Untersuchung der dendritischen Zellentwicklung durch kurze Haarnadel RNA-vermittelte Gen-Knockdown in einem hämatopoetischen Stamm und Vorläuferzelllinie In vitro
7. März 2022
Hier stellen wir ein Protokoll für das Screening potenzieller Transkriptionsfaktoren zur Verfügung, die an der Entwicklung dendritischer Zellen (DC) beteiligt sind, unter Verwendung der lentiviralen Transduktion von shRNA, um stabile Knockdown-Zelllinien für die In-vitro-DC-Differenzierung zu erhalten.
Dendritische Zellen oder DCs sind wichtige Immunzellen, die das angeborene und adaptive Immunsystem verbinden. Während DCs heterogen sind, hilft uns diese Methode zu verstehen, welche Gene, einschließlich Transkriptionsfaktoren, die DC-Entwicklung regulieren können. Diese Technik bietet eine einfache und schnelle Möglichkeit, ein Gen zu identifizieren, das die DC-Entwicklung von ihrem Vorläufer in vitro steuert.
Halten Sie zunächst die immortalisierten hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen oder iHSPCs in einem vollständigen RPMI 1640-Medium, ergänzt mit 100 Nanogramm pro Milliliter des FLT3-Liganden und einem mikromolaren Beta-Östradiol. Für die lentivirale Transduktion werden die iHSPCs in 12 Well-Platten mit einer Dichte von eins mal 10 zu den fünften Zellen pro Vertiefung und einem Milliliter vollständigem Medium, das den FLT3-Liganden, Beta-Östradiol und Polybren enthält, plattiert. Fügen Sie dann das Lentivirus hinzu, das die kurze Haarnadel-RNA in jeder Vertiefung bei einer Vielzahl von Infektionen von 100 trägt.
Als nächstes drehen Sie die Platte bei 1100 mal g und 37 Grad Celsius für 90 Minuten und inkubieren Sie dann die infizierten Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius. Am folgenden Tag wird das Polybren entfernt, indem die Zellen in Zentrifugation in 15-Milliliter-Röhrchen gesammelt werden, nachdem das Medium durch ein frisches vollständiges Medium ersetzt wird, das den FLT3-Liganden und das Beta-Östradiol enthält. Nach weiteren 24 Stunden sechs Mikrogramm pro Milliliter Puromycin in das Medium geben, um die infizierten Zellen auszuwählen.
Ersetzen Sie das Selektionsmedium alle drei Tage und halten Sie die Zellen mindestens eine Woche lang, um die stabil transduzierten iHSPCs zu erweitern. Generieren und pflegen Sie stabile Knockdown-iHSPCs für LacZ, Tcf4 und Id2 in einem vollständigen Medium, das mit dem FLT3-Liganden und Beta-Östradiol ergänzt wird. Um die In-vitro-Differenzierung einzuleiten, werden die undifferenzierten iHSPCs in 15-Milliliter-Röhrchen gesammelt und die Zellen durch Zentrifugation pelletiert.
Nach der Zentrifugation den Überstand verwerfen und die Zellen zweimal mit 10 Milliliter PBS waschen. Nach der zweiten Wäsche resuspendieren Sie die Zellen in einem vollständigen Medium, das nur den FLT3-Liganden enthält, und säen Sie sie dann mit einer Dichte von zweimal 10 bis zum fünften Verkauf pro Milliliter in eine 12-Well-Platte. Nach drei Tagen fügen Sie einen Milliliter frisches komplettes Medium hinzu, das den FLT3-Liganden enthält.
Nach weiteren zwei Tagen fahren Sie mit der Analyse der differenzierten Zellen mittels Durchflusszytometrie fort. Für die durchflusszytometrische Analyse pipettieren Sie die Zellen zwei- bis dreimal in der Platte nach oben und unten und sammeln die Zellen dann in 1,5 Milliliter-Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Röhrchen und entsorgen Sie den Überstand, bevor Sie die Zellen in 50 Mikroliter Faxpuffer wiederverwenden.
Als nächstes fügen Sie 50 Mikroliter Anti-CD16 durch 32 Hybridom-Überstand hinzu und inkubieren Sie für fünf bis 10 Minuten auf Eis. Fügen Sie dann fluoreszierende Farbstoff-konjugierte Antikörper direkt zu den Zellen hinzu und inkubieren Sie für 15 Minuten auf Eis im Dunkeln. Nach der Inkubation die Zellen mit einem Milliliter Faxpuffer waschen und die Probe zentrifugieren.
Nach der Zentrifugation resuspenieren Sie die Zellen in 100 Mikroliter Faxpuffer und analysieren die Proben mittels Durchflusszytometrie. Nach einem kurzen Haarnadel-RNA-vermittelten Knockdown von LacZ, Tcf4 und Id2 in iHSPCS zeigte die Bestätigung der Knockdown-Effizienz durch RTQ-PCR, dass die Expression von Tcf4- und Tcf4-Knockdown-iHSPCs im Vergleich zu der in LacZ-Knockdown-iHSPCs reduziert war. Ähnliche Ergebnisse wurden für die Id2-Expression in den Id2-Knockdown-iHSPCs beobachtet.
Nach der Kultivierung von LacZ-Knockdown-iHSPCs für fünf Tage lag die Häufigkeit von CD11c-positiven Zellen, die die dendritische Zellpopulation darstellen, bei etwa 95%. Eine weitere Analyse von CD11c-positiven dendritischen Zellen, die aus den LacZ-Knockdown-iHSPCs gewonnen wurden, ergab, dass 70% konventionelle dendritische Zellen waren, während 22% plasmazytoide dendritische Zellen waren. Die Tcf4-Knockdown-iHSPCs erzeugten einen signifikant geringeren Prozentsatz an plasmazytoide dendritischen Zellen, die der LacZ-Knockdown kontrolliert.
Im Gegensatz dazu erzeugten die Id2-Knockdown-iHSPCs einen signifikant geringeren Prozentsatz herkömmlicher dendritischer Zellen als die LacZ-Knockdown-Kontrollen, aber einen höheren Prozentsatz an plasmazytoden dendritischen Zellen. Spin-Infektionen erhöhen die Transduktionseffizienz von Lentivirus-tragender shRNA in die iHSPCs. Diese Technik befasst sich mit der Rolle von Transkriptionsfaktoren und erleichtert die Untersuchung anderer Gene in der Zytokin-Signaltransduktion oder im Metabolismus, die wahrscheinlich an der DC-Entwicklung beteiligt sind.
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Übersicht
Dieser Artikel stellt ein Protokoll zur Untersuchung von Transkriptionsfaktoren vor, die die Entwicklung dendritischer Zellen (DC) durch lentivirale Transduktion von shRNA beeinflussen. Die Methode ermöglicht die Erzeugung stabiler Knockdown-Zelllinien für die in-vitro-Differenzierung von DCs.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Immunologie
- Zellbiologie
- Transkriptionelle Regulation
Hintergrund
- Dendritische Zellen sind entscheidend für die Verbindung zwischen angeborener und adaptiver Immunität.
- Das Verständnis der DC-Entwicklung kann Einblicke in Immunantworten liefern.
- Diese Studie konzentriert sich auf die Identifizierung von Genen, die die Differenzierung dendritischer Zellen regulieren.
- Die Methode nutzt immortalisierte hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen.
Zweck der Studie
- Entwicklung eines Protokolls zur Untersuchung von Transkriptionsfaktoren in der dendritischen Zellentwicklung.
- Erzeugung stabiler Knockdown-Zelllinien für funktionelle Studien.
- Vermittlung der in-vitro-Differenzierung von dendritischen Zellen aus Vorläuferzellen.
Verwendete Methoden
- Kultivierung von iHSPCs in komplettem RPMI 1640-Medium.
- Zugabe von FLT3-Ligand und Beta-Estradiol.
- Lentivirale Transduktion von iHSPCs mit shRNA.
- Verwendung von Polybrene zur Steigerung der Transduktionseffizienz.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Erzeugung stabiler Knockdown-Zelllinien.
- Identifizierung von Transkriptionsfaktoren, die an der DC-Entwicklung beteiligt sind.
- Nachweis der Differenzierungsfähigkeit in vitro.
- Erkenntnisse zur Genregulation der Immunzellentwicklung.
Schlussfolgerungen
- Das Protokoll bietet eine zuverlässige Methode zur Untersuchung der DC-Entwicklung.
- Es kann verwendet werden, um wichtige regulatorische Gene in der Immunologie zu identifizieren.
- Dieser Ansatz könnte das Verständnis immunologischer Reaktionen verbessern.
Häufig gestellte Fragen
Ausführliche Bedeutung für die Industrie
Diese Methode ermöglicht eine systematische Untersuchung der Funktion von Transkriptionsfaktoren bei der Dendritischen-Zell-Linienentscheidung und unterstützt die Zielvalidierung in entdeckungsorientierten, immunologisch ausgerichteten Programmen. Durch die Verknüpfung genetischer Störungen mit phänotypischen Ergebnissen in einem reproduzierbaren In-vitro-System liefert sie eine mechanistische Entlastung früher Zielhypothesen. Der Ansatz erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Priorisierung immunmodulatorischer Zielstrukturen, bevor ressourcenintensive Bemühungen zur Identifizierung von Leitverbindungen unternommen werden.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die funktionelle Untersuchung von Transkriptionsfaktoren als potenzielle therapeutische Zielstrukturen in der Entwicklung dendritischer Zellen.
- Operativer Wert: Bietet eine skalierbare Plattform für Knockdown-Screenings mittels lentiviraler shRNA-Übertragung in immortalisierten hämatopoetischen Vorläuferzellen.
- Prognostischer Wert: Verbindet die Modulation von Zielstrukturen mit der Produktion spezifischer dendritischer Zellsubtypen und unterstützt Entscheidungen über die Fortführung oder Einstellung von Projekten basierend auf Daten zur Linienverzerrung.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt quantitative Durchflusszytometrie-Daten zu CD11c-positiven Zellen und der Verteilung von Subpopulationen (cDC vs. pDC) nach Knockdown des Transkriptionsfaktors.
- Operativer Wert: Etabliert einen standardisierten Differenzierungsassay mit definierten Zytokinkonditionen (FLT3-Ligand, Beta-Estradiol) und Selektion mittels Puromycin.
- Bereitschaft des Assays: Erzeugt stabile Knockdown-Zelllinien, die für wiederholte Anwendungen in Wirkstoffscreenings oder Untersuchungen zur Signalwegsmodulation geeignet sind.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationeller Wert: Modelliert die frühe Differenzierung dendritischer Zellen aus Vorläuferzellen und liefert Hinweise für Biomarkerstrategien, die mit Transkriptionsfaktor-Netzwerken verknüpft sind.
- Mechanistische Risikominimierung: Klärt die Rolle von Id2 bei der Förderung des Schicksals konventioneller dendritischer Zellen und von Tcf4 bei der Unterstützung der Entwicklung plasmazytoider dendritischer Zellen.
- Präklinische Abstimmung: Unterstützt die Evaluierung von Zielstrukturen, die die Differenzierung von Immunzellen beeinflussen und für Impfadhäsive oder Autoimmunitätsprogramme relevant sind.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode ist in die Entdeckungsbiologiephase integriert und ermöglicht die Überprüfung von Target-Hypothesen, bevor Assays zur Identifizierung von Leitverbindungen entwickelt werden; die gewonnenen Daten unterstützen die Auswahl präklinischer Kandidaten in der Immunmodulation.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die mechanistische Aufklärung transkriptioneller Regulatoren, die die Differenzierung dendritischer Zellen aus hämatopoetischen Vorläuferzellen steuern.
- Assay-Entwicklung: Erzeugt reproduzierbare, quantitative Endpunkte mittels Immunfluoreszenz und Durchflusszytometrie zur Überwachung der Differenzierungseffizienz und Verteilung von Zellsubpopulationen.
- Analytik: Liefert quantifizierbare Messgrößen (Prozentsatz an CD11c+, cDC, pDC), die den Vergleich zwischen verschiedenen Knockdown-Bedingungen ermöglichen und die statistische Bewertung des Einflusses von Zielgenen unterstützen.
- Translationale Forschung: Verbindet die Differenzierung früher Vorläuferzellen mit nachgeschalteten immunologischen Funktionen und ist somit relevant für die Modellierung von Immunantworten in Kontexten von Infektion oder Toleranz.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform zum Screening weiterer Gene in Zytokin-Signalwegen, Stoffwechselprozessen oder transkriptionellen Netzwerken, die die Entwicklung dendritischer Zellen beeinflussen.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Steigert das Vertrauen in die Zielvalidierung, indem der Knockdown von Transkriptionsfaktoren mit messbaren Veränderungen bei der Generierung von dendritischen Zellsubtypen verknüpft wird.
- Operativer Wert: Ermöglicht die Standardisierung von Differenzierungs- und Nachweisprotokollen zwischen verschiedenen Laboren durch definierte Kulturmedienbedingungen und Selektionsmarker.
- Strategischer Wert: Verringert das biologische Risiko bei der Auswahl immunmodulatorischer Zielstrukturen, indem frühzeitige funktionelle Hinweise auf linien-spezifische Effekte bereitgestellt werden.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung von Zielstrukturen basierend auf deren Einfluss auf Zelllinienentscheidungen dendritischer Zellen und fördert eine effiziente Ressourcenallokation.
Durchlegungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der lentiviralen Transduktion, der hämatopoetischen Zellkultur und der Durchflusszytometrie.
- Hängt vom Zugang zu lentiviralen shRNA-Bibliotheken, Puromycin-Selektion und zytokinangereicherten Medien (FLT3-Ligand, Beta-Estradiol) ab.
- Erfordert die Standardisierung der Transduktionseffizienz (z. B. mittels Spin-Infektion) und der Selektionsdauer zur Erzeugung stabiler Knockdowns.
- Beinhaltet die Optimierung des Differenzierungszeitpunkts und der Antikörpanelen zur genauen Identifizierung dendritischer Zellsubtypen per Durchflusszytometrie.
- Auf die in-vitro-Modellierung beschränkt; die Ergebnisse bedürfen einer Validierung in primären humanen oder murinen Systemen, um translational relevant zu sein.
Biopharma-Häufig gestellte Fragen
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:43
Preparation of Immortalized HematopoieticStem and Progenitor Cell (iHSPC) Lines and Lentiviral Transduction
2:08
In Vitro Differentiation of the Stable Knockdown iHSPC Cell Lines
3:05
Flow Cytometric Analysis of the Differentiated Dendritic Cells
4:01
Results: Dendritic Cell Differentiation Following Short Hairpin RNA-Mediated Tcf4 and Id2 Knockdown
5:33
Conclusion
