Name: Untersuchung der dendritischen Zellentwicklung durch kurze Haarnadel RNA-vermittelte Gen-Knockdown in einem hämatopoetischen Stamm und Vorläuferzelllinie In vitro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 12 s
Description: Erfahren Sie die lentivirale Transduktion von shRNA in iHSPCs zur Untersuchung dendritischer Zellentwicklung. Diese Methode ermöglicht stabile Knockdown-Zelllinien für funktionelle Studien.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wir sind dankbar für die technische Unterstützung von Dr. Tz-Ling Chen. Wir danken der National RNAi Core Facility (Academia Sinica, Taiwan) für die Bereitstellung von shRNA Lentivirus (http://rnai.genmed.sinica.edu.tw). Diese Arbeit wurde vom Ministerium für Wissenschaft und Technologie, Taiwan (MOST 108-2320-B-002-037-MY3 und MOST 109-2320-B-002-054-MY3) unterstützt.

Die Handhabung des Lentivirus erfolgt gemäß den Vorschriften der Abteilung für Umweltgesundheit und -sicherheit des National Taiwan University College of Medicine.
1. Herstellung von immortalisierten hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzelllinien (iHSPCs)
<ol><li>Halten Sie die iHSPC-Zelllinie in einem vollständigen RPMI 1640-Medium mit 100 ng/ml FL und 1 μM β-Östradiol.</li>
	<li>Passieren Sie die Zellen in einem Verhältnis von 1:10 alle 3 Tage. HINWEIS: Machen Sie das vollständige RPMI 1640-Medium, indem Sie es mit 10% fetalem Rinderserum (FBS), 5 x 10-5 M β-Mercaptoethanol und 10 μg / ml Gentamicin ergänzen. Rekombinantes murines FL ist auch im Handel erhältlich.</li>
</ol>2. Lentivirale Transduktion
<ol><li>Platten-iHSPCs mit einer Dichte von 1 x 105 Zellen/Well in 12-Well-Platten in 1 ml komplettem Medium, das 100 ng/ml FL, 1 μM β-Östradiol und 8 μg/ml Polybrenn enthält. HINWEIS: Die Konzentration von Polybren hängt von den Zelltypen ab und liegt in der Regel im Bereich von 4-8 μg/ml.</li>
	<li>Fügen Sie shRNA-tragendes Lentivirus in jede Vertiefung bei einer Vielzahl von Infektionen (MOI) von 100 hinzu. HINWEIS: Der lentivirale Vektor ist pLKO.1-Puro mit einem Puromycin-Selektionsmarker (Abbildung 1). Die Zielsequenzen von shRNAs gegen LacZ, Tcf4 bzw. Id2 sind in der Materialtabelle aufgeführt. Der MOI wird durch die Anzahl der Virionen definiert, die während der Infektion pro Zelle hinzugefügt werden. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62730/62730eq01.jpg">
</li>
	<li>Die Platten bei 1.100 x g für 90 min bei 37 °C drehen. HINWEIS: Die Spin-Infektion wird mit einem Schwenklöffelrotor durchgeführt.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Platte mit infizierten Zellen über Nacht bei 37 °C in einem Inkubator. HINWEIS: Wenn die Zellen empfindlich auf Polybren reagieren, erfrischen Sie die Zellen nach der Spininfektion mit dem vollständigen Medium ohne Polybrenn.</li>
	<li>Aktualisieren Sie die Zellen mit einem vollständigen Medium, das 100 ng / ml FL und 1 μM β-Östradiol 24 h nach der Infektion enthält.</li>
	<li>6 μg/ml Puromycin in das Medium geben, um die infizierten Zellen nach weiteren 24 h auszuwählen. HINWEIS: Transduzierter lentiviraler Vektor benötigt normalerweise 48 h für die Exprimierung von Genen, einschließlich Puromycin-resistentem Gen. Stellen Sie sicher, dass die Konzentration von Puromycin für jede Zelllinie optimiert ist.</li>
	<li>Aktualisieren Sie das Selektionsmedium mit 100 ng/ml FL, 1 μM β-Östradiol und 6 μg/ml Puromycin alle 3 Tage und halten Sie die Zellen mindestens eine Woche lang aufrecht, um die stabil transduzierten iHSPC-Zellen zu erweitern. HINWEIS: Die Puromycin-Selektion tritt in der Regel 48 h später in Kraft, und der Zeitraum der Selektion hängt von den Zelltypen ab.</li>
</ol>3. Messung der Knockdown-Effizienz durch Reverse Transcription und Real-Time PCR (RT-PCR)
<ol><li>Extrahieren Sie die Gesamt-RNA aus 1 x 107 shLacZ-, shTcf4- und shId2-stabilen Knockdown-iHSPC-Zellen unter Verwendung eines kommerziellen RNA-Extraktionsreagenzes und scheiden Sie RNA aus der wässrigen Schicht mit Isopropanol aus, gefolgt von einem Waschen der RNA-Niederschlagung mit 75% Ethanol.</li>
	<li>Lösen Sie die RNA (~ 5 μg) mit 5 μL DEPC-behandeltem H2O auf und stellen Sie die Konzentration auf 1 μg/μL ein.</li>
	<li>1-3 μg RNA nehmen, mit DEPC-behandeltem H2O auf ein Endvolumen von 17,4 μL mischen, 1 μL 1 Einheit/μL RNase-freie DNase I hinzufügen und 20 min bei 37 °C inkubieren. HINWEIS: Dieser Schritt besteht darin, die genomische DNA in den RNA-Proben zu verdauen.</li>
	<li>1 μL 20 mM EDTA zu den RNA-Proben geben, bei 65 °C für 10 min inkubieren, um DNase I zu inaktivieren, und die RNA-Proben sofort bei 4 °C platzieren.</li>
	<li>Den RNA-Proben werden 11,6 μL der Reaktionsmischung mit 1 μL Oligo (dT)-Primern (45 μM), 6 μL 5x 1st-Strangpuffer, 3 μL dNTP (2 mM), 0,6 μL RNase-Inhibitor (50 Unit/μL) und 1 μL Reversease (200 Unit/μL) zugegeben und bei 40 °C für 1 h inkubiert.</li>
	<li>Stoppen Sie die Reaktion durch Erhitzen bei 70 °C für 10 min und verdünnen Sie die Reaktionsmischung mit 30 μL H2O.</li>
	<li>Man nimmt 2 μL der verdünnten RT-Reaktionsmischung als DNA-Vorlage und verstärkt sie mit Primern gegen Tcf4 oder Id2 (siehe Tabelle 1 für Thermocycler-Bedingungen). HINWEIS: Die Primersequenzen sind in der Materialtabelle enthalten.</li>
</ol>4. In vitro Differenzierung der stabilen Knockdown-iHSPC-Zelllinien
<ol><li>Halten Sie den stabilen einzelnen Knockdown von LacZ (shLacZ), Tcf4 (shTcf4) oder Id2 (shId2) in iHSPCs in einem vollständigen Medium aufrecht, das 100 ng/ml FL und 1 μM β-Östradiol enthält.</li>
	<li>Sammeln Sie shLacZ, shTcf4 und shId2 undifferenzierte iHSPCs in einem 15-ml-Röhrchen und zentrifugieren Sie für 5 min bei 500 x g , um die Zellen zu pelletieren.</li>
	<li>Verwerfen Sie den Überstand und fügen Sie 10 ml PBS hinzu, um die Zellen zu waschen. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal.</li>
	<li>Resuspendieren und säen Sie die iHSPC-Zellen mit einer Dichte von 2 x 105 Zellen / ml in eine 12-Well-Platte in 1 ml vollständigem Medium, das nur 100 ng / ml FL enthält.</li>
	<li>Fügen Sie drei Tage später 1 ml frisches komplettes Medium mit 100 ng / ml FL hinzu.</li>
	<li>Analysieren Sie die differenzierten Zellen (shLacZ, shTcf4 und shId2 iHSPCs) zwei Tage später mittels Durchflusszytometrie.</li>
</ol>5. Durchflusszytometrische Analyse der differenzierten DCs
<ol><li>Sammeln Sie die Zellen in 1,5 ml Röhrchen, indem Sie die Zellen 2-3 Mal in der Platte auf und ab pipettieren und für 5 min bei 500 x g bei Raumtemperatur (RT) zentrifugieren. HINWEIS: In vitro ätzen sich differenzierte DCs leicht an die Platten. Sanftes Pipettieren hilft, DCs von den Platten zurückzugewinnen.</li>
	<li>Verwerfen Sie den Überstand und resuspenieren Sie die Zellen in 50 μL FACS-Puffer. Als nächstes fügen Sie 50 μL Anti-CD16/32-Hybridom-Überstand hinzu und inkubieren Sie für 5-10 min auf Eis. HINWEIS: Der Fc-blockierende Antikörper verhindert die unspezifische Bindung von Antikörpern an Fc-Rezeptoren, die auf einigen myeloischen Zellen und B-Zellen exprimieren, und ist kommerziell über verschiedene Anbieter erhältlich.</li>
	<li>Fluoreszierende Farbstoff-konjugierte Antikörper (0,04 μg für jeden Antikörper) direkt in die Zellen geben und 15 min auf Eis im Dunkeln inkubieren. Die verwendeten Antikörper sind APC/cy7 Anti-Maus CD11c, FITC Anti-Maus CD11b und PE Anti-Maus B220. HINWEIS: pDCs sind definiert als CD11c+CD11b-B220+, und cDCs sind definiert als CD11c+CD11b+B220-.</li>
	<li>Zellen mit 1 ml FACS-Puffer waschen und 5 min bei 500 x g RT zentrifugieren.</li>
	<li>Resuspendieren Sie die Zellen in 100 μL FACS-Puffer und analysieren Sie sie durch Durchflusszytometrie.</li>
</ol>

<ol><li>Steinman, R. M., Witmer, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphoid+dendritic+cells+are+potent+stimulators+of+the+primary+mixed+leukocyte+reaction+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Lymphoid dendritic cells are potent stimulators of the primary mixed leukocyte reaction in mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 75 (10), 5132-5136 (1978).</li>
<li>Guilliams, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells%2C+monocytes+and+macrophages%3A+a+unified+nomenclature+based+on+ontogeny%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells, monocytes and macrophages: a unified nomenclature based on ontogeny.</a> Nature Reviews Immunology. 14 (8), 571-578 (2014).</li>
<li>Blasius, A. L., Cella, M., Maldonado, J., Takai, T., Colonna, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Siglec-H+is+an+IPC-specific+receptor+that+modulates+type+I+IFN+secretion+through+DAP12%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Siglec-H is an IPC-specific receptor that modulates type I IFN secretion through DAP12.</a> Blood. 107 (6), 2474-2476 (2006).</li>
<li>Swiecki, M., Colonna, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+the+functions+of+plasmacytoid+dendritic+cells+during+viral+infections%2C+autoimmunity%2C+and+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Unraveling the functions of plasmacytoid dendritic cells during viral infections, autoimmunity, and tolerance.</a> Immunology Reviews. 234 (1), 142-162 (2010).</li>
<li>Liu, Y. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IPC%3A+Professional+Type+1+interferon-producing+cells+and+plasmacytoid+dendritic+cell+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">IPC: Professional Type 1 interferon-producing cells and plasmacytoid dendritic cell precursors.</a> Annual Review of Immunology. 23 (1), 275-306 (2005).</li>
<li>Panda, S. K., Kolbeck, R., Sanjuan, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmacytoid+dendritic+cells+in+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Plasmacytoid dendritic cells in autoimmunity.</a> Current Opinion in Immunology. 44, 20-25 (2017).</li>
<li>Durai, V., Murphy, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functions+of+murine+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Functions of murine dendritic cells.</a> Immunity. 45 (4), 719-736 (2016).</li>
<li>Mashayekhi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD8%CE%B1%28%2B%29+dendritic+cells+are+the+critical+source+of+interleukin-12+that+controls+acute+infection+by+Toxoplasma+gondii+tachyzoites%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">CD8α(+) dendritic cells are the critical source of interleukin-12 that controls acute infection by Toxoplasma gondii tachyzoites.</a> Immunity. 35 (2), 249-259 (2011).</li>
<li>Anderson, D. A., Dutertre, C. -A., Ginhoux, F., Murphy, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+models+of+human+and+mouse+dendritic+cell+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Genetic models of human and mouse dendritic cell development and function.</a> Nature Reviews Immunology. 21 (2), 101-115 (2021).</li>
<li>Plantinga, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conventional+and+monocyte-derived+CD11b%28%2B%29+dendritic+cells+initiate+and+maintain+T+helper+2+cell-mediated+immunity+to+house+dust+mite+allergen%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Conventional and monocyte-derived CD11b(+) dendritic cells initiate and maintain T helper 2 cell-mediated immunity to house dust mite allergen.</a> Immunity. 38 (2), 322-335 (2013).</li>
<li>Persson, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IRF4+transcription-factor-dependent+CD103%28%2B%29CD11b%28%2B%29+dendritic+cells+drive+mucosal+T+helper+17+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">IRF4 transcription-factor-dependent CD103(+)CD11b(+) dendritic cells drive mucosal T helper 17 cell differentiation.</a> Immunity. 38 (5), 958-969 (2013).</li>
<li>Kumamoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD301b%2B+dermal+dendritic+cells+drive+T+helper+2+cell-mediated+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">CD301b+ dermal dendritic cells drive T helper 2 cell-mediated immunity.</a> Immunity. 39 (4), 733-743 (2013).</li>
<li>Cisse, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factor+E2-2+is+an+essential+and+specific+regulator+of+plasmacytoid+dendritic+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transcription factor E2-2 is an essential and specific regulator of plasmacytoid dendritic cell development.</a> Cell. 135 (1), 37-48 (2008).</li>
<li>Grajkowska, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isoform-specific+expression+and+feedback+regulation+of+E+protein+TCF4+control+dendritic+cell+lineage+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Isoform-specific expression and feedback regulation of E protein TCF4 control dendritic cell lineage specification.</a> Immunity. 46 (1), 65-77 (2017).</li>
<li>Jackson, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Id2+expression+delineates+differential+checkpoints+in+the+genetic+program+of+CD8%CE%B1%2B+and+CD103%2B+dendritic+cell+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Id2 expression delineates differential checkpoints in the genetic program of CD8α+ and CD103+ dendritic cell lineages.</a> The EMBO Journal. 30 (13), 2690-2704 (2011).</li>
<li>Suzuki, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+roles+of+interferon+regulatory+factor+4+in+CD11bhighCD8alpha-+dendritic+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Critical roles of interferon regulatory factor 4 in CD11bhighCD8alpha- dendritic cell development.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 101 (24), 8981-8986 (2004).</li>
<li>Rodrigues, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+progenitor+lineages+contribute+to+the+heterogeneity+of+plasmacytoid+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Distinct progenitor lineages contribute to the heterogeneity of plasmacytoid dendritic cells.</a> Nature Immunology. 19 (7), 711-722 (2018).</li>
<li>Brown, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+basis+of+mouse+and+human+dendritic+cell+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transcriptional basis of mouse and human dendritic cell heterogeneity.</a> Cell. 179 (4), 846-863 (2019).</li>
<li>Redecke, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+progenitor+cell+lines+with+myeloid+and+lymphoid+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic progenitor cell lines with myeloid and lymphoid potential.</a> Nature Methods. 10 (8), 795-803 (2013).</li>
<li>Abe, A., Miyanohara, A., Friedmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polybrene+increases+the+efficiency+of+gene+transfer+by+lipofection%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Polybrene increases the efficiency of gene transfer by lipofection.</a> Gene Therapy. 5 (5), 708-711 (1998).</li>
<li>Sorgi, F. L., Bhattacharya, S., Huang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protamine+sulfate+enhances+lipid-mediated+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Protamine sulfate enhances lipid-mediated gene transfer.</a> Gene Therapy. 4 (9), 961-968 (1997).</li>
<li>Kirkling, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signaling+facilitates+in+vitro+generation+of+cross-presenting+classical+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Notch signaling facilitates in vitro generation of cross-presenting classical dendritic cells.</a> Cell Reports. 23 (12), 3658-3672 (2018).</li>
<li>Pearce, E. J., Everts, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cell+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Dendritic cell metabolism.</a> Nature Reviews. Immunology. 15 (1), 18-29 (2015).</li>
<li>Wculek, S. K., Khouili, S. C., Priego, E., Heras-Murillo, I., Sancho, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+Control+of+Dendritic+Cell+Functions%3A+Digesting+Information%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Metabolic Control of Dendritic Cell Functions: Digesting Information.</a> Frontiers in Immunology. 10 (775), (2019).</li>
<li>Saxton, R. A., Sabatini, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTOR+signaling+in+growth%2C+metabolism%2C+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">mTOR signaling in growth, metabolism, and disease.</a> Cell. 168 (6), 960-976 (2017).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preiszugeben.

Lentivirus-basierte shRNA-Vektoren werden häufig für das Gen-Silencing durch virale Transduktion in Zellen verwendet und ermöglichen eine stabile Integration in das Wirtsgenom. Es müssen jedoch verschiedene Transduktionseffizienzen in verschiedenen Zelltypen berücksichtigt werden, und es wurden eine Reihe von Ansätzen verfolgt, um dieses Problem zu lösen. 
Polybren ist ein polykationisches Polymer, das die Ladungen auf der Zellmembran neutralisieren kann, wodurch die Bindung des Virions an die...

DCs sind wichtige Regulatoren der angeborenen und adaptiven Immunität1. DCs werden hauptsächlich in zwei funktional unterschiedliche Populationen eingeteilt, nämlich pDCs und cDCs. Darüber hinaus umfassen cDCs zwei Untergruppen, nämlich Typ I und Typ II cDCs oder cDC1s bzw. cDC2s2s. pDCs, die BST2, Siglec-H und mittlere CD11c-Spiegel in Mäusen exprimieren3,4, sind die Zellen, die während Entzündungen und Virusinfektionen große Mengen an IFN-I sezernieren können5. Aufgrund ihrer robusten IFN-I-produzierenden Fähigkeit stehen sie auch im Verdacht, eine Schlüsselrolle beim Fortschreiten von Autoimmunerkrankungen, einschließlich des systemischen Lupus erythematodes (SLE)6, zu spielen. cDC1s, definiert durch die Oberflächenexpression von XCR1, CD8a, CLEC9A und CD103 in Mäusen7, sind auf die Aktivierung und Polarisation von zytotoxischen CD8+ T-Zellen (CTLs) durch die Antigen-Kreuzpräsentation spezialisiert und initiieren dadurch eine Typ-I-Immunität als Reaktion auf intrazelluläre Erreger und Krebs8,9. Auf der anderen Seite können cDC2s, die CD11b und CD172α (auch bekannt als Sirpα) sowohl bei Menschen als auch bei Mäusen exprimieren, CD4+ T-Zellen aktivieren und die Typ-II-Immunantwort gegen Allergene und Parasiten10 fördern sowie die Typ-III-Immunität nach extrazellulärer Bakterien und Mikrobiota-Erkennung modulieren11,12.
Die Diversifikation von DCs wird durch eine Gruppe von TFs aus hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs) im BM bestimmt. E2-2 (kodiert von Tcf4) ist ein Hauptregulator für die Differenzierung und Funktion von pDCs13,14. Im Gegensatz dazu treibt der Inhibitor der DNA-Bindung 2 (ID2) die cDC-Spezifikation voran und hemmt die pDC-Entwicklung durch Blockierung der E-Proteinaktivität15. Darüber hinaus erfordert die Entwicklung von cDC1 IRF8 und BATF3, während die Differenzierung von cDC2s stark von IRF416 abhängt. Neuere Arbeiten haben die Heterogenität von pDCs17 und cDCs und deren transkriptioneller Regulation untersucht18. Aufgrund der Komplexität des DC-Netzwerks besteht ein unerfüllter Bedarf, eine Plattform einzurichten, um andere TFs zu identifizieren, die die Entwicklung und Funktionalität von DCs steuern.
Hier verwendeten wir einen iHSPC, der durch Exprimieren von Östrogen-regulierter Kerntranslokation von Hoxb8 in BM-Zellen (auch hoxb8-FL-Zellen genannt) erzeugt wurde19. iHSPCs können sich in Gegenwart von β-Östradiol und Flt3-Liganden (FL) vermehren und in einem undifferenzierten Stadium verbleiben, während sie sich in Gegenwart von FL nach Abzug von β-Östradiol19 in verschiedene DC-Typen zu differenzieren beginnen. Basierend auf dieser Eigenschaft können wir Interessante Gene im Vorläuferstadium niederschlagen, gefolgt von der Untersuchung der Wirkung auf die In-vitro-Differenzierung von pDCs und cDCs. Daher ist diese Methode ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Gene zu entdecken, die die Entwicklung und Funktion von DCs regulieren.

<table><tbody><tr><td>Antikörper</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>APC/Cy7 Anti-Maus CD11c Antikörper</td><td>Biolegend</td><td>117324</td><td>(Klon: N418)</td></tr><tr><td>FITC Anti-Maus/human CD11b Antikörper</td><td>Biolegend</td><td>101206</td><td>(Klon: M1/70)</td></tr><tr><td>PE Anti-Maus/Mensch B220 Antikörper</td><td>Biolegend</td><td>103208</td><td>(Klon: RA3-6B2)</td></tr><tr><td>Zellkultur</ stark>1,5</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>mL Mikroröhrchen</td><td>&nbsp; ExtraGene</td><td>TUBE-170-C</td><td></td></tr><tr><td>12-Well-Platte mit Gewebekulturbehandlung</td><td>Falcon</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Corning</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium</td><td>Gibco</td><td>11875-085</td><td></td></tr><tr><td>Reagenz</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Estradiol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E2758-250MG</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoethanol (&beta;-ME)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>FACS Puffer</td><td>hausgemacht</td><td></td><td>Formel: 1xPBS+0,5 %FBS+0,1%NaN3</td></tr><tr><td>Flt3 Ligand (FL)</td><td>hausgemacht</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>TR-1003-G</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Invivogen</td><td>ant-pr-1</td><td></td></tr><tr><td>TRIsure</td><td>BIOLINE</td><td>BIO-38032</td><td></td></tr><tr><td>shRNA (Taregt Sequenz/Klon ID)</td><td>Unternehmen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>shId2&nbsp; (GCTTATGTCGAATGATAGCAA/TRCN0000054390)</td><td>Das RNAi-Konsortium (TRC)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>shLacZ (CGCGATCGTAATCACCCGAGT/TRCN0000072224)</td><td>Das RNAi-Konsortium (TRC)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>shTcf4 (GCTGAGTGATTTACTGGATTT/TRCN0000012094)</td><td>Das RNAi-Konsortium (TRC)</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

untersuchung der dendritischen zellentwicklung durch kurze haarnadel rna-vermittelte gen-knockdown in einem hämatopoetischen stamm und vorläuferzelllinie in vitro

Study of Dendritic Cell Development by Short Hairpin RNA-Mediated Gene Knockdown in a Hematopoietic Stem and Progenitor Cell Line In vitro

Dendritische Zellen (DCs) sind wichtige Antigen-präsentierende Zellen, die angeborene und adaptive Immunantworten verbinden. DCs sind heterogen und können in konventionelle DCs (cDCs) und plasmazytoide DCs (pDCs) unterteilt werden. cDCs ist darauf spezialisiert, naiven T-Zellen Antigene zu präsentieren und zu aktivieren. Auf der anderen Seite können pDCs während einer Virusinfektion große Mengen an Typ-I-Interferonen (IFN-I) produzieren. Die Spezifizierung von DCs erfolgt in einem frühen Stadium von DC-Vorläufern im Knochenmark (BM) und wird durch ein Netzwerk von Transkriptionsfaktoren (TFs) definiert. Zum Beispiel drücken CDCs ID2 hoch aus, während pDCs E2-2 stark ausdrücken. Da immer mehr Teilmengen von DCs identifiziert werden, besteht ein wachsendes Interesse daran, spezifische TFs zu verstehen, die die DC-Entwicklung steuern. Hier etablieren wir eine Methode zum Screening von TFs, die für die DCs-Differenzierung in vitro entscheidend sind, indem lentivirus-tragende kurzhaarnadelige RNA (shRNA) in eine immortalisierte hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzelllinie (iHSPCs) abgegeben wird. Nach der Selektion und In-vitro-Differenzierung werden cDC- und pDC-Potential der stabilen Knockdown-Zelllinien mittels Durchflusszytometrie analysiert. Dieser Ansatz bietet eine Plattform, um Gene zu identifizieren, die möglicherweise das DC-Schicksal von Vorläufern in vitro bestimmen.

Die Karte des lentiviralen Vektors pLKO.1-Puro ist dargestellt (Abbildung 1). Nach der Verabreichung von Lentivirus- exprimierender shRNA gegen LacZ (eine Nicht-Targeting-Kontrolle), Tcf4 und Id2 in iHSPCs zeigte die durch RT-qPCR bestätigte Knockdown-Effizienz, dass die Expression von Tcf4 in shTcf4-iHSPCs im Vergleich zu shLacZ-iHSPCs reduziert war (Abbildung 2A). Auf der anderen Seite wurde die verminderte...

Hier stellen wir ein Protokoll für das Screening potenzieller Transkriptionsfaktoren zur Verfügung, die an der Entwicklung dendritischer Zellen (DC) beteiligt sind, unter Verwendung der lentiviralen Transduktion von shRNA, um stabile Knockdown-Zelllinien für die In-vitro-DC-Differenzierung zu erhalten.

Untersuchung der dendritischen Zellentwicklung durch kurze Haarnadel RNA-vermittelte Gen-Knockdown in einem hämatopoetischen Stamm und Vorläuferzelllinie In vitro

Dendritic cells (DCs) are important antigen-presenting cells that connect innate and adaptive immune responses. DCs are heterogeneous and can be divided ...

Dendritische Zellen oder DCs sind wichtige Immunzellen, die das angeborene und adaptive Immunsystem verbinden. Während DCs heterogen sind, hilft uns diese Methode zu verstehen, welche Gene, einschließlich Transkriptionsfaktoren, die DC-Entwicklung regulieren können. Diese Technik bietet eine einfache und schnelle Möglichkeit, ein Gen zu identifizieren, das die DC-Entwicklung von ihrem Vorläufer in vitro steuert.Halten Sie zunächst die immortalisierten hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen oder iHSPCs in einem vollständigen RPMI 1640-Medium, ergänzt mit 100 Nanogramm pro Milliliter des FLT3-Liganden und einem mikromolaren Beta-Östradiol. Für die lentivirale Transduktion werden die iHSPCs in 12 Well-Platten mit einer Dichte von eins mal 10 zu den fünften Zellen pro Vertiefung und einem Milliliter vollständigem Medium, das den FLT3-Liganden, Beta-Östradiol und Polybren enthält, plattiert. Fügen Sie dann das Lentivirus hinzu, das die kurze Haarnadel-RNA in jeder Vertiefung bei einer Vielzahl von Infektionen von 100 trägt.Als nächstes drehen Sie die Platte bei 1100 mal g und 37 Grad Celsius für 90 Minuten und inkubieren Sie dann die infizierten Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius. Am folgenden Tag wird das Polybren entfernt, indem die Zellen in Zentrifugation in 15-Milliliter-Röhrchen gesammelt werden, nachdem das Medium durch ein frisches vollständiges Medium ersetzt wird, das den FLT3-Liganden und das Beta-Östradiol enthält. Nach weiteren 24 Stunden sechs Mikrogramm pro Milliliter Puromycin in das Medium geben, um die infizierten Zellen auszuwählen.Ersetzen Sie das Selektionsmedium alle drei Tage und halten Sie die Zellen mindestens eine Woche lang, um die stabil transduzierten iHSPCs zu erweitern. Generieren und pflegen Sie stabile Knockdown-iHSPCs für LacZ, Tcf4 und Id2 in einem vollständigen Medium, das mit dem FLT3-Liganden und Beta-Östradiol ergänzt wird. Um die In-vitro-Differenzierung einzuleiten, werden die undifferenzierten iHSPCs in 15-Milliliter-Röhrchen gesammelt und die Zellen durch Zentrifugation pelletiert.Nach der Zentrifugation den Überstand verwerfen und die Zellen zweimal mit 10 Milliliter PBS waschen. Nach der zweiten Wäsche resuspendieren Sie die Zellen in einem vollständigen Medium, das nur den FLT3-Liganden enthält, und säen Sie sie dann mit einer Dichte von zweimal 10 bis zum fünften Verkauf pro Milliliter in eine 12-Well-Platte. Nach drei Tagen fügen Sie einen Milliliter frisches komplettes Medium hinzu, das den FLT3-Liganden enthält.Nach weiteren zwei Tagen fahren Sie mit der Analyse der differenzierten Zellen mittels Durchflusszytometrie fort. Für die durchflusszytometrische Analyse pipettieren Sie die Zellen zwei- bis dreimal in der Platte nach oben und unten und sammeln die Zellen dann in 1,5 Milliliter-Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Röhrchen und entsorgen Sie den Überstand, bevor Sie die Zellen in 50 Mikroliter Faxpuffer wiederverwenden.Als nächstes fügen Sie 50 Mikroliter Anti-CD16 durch 32 Hybridom-Überstand hinzu und inkubieren Sie für fünf bis 10 Minuten auf Eis. Fügen Sie dann fluoreszierende Farbstoff-konjugierte Antikörper direkt zu den Zellen hinzu und inkubieren Sie für 15 Minuten auf Eis im Dunkeln. Nach der Inkubation die Zellen mit einem Milliliter Faxpuffer waschen und die Probe zentrifugieren.Nach der Zentrifugation resuspenieren Sie die Zellen in 100 Mikroliter Faxpuffer und analysieren die Proben mittels Durchflusszytometrie. Nach einem kurzen Haarnadel-RNA-vermittelten Knockdown von LacZ, Tcf4 und Id2 in iHSPCS zeigte die Bestätigung der Knockdown-Effizienz durch RTQ-PCR, dass die Expression von Tcf4- und Tcf4-Knockdown-iHSPCs im Vergleich zu der in LacZ-Knockdown-iHSPCs reduziert war. Ähnliche Ergebnisse wurden für die Id2-Expression in den Id2-Knockdown-iHSPCs beobachtet.Nach der Kultivierung von LacZ-Knockdown-iHSPCs für fünf Tage lag die Häufigkeit von CD11c-positiven Zellen, die die dendritische Zellpopulation darstellen, bei etwa 95%. Eine weitere Analyse von CD11c-positiven dendritischen Zellen, die aus den LacZ-Knockdown-iHSPCs gewonnen wurden, ergab, dass 70% konventionelle dendritische Zellen waren, während 22% plasmazytoide dendritische Zellen waren. Die Tcf4-Knockdown-iHSPCs erzeugten einen signifikant geringeren Prozentsatz an plasmazytoide dendritischen Zellen, die der LacZ-Knockdown kontrolliert.Im Gegensatz dazu erzeugten die Id2-Knockdown-iHSPCs einen signifikant geringeren Prozentsatz herkömmlicher dendritischer Zellen als die LacZ-Knockdown-Kontrollen, aber einen höheren Prozentsatz an plasmazytoden dendritischen Zellen. Spin-Infektionen erhöhen die Transduktionseffizienz von Lentivirus-tragender shRNA in die iHSPCs. Diese Technik befasst sich mit der Rolle von Transkriptionsfaktoren und erleichtert die Untersuchung anderer Gene in der Zytokin-Signaltransduktion oder im Metabolismus, die wahrscheinlich an der DC-Entwicklung beteiligt sind.

study-dendritic-cell-development-short-hairpin-rna-mediated-gene

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Dieses Video zeigt das Verfahren zur Unterscheidung myeloide dendritische Zellen aus dem Knochenmark der Maus. Isolierung von Maus Schienbein und Oberschenkelknochen, und die Verarbeitung von Knochenmark nachgewiesen. Bilder zeigen Zellmorphologie vor und nach der Differenzierung und Figurengruppen Zellphänotyp und IL-12 Produktion nach der Reifung mit CpG gezeigt.

Kultur myeloide dendritische Zellen aus dem Knochenmark Vorstufen

Antigen-Präsentation in sekundären lymphatischen Organen durch dendritische Zellen ist entscheidend für die Einleitung des T-Zell-vermittelten adaptive Immunantwort. Hier zeigen wir die Kultur von Knochenmark abgeleiteten dendritischen Zellen, Aktivierung und Etikettierung für die 2-Photonen-Imaging.

Generierung von Knochenmark murinen dendritischen Zellen für den Einsatz in 2-Photonen-Imaging

Wir präsentieren unsere optimierten High-Throughput-Nukleofektion Protokoll als eine effiziente Art der Transfektion von primären humanen Monozyten-abgeleiteten dendritischen Zellen entweder mit Plasmid-DNA oder siRNA, ohne dass Zellreifung. Wir fördern den Nachweis für die erfolgreiche siRNA-Silencing von gezielten Gen RIG-I sowohl auf mRNA-und Protein-Ebene.

Optimiertes Protokoll für die effiziente Transfektion von dendritischen Zellen ohne Zell-Reifung

Lentivirale-vermittelte Knockdown Während Ex Vivo Erythropoese von humanen hämatopoetischen Stammzellen

Dieses Video beschreibt ein Protokoll zur Erzeugung von dendritischen Zellen - Schlüsselantigen-präsentierende Zellen, die T-Zellen aktivieren - aus dem Knochenmark einer erwachsenen Maus.

Generierung dendritischer Zellen aus Knochenmark: Eine Methode zur Erzeugung dendritischer Zellen aus Knochenmark der Maus

In diesem Video demonstrieren wir eine Methode zur Transduktion von lentiviralen shRNA-Vektoren, um stabile Knockdown-Zelllinien in immortalisierten hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen (iHSPCs) zu erhalten.

Short Hairpin RNA-vermittelter Gen-Knockdown in iHSPCs in vitro: Ein Lentivirus-basiertes shRNA-Expressionssystem zur Verabreichung in iHSPCs für den Knockdown der spezifischen Genexpression

Dieses Video zeigt einen In-vitro-Assay zur Erzeugung plasmazytoider dendritischer Zellen (pDCs) aus gängigen lymphoiden Vorläuferzellen (CLPs). Bei der Co-Kultivierung von gereinigten CLPs mit γ-bestrahlten Feeder-Zellen in Gegenwart von Fms-ähnlichen Tyrosinkinase-3-Liganden (FL) differenzieren sich die CLPs in nicht-adhärente pDCs, deren Vorhandensein mittels Durchflusszytometrie bestätigt wird.

In vitro Erzeugung von plasmozytoiden dendritischen Zellen aus gemeinsamen lymphatischen Vorläuferzellen

Dieses Protokoll beschreibt experimentelle Verfahren, die die Differenzierung von dendritischen Zellen in plasmazytoiden Peyer-Plaques aus gemeinsamen dendritischen Vorläuferzellen zu bewerten, mit Hilfe von Techniken mit FACS-vermittelten Zellisolierung, hydrodynamische Gentransfer und Flow-Analyse von Immunteilmengen in Peyer-Plaques.

Die Beurteilung der Entwicklung der Murine Plasmazytoide dendritischen Zellen in Peyer-Patches mit Adoptiv Übertragung von hämatopoetischen Vorläuferzellen

Die Manipulation der temporalen Genexpression in differenzierenden embryonalen Stammzellen (ESCs) kann mit induzierbaren Gensystemen erreicht werden. Die Erzeugung dieser Zelllinien ist jedoch kostspielig und zeitaufwändig. Dieses Protokoll erreicht eine schnelle Expression eines Transgens bei der Differenzierung von ES-abgeleiteten Zellen und die anschließende Analyse der nachgeschalteten hämatopoetischen Differenzierung.

Retrovirale Infektion von murinen embryonalen Stammzellen abgeleitete Embryoidkörper Zellen für die Analyse von hämatopoetischen Differenzierung

RNA-Sequenzierung und Bioinformatik-Analysen wurden verwendet, um deutlich und differentiell exprimiert Transkriptionsfaktoren in Lin-CD34 + und Lin-CD34- Subpopulationen von Maus EMLcells identifizieren. Diese Transkriptionsfaktoren könnten eine wichtige Rolle bei der Bestimmung der Wechsel zwischen Selbsterneuerung Lin-CD34 + und teilweise differenziert Lin-CD34- Zellen spielen.

Identifizierung von Schlüsselfaktoren Regelselbsterneuerung und Differenzierung in EML hämatopoetischen Vorläuferzellen durch RNA-Sequenzierungsanalyse

In dieser Studie stellen wir ein in vitro Kultursystem vor, das effizient pDCs erzeugen kann, indem gemeinsame lymphoide Vorläuferzellen mit AC-6-Feederzellen in Gegenwart von Flt3-Liganden co-kultiviert werden.

In-vitro-Erzeugung von Murine Plasmazytoide dendritischen Zellen aus Lymphoid Gemeinsame Vorläufern mit der AC-6-Feeder-System

Erfahren Sie die lentivirale Transduktion von shRNA in iHSPCs zur Untersuchung dendritischer Zellentwicklung. Diese Methode ermöglicht stabile Knockdown-Zelllinien für funktionelle Studien.

Untersuchung der dendritischen Zellentwicklung durch kurze Haarnadel RNA-vermittelte Gen-Knockdown in einem hämatopoetischen Stamm und Vorläuferzelllinie In vitro (Video) | JoVE Journal

Untersuchung der dendritischen Zellentwicklung durch kurze Haarnadel RNA-vermittelte Gen-Knockdown in einem hämatopoetischen Stamm und Vorläuferzelllinie In vitro

Weitere Videos entdecken