen. Die minimale Schablone wird enzymatisch verdaut und zirkuliert und dann mit isothermer Rollkreisamplifikation amplifiziert. Zellfreie Expressionsreaktionen könnten mit dem ungemeinigten Produkt durchgeführt werden.
Dieses Protokoll ist von Bedeutung, da es detailliert beschreibt, wie aus einem kleinen Genfragment, das von einer Syntheseanlage erhalten wird, schnell große Mengen an DNA-Vorlagen für die Verwendung in zellfreien Reaktionen erzeugt werden können. Die Rolling Circle Amplification kann große Mengen an DNA schneller erzeugen als herkömmliches Klonen. So unterstützt es höhere Durchsatz-Design-Build-Test-Lernzyklen aus Bibliotheken synthetischer DNA.
Diese Techniken können für neue Benutzer aufgrund der vielen Erforderlichen Schritte und kleinen Volumina eine große inhärente Variabilität aufweisen. Sorgfältige Aufmerksamkeit sollte der Technik geschenkt werden, und Übung macht den Meister. Fügen Sie zunächst alle Komponenten aus einem PCR-Kit in einem einzigen PCR-Röhrchen hinzu.
Fügen Sie dann einen Mikroliter des resuspendierten Genfragments hinzu. Homogenisieren Sie die Mischung vorsichtig, indem Sie fünf bis 10 Sekunden lang auf einer mittleren Einstellung wirbeln. Nachdem Sie den Thermocycler gemäß dem Protokoll des Kit-Herstellers programmiert haben, führen Sie die PCR aus.
Verwenden Sie nach Abschluss der PCR ein PCR-Cleanup-Kit, um die DNA aus der Reaktionsmischung zu reinigen. In einem 1,5-Milliliter-Röhrchen den DNA-Bindungspuffer und die PCR-Probe im Verhältnis fünf zu eins hinzufügen. Dieses Gemisch in die Spinsäule geben und eine Minute lang bei 16.000 mal G zentrifugieren.
Verwerfen Sie den Durchfluss. Geben Sie 200 Mikroliter des DNA-Waschpuffers in die Säule und inkubieren Sie ihn bei Raumtemperatur für eine Minute. Zentrifugieren Sie die Säule erneut und verwerfen Sie den Durchfluss.
Waschen Sie die Säule noch einmal mit dem DNA-Waschpuffer, wie gezeigt. Nachdem Sie den Durchfluss aus der zweiten Wäsche verworfen haben, entfernen Sie den verbleibenden Puffer, indem Sie die Säule für weitere ein bis zwei Minuten zentrifugieren. Um die DNA zu eluieren, übertragen Sie die Säule in ein neues 1,5-Milliliter-Röhrchen.
Dann fügen Sie 46 Mikroliter doppelt destilliertes Wasser in die Säule hinzu. Sammeln Sie nach einer einminütigen Inkubation die DNA durch Zentrifugation in die Röhre. Und quantifizieren Sie die gereinigte DNA mit einem Spektralphotometer.
Um die DNA zu verdauen und zu zirkulieren, kombinieren Sie fünf Mikroliter des notwendigen Reaktionspuffers, 20 Einheiten des HindIII-Restriktionsenzyms und 45 Mikroliter der gereinigten DNA in einem PCR-Röhrchen. Diese Mischung mit einer Pipette vorsichtig homogenisieren. Dann inkubieren Sie es in einem Thermocycler für 15 Minuten bei 37 Grad Celsius.
Nach Abschluss der Inkubation inaktivieren Sie das HindIII-Enzym durch Inkubation für 20 Minuten bei 80 Grad Celsius. Fügen Sie dann fünf Mikroliter T4-Ligase-Puffer und 800 Einheiten T4-Ligase zur neu verdauten DNA hinzu. Nach dem vorsichtigen Mischen mit einer Pipette die Mischung für eine Stunde bei 25 Grad Celsius inkubieren, um die Zirkularisierungsreaktion durchzuführen.
Sobald die Reaktion abgeschlossen ist, reinigen Sie die DNA mit einem PCR-Cleanup-Kit, wie zuvor gezeigt. Dann quantifizieren Sie die DNA. Um die Rollkreisverstärkung durchzuführen, kombinieren Sie alle Reaktionskomponenten und einen Mikroliter der gereinigten zirkularisierten Expressionsschablone in einem einzigen Röhrchen.
Homogenisieren Sie die Mischung mit einer Pipette und aliquot 10 Mikroliter der Mischung in vier separate Röhrchen. Inkubieren Sie die Röhrchen bei 30 Grad Celsius für vier bis 18 Stunden, dann inaktivieren Sie das Enzym durch Inkubation bei 65 Grad Celsius für 10 Minuten. Fördern Sie nach der Wärmeinaktivierung die Kondensation am Boden des Rohres, indem Sie fünf Minuten lang bei 12 Grad Celsius inkubieren.
Als nächstes verdünnen Sie die resultierende Lösung, indem Sie 15 Mikroliter doppelt destilliertes Wasser zu jedem Röhrchen hinzufügen. Kombinieren Sie den Inhalt jedes Röhrchens, bevor Sie die DNA reinigen und quantifizieren, wie zuvor gezeigt. Um die zellfreie Reaktion durchzuführen, fügen Sie die verschiedenen erforderlichen Komponenten in ein Röhrchen hinzu und verdünnen Sie es mit doppelt destilliertem Wasser auf das gewünschte Endvolumen.
Mischen Sie die Lösung gründlich, indem Sie die Hälfte der Lösung 10 bis 20 Mal nach oben und unten pipettieren. Das Reaktionsgemisch in 15-Mikroliter-Aliquots zu den gewünschten Vertiefungen in der Mikrotiterplatte überführen. Versiegeln Sie dann die Platte mit einem farblosen Dichtungsfilm, um die Luftfeuchtigkeit aufrechtzuerhalten und verdunstet zu verhindern.
Legen Sie die versiegelte Platte in den Plattenleser und lassen Sie die Reaktion bis zum Abschluss ablaufen. Wenn das Subtilisin BPN-Gen unter Verwendung des zellfreien Systems exprimiert wird, aliquot 94 Mikroliter doppelt destilliertes Wasser und ein Mikroliter 10 mikromolar PNA in einer flachen, farblosen 96-Well-Platte. Fügen Sie dann fünf Mikroliter der abgeschlossenen zellfreien Reaktion hinzu und lesen Sie die Platte mit einem Plattenleser ab, der die Absorption bei 410 Nanometern alle 20 Sekunden für 10 Minuten unter Beibehaltung einer Temperatur von 25 Grad Celsius misst.
Die Expression des Superfolder GFP im BL21 DE3-Sternextrakt mit nur 3 Mikrolitern ungereinigter RCA-DNA in einer 15-Mikroliter-Reaktion ist vergleichbar mit der des PJL1-Plasmids. Die Verdoppelung und Verdreifachung der Vorlagenmengen scheint keinen offensichtlichen Nutzen zu bieten, was auf bereits gesättigte Werte der Vorlage bei 3 Mikrolitern pro Reaktion hindeutet. Umgekehrt scheint es von Vorteil zu sein, die Menge der RCA-Vorlage zu erhöhen, wenn der Shuffle-Stammzellextrakt verwendet wird.
Proteine, die niedrigere Temperaturen oder längere Falzzeiten benötigen, beeinflussen die Zeit, die benötigt wird, um den gesamten Workflow abzuschließen. Zum Beispiel führt die Untersuchung von Subtilisin nach vier Stunden Expression zu einem fehlgeschlagenen Ergebnis, da vier Stunden für die Subtilisinreifung nicht ausreichen. Wenn die Reaktion jedoch bis zu 16 Stunden andauert, führt dies zu nachweisbaren Konzentrationen von Subtilisin.
Alle Komponenten müssen gut gemischt sein, damit dieses Protokoll mit maximaler Effizienz funktioniert. Nach diesen Methoden kann eine große Bibliothek von Proteinkandidaten synthetisch erzeugt und dann mit ausreichender Ausbeute für die Charakterisierung exprimiert werden. Diese Methode ebnete unserer Gruppe den Weg, zwei NC-Sensoren zu entwickeln, die in Zellextrakten arbeiten können, so dass wir das Prototypprotein schnell charakterisieren können.
Dies wird es uns ermöglichen, das Proteindesign neuer Biokatalysatoren und Therapien schneller und intelligenter zu iterieren.
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Übersicht
Diese Studie präsentiert ein Protokoll zur Erzeugung großer Mengen DNA für Protein-Screening aus synthetischen Genfragmenten ohne die Notwendigkeit von Klonierung oder lebenden Zellen. Die Methode nutzt isotherme Rolling Circle Amplification, um schnell DNA-Matrizen zu produzieren, die für zellfreie Expressionsreaktionen geeignet sind.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Biotechnologie
- Molekulare Biologie
- Gentechnik
Hintergrund
- Traditionelle Klonierungsmethoden sind zeitaufwändig und arbeitsintensiv.
- Zellfreie Expressionssysteme bieten eine schnelle Alternative für die Proteinproduktion.
- Rolling Circle Amplification kann effizient große Mengen DNA erzeugen.
- Die Variabilität der Techniken kann für neue Benutzer Herausforderungen darstellen.
Zweck der Studie
- Ein optimiertes Protokoll für die DNA-Generierung bereitzustellen.
- Den Durchsatz in Design-Build-Test-Learn-Zyklen zu erhöhen.
- Die Komplexität der DNA-Vorbereitung für zellfreie Reaktionen zu reduzieren.
Verwendete Methoden
- Enzymatische Verdauung minimaler Matrizen.
- Zirkularisierung von DNA-Fragmenten.
- Isotherme Rolling Circle Amplification zur DNA-Amplifikation.
- Zellfreie Expressionsreaktionen mit ungereinigten Produkten.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Erzeugung großer DNA-Mengen aus kleinen Genfragmenten.
- Demonstrierte schnellere DNA-Produktion im Vergleich zu traditionellen Methoden.
- Hervorgehobene Bedeutung von Technik und Praxis für neue Benutzer.
- Ermöglichte höheren Durchsatz in synthetischen DNA-Anwendungen.
Schlussfolgerungen
- Das Protokoll bietet eine effiziente Methode zur DNA-Generierung.
- Es unterstützt Fortschritte in der zellfreien Proteinsynthese.
- Sorgfältige Durchführung des Protokolls kann Variabilität minimieren.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Rapid enzymatic amplification of minimal, linear DNA templates enables accelerated protein prototyping in cell-free systems, reducing cycle times from gene synthesis to functional assay. This approach supports high-throughput design-build-test-learn workflows, critical for early-stage biopharma discovery and synthetic biology innovation. By bypassing traditional cloning and leveraging direct cell-free expression, teams can iterate on protein candidates with greater speed and flexibility.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables rapid generation and testing of protein variants from synthetic DNA libraries.
- Supports functional validation of novel targets without cell-based cloning constraints.
- Facilitates iterative optimization of protein design for mechanistic de-risking.
Screening & Assay Development
- Provides microgram to milligram quantities of DNA template for scalable cell-free assays.
- Reduces preparation time, allowing faster assay standardization and reproducibility checks.
- Enables direct use of RCA products in screening workflows, minimizing purification steps.
Translational & Preclinical Research
- Accelerates prototyping of candidate biocatalysts and therapeutic proteins for downstream validation.
- Supports rapid characterization of protein function in disease-relevant cell-free systems.
- Improves continuity from synthetic gene design to preclinical protein evaluation.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates at the interface of synthetic gene receipt and early protein function screening, bridging discovery biology and assay development. It is positioned to streamline workflows from gene synthesis through lead identification and preclinical prototyping.
- Discovery Biology: Accelerates hypothesis testing and pathway interrogation by enabling fast protein expression from minimal templates.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative DNA inputs for high-throughput cell-free assays.
- Analytics: Supports direct measurement of protein activity and expression levels from unpurified templates.
- Translational Research: Facilitates rapid transition from synthetic construct to functional protein for preclinical studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, reusable workflow for diverse protein prototyping needs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in protein function and target engagement.
- Operational Value: Standardizes DNA preparation, reduces hands-on time, and enhances throughput.
- Strategic Value: Enables faster go/no-go decisions and reduces resource investment in early-stage candidates.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by enabling rapid, parallel evaluation of multiple constructs.
Implementation Considerations
- Requires proficiency in PCR, enzymatic digestion, and isothermal amplification techniques.
- Needs access to thermocyclers, plate readers, and basic molecular biology infrastructure.
- Demands careful technique to minimize variability, especially for new users handling small volumes.
- Adaptable to various protein targets and cell-free systems with minimal protocol changes.
- Workflow efficiency may vary with protein folding requirements and assay maturation times.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:42
Amplifying the Gene Fragment via PCR
2:21
Digestion and Circularization
3:28
Isothermal Rolling Circle Amplification (RCA)
4:28
Cell-free Reaction and Subtilisin Assay
5:41
Results: Protein Expression from the Rolling Circle Amplification (RCA) Templates Using Cell-Free Systems
6:49
Conclusion
