Untersuchungen von Chaperon-Cochaperon-Interaktionen mit homogenem Bead-based Assay

Wir haben einen homogenen perlenbasierten Assay entwickelt, um Chaperon-Cochaperon-Interaktionen zu untersuchen. Mit dieser Technik screenen wir kleine Moleküle, die Wechselwirkungen zwischen Hsp90 und FKDP51 oder FKBP52 hemmen, und identifizieren potente und selektive Inhibitoren. Diese Hochdurchsatz-Siebtechnik ist robust und zuverlässig.

Ergebnisse können innerhalb einer Stunde erzielt werden, und es erfordert nur kleine Mengen an Perlenprotein und Verbindungen. Die Hsp90-Interaktion mit diesen Cochaperonen war an menschlichen Erkrankungen wie Alzheimer, Krebs und Autoimmunerkrankungen beteiligt. Diese Technik bietet die Möglichkeit, Chaperon-Cochaperon-Inhibitoren mit hoher medizinischer Bedeutung zu screenen.

Hier ist das Grundprinzip dieses Assays. Wenn die Interaktion zwischen Hsp90C-terminalem Peptid und TPR-Domäne von Cochaperonen die Spender- und Akzeptorperlen in die Nähe bringt, wird ein stark verstärktes Signal erzeugt. Wenn die Interaktionshemmer hinzugefügt werden, können die Spender- und Akzeptorperlen keine Nähe erreichen und es wird kein nachweisbares Signal erzeugt.

Beginnen Sie mit der Verdünnung des Hsp90-Peptids in PBS bei einer Konzentration von einem Milligramm pro Milliliter. Verdünnen Sie die unkonjugierten Akzeptorperlen in PBS und geben Sie die Perlen in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen über. Zentrifugieren Sie die verdünnten Perlen zum Waschen und entfernen Sie dann vorsichtig den Überstand.

Für die Konjugation setzen Sie die Akzeptorperlen in Peptiden auf ein Verhältnis von 10 zu 1. Zu den Paletidenperlen an PBS verdünnten Peptid, Tween 20 und Natriumcyanaboroughhydridlösung, und inkubieren mit Ende über Ende Rühren auf einem Rotationsschüttler. Um die nicht umgesetzten Stellen zu blockieren, fügen Sie 20 Mikroliter einer molaren Tris-Hydrochloridlösung von pH 8,0 zu den Perlen hinzu und löschen Sie die Reaktion ab, indem Sie eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius inkubieren.

Am Ende der Inkubation die Perlen durch Zentrifugation waschen und das Perlenpellet in einem Milliliter Tris-Hydrochloridlösung erneut suspendieren. Wiederholen Sie das Waschen noch zwei weitere Male. Nach dem letzten Waschen die Perlen bei einer Konzentration von Milligramm pro Milliliter im Lagerpuffer wieder aufhängen und die konjugierte Akzeptorperlenlösung bei 4 Grad Celsius lichtgeschützt lagern.

Fügen Sie Glutathionspenderperlen mit einer Konzentration von 10 Mikrogramm pro Milliliter in PBS hinzu. Fügen Sie GSTFKBP51 zu einer Endkonzentration von 10 Mikrogramm pro Milliliter hinzu und inkubieren Sie die Reaktion für 10 Minuten bei 25 Grad Celsius im Dunkeln. Machen Sie serielle Verdünnungen der Testverbindung in DMSO.

Fügen Sie 0,25 Mikroliter Testverbindungsverdünnungen hinzu und verdreifachen Sie sie in der Ecke jeder Vertiefung einer 384-Well-Platte. Zur Negativkontrolle fügen Sie 0,25 Mikroliter DMSO hinzu und zur Positivkontrolle 0,25 Mikroliter Hsp90 C-Terminal-Peptid in die Vertiefungen. Fügen Sie 22,5 Mikroliter der Lösung, die Glutathion-Spenderperlen mit GST-markierten Proteinen enthält, zu jeder Vertiefung hinzu.

Den Teller gründlich mit den Händen schütteln und im Dunkeln bei 25 Grad Celsius 15 Minuten lang inkubieren. Verdünnen Sie die Akzeptorperlen mit dem angehängten Hsp90C-Terminal-Peptid auf 100 Mikrogramm pro Milliliter Konzentration in 0,5-fachem PBS. Fügen Sie 2,25 Mikroliter verdünnter Akzeptorperlen zu jeder Vertiefung hinzu.

Schütteln und inkubieren Sie den Teller im Dunkeln für 15 Minuten, wie gezeigt. Schalten Sie das Plattenlesegerät ein, messen Sie das Signal der Platte und analysieren Sie die Daten wie im Textmanuskript beschrieben. Erstellen Sie im Begrüßungsdialog eine X-Y-Datentabelle, wählen Sie X-Zahlen, Y und geben Sie drei Replikatwerte in nebeneinander verfügbare Spalten ein.

Importieren Sie die Konzentrationswerte in die Spalte X und die Signalwerte in die Spalte Y. Klicken Sie auf Analysieren, wählen Sie Konzentration X transformieren und dann In Logarithmen transformieren aus. Klicken Sie auf Analysieren und wählen Sie unter X-Y-Analyse die Option Nichtlineare Regression aus.

Öffnen Sie die Option Dosis-Wirkungs-Hemmung und wählen Sie Log versus Response Variable Slope-Gleichung. Klicken Sie auf OK, um die Ergebnisse mit IC50-Werten und Diagrammen anzuzeigen. Dieser Assay wurde zum Screening kleiner Moleküle verwendet, um Wechselwirkungen zwischen Hsp90 und FKBP51 oder FKBP52 zu hemmen.

Der Z-Wert von mehr als 0,8 und das Signal-Hintergrund-Verhältnis von 13,35 zeigen die Robustheit und Zuverlässigkeit für ein Screening mit hohem Durchsatz. Die Wirkung der kleinen Molekulargewichtstestverbindung D10 auf die Hemmung von Chaperon-Cochaperon-Wechselwirkungen wurde bewertet und IC50-Werte berechnet, wobei D10 eine dosisabhängige Hemmung zeigte. Der IC50-Wert für Hsp90 GSTFKBP51-Wechselwirkungen betrug 65 Nanomolar.

Während bei Hsp90-, GSTFKBP52-Wechselwirkungen keine vollständige Hemmung mit der höchsten Verbindungskonzentration erreicht wurde, deutet dies darauf hin, dass eine selektive Hemmung der Protein-Protein-Interaktion mit kleinen Molekülen erreicht werden kann. Der entscheidende Schritt ist die Reihenfolge der Addition. Wir bilden zunächst einen Komplex zwischen einem kleinen Molekül und seinem TPR-Ziel.

Andernfalls sind eine längere Inkubation und höhere Verbindungskonzentrationen erforderlich. Wir können diese Technik verwenden, um nach kleinen Molekülen zu suchen, die die Interaktion zwischen Hsp90 und FKB51 oder Hsp90 und FKB52 stören. Es kann auch auf jede Interaktion zwischen Hsp90, Hsp70 und einem TPR-Motiv erweitert werden, das Cochaperon-Screening-selektive Inhibitoren enthält.