Name: Markierung extrazellulärer Vesikel zur Überwachung der Migration und Aufnahme in Knorpelexplantaten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie extrazelluläre Vesikel markieren und deren Migration sowie Aufnahme in Knorpelexplantaten mit konfokaler Mikroskopie überwachen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von EV-Verteilung in therapeutischen Kontexten.

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Diese Forschung wurde vom Instituto de Salud Carlos III, Ministerio de Economía y Competitividad, kofinanziert durch den Europäischen Sozialfonds ESF und den Europäischen Fonds für regionale Entwicklung EFRE (MS16/00124; CP16/00124); durch das PROGRAMA JUNIOR del proyecto TALENT PLUS, construyendo SALUD, generando VALOR (JUNIOR01/18), finanziert durch die nachhaltige Tourismusabgabe der Balearen; von der Direcció General d'Investigació, Conselleria d'Investigació, Govern Balear (FPI/2046/2017); durch das FOLIUM-Postdoktorandenprogramm (FOLIUM 17/01) innerhalb der FUTURMed, das zu 50% aus der Nachhaltigen Tourismussteuer der Balearen und zu 50% aus dem ESF finanziert wird; und vom Comissio de Docencia i Investigacio de la Fundacio Banc de Sang i Teixits de les Illes Balears (CDI21/03).

HINWEIS: Knorpelexplantaten wurden von der IdISBa Biobank (IB 1995/12 BIO) in Übereinstimmung mit institutionellen Richtlinien nach ethischer Genehmigung des Projekts durch die CEI-IB (IB 3656118 PI) bezogen.
1. Säulenvorbereitung
<ol><li>Setzen Sie die Spalten gemäß den Anweisungen des Herstellers oder wie folgt aus:<ol>
<li>Entfernen Sie die Spaltenkappe, und gleichen Sie die Spalte aus. Entfernen Sie den Speicherpuffer durch Elution.</li>
		<li>Waschen Sie die Säule 3 mal mit 2,5 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Warten Sie bei jeder Wäsche, bis die Säule das gesamte Volumen absorbiert hat. HINWEIS: Lassen Sie die Säule nicht trocknen.</li>
		<li>Decken Sie die Säule nach der letzten Wäsche und bis zur Probenvorbereitung mit der Kappe ab.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. EV-Kennzeichnung
HINWEIS: Dieses EV-Kennzeichnungsprotokoll verwendet eine PL-EV-Probe, die zuvor durch Größenausschlusschromatographie (SEC) mit den zuvor beschriebenenBedingungen 21,22isoliert wurde. Jede EV-Probe aus einer beliebigen Quelle kann jedoch mit diesem Protokoll verwendet werden.
<ol><li>Konzentrieren Sie die EV-Probe und die Steuerung (PBS) mit einem konzentrierenden Röhrchen.<ol>
<li>Legen Sie die Proben in ein 15 mL oder 500 μL konzentrierendes Röhrchen, abhängig vom Startvolumen der EV-Probe. Zentrifugieren Sie die Röhrchen gemäß den Anweisungen des Herstellers, bis eine fast trockene Probe erhalten ist. HINWEIS: Die Kontrollprobe ist notwendig, um nach Farbstoffhintergrund zu suchen. Obwohl diese Methode kein spezifisches Anfangsvolumen erfordert, sollte berücksichtigt werden, dass während der Reinigungsschritte etwa 10% der Partikel verloren gehen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Resuspendieren Sie die konzentrierten Proben mit Verdünnungsmittel C. Resuspend EV Proben mit 200 μL und die Kontrollgruppe mit 100 μL und übertragen Sie sie auf neue 1,5 ml Zentrifugenröhrchen.</li>
	<li>Trennen Sie die EV-Probe in zwei Aliquots von 100 μL. Markieren Sie eine mit Farbstoff und verwenden Sie sie als Behandlung (PKH-PL-EV); Lassen Sie die andere unmarkiert, aber verarbeiten Sie sie (NTA-PL-EV) wie die EV-Probe und verwenden Sie sie, um die EV-Konzentration durch NTA zu quantifizieren.</li>
	<li>2x Farbstofflösung herstellen, was zu 8 μM PKH26 Lösung in Verdünnungsmittel C führt.</li>
	<li>Mischen Sie 1 μL 1 mM PKH26 Linker pro 125 μL Verdünnungsmittel C in der Probe. Bereiten Sie ein Volumen vor, das erforderlich ist, um die Proben im Verhältnis 1: 1 hinzuzufügen.</li>
	<li>Fügen Sie PKH-PL-EV 2x Farbstofflösung hinzu und kontrollieren Sie Proben im Verhältnis 1: 1, um eine 1x Farbstoffkonzentration und eine 4 μM PKH26-Konzentration zu erreichen. Fügen Sie der NTA-PL-EV-Probe das gleiche PBS-Volumen hinzu. 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
	<li>Geben Sie 5% ige Rinderserumalbumin-PBS-Lösung im Verhältnis 1: 1 zu den Proben und stellen Sie sicher, dass das Endvolumen ~ 400 μL beträgt. HINWEIS: Dieser Schritt ermöglicht die Entfernung von unspezifischen Farbstoffwechselwirkungen oder ungebundenen Farbstoffen.</li>
	<li>Trennen Sie die markierten EVs vom ungebundenen Farbstoff und den unspezifischen Wechselwirkungen des Farbstoffs mit der Säule.</li>
</ol>3. Gekennzeichnete EV-Isolierung
<ol><li>Entfernen Sie die Kappe aus der Säule, fügen Sie 400 μL der Probe hinzu (PKH-PL-EV, NTA-PL-EV oder Kontrolle) und verwerfen Sie die gesamte eluierte Flüssigkeit.</li>
	<li>Warten Sie, bis das Beispiel vollständig in die Spalte gelangt ist, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren. Fügen Sie 600 μL PBS hinzu und verwerfen Sie die gesamte eluierte Flüssigkeit.</li>
	<li>Warten Sie, bis der PBS die Spalte vollständig aufgerufen hat, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren. Fügen Sie 600 μL PBS hinzu und sammeln Sie einen Bruchteil von 600 μL in einem 1,5. ml Zentrifugenröhrchen (EVs oder Steuerung). HINWEIS: Diese Schritte sind erforderlich, um den überschüssigen Farbstoff aus den Proben zu entfernen. Eine weitere Trennung nach Säulen ist erforderlich, um reinere EVs zu erhalten. Daher sollten die folgenden Schritte in einer neuen äquilibrierten Spalte (Schritt 4.1.) oder derselben Spalte nach einem ersten Waschschritt (Schritt 4.2) durchgeführt werden.</li>
	<li>Bereiten Sie die Säule für einen neuen EV-Trennschritt vor, um reinere EVs zu erhalten. Wenn es sich um eine neue Spalte handelt, wiederholen Sie die Schritte 2.1. und 2.2. Wenn es sich um dieselbe Säule handelt, waschen Sie die Säule mit 2,5 ml 20% Isopropanol und wiederholen Sie dann die Schritte 2.1 und 2.2.</li>
	<li>Fügen Sie 600 μL der zuvor eluierten EVs, die in Schritt 2.5 erhalten wurden, in die Spalte und verwerfen Sie das eluierte Volumen. Warten Sie, bis die Flüssigkeit vollständig in die Säule gelangt ist, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren.</li>
	<li>Fügen Sie 400 μL PBS hinzu und verwerfen Sie das gesamte eluierte Volumen. Warten Sie, bis die Flüssigkeit vollständig in die Säule gelangt ist, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren.</li>
	<li>Fügen Sie 600 μL PBS hinzu und sammeln Sie einen Bruchteil von 600 μL in einem 1,5 ml Zentrifugenröhrchen. Verwenden Sie die EVs und Kontrollproben für weitere Analysen oder lagern Sie sie über Nacht bei 4 oC.</li>
	<li>Speichern Sie die verwendeten Spalten für die zukünftige Verwendung.<ol>
<li>Waschen Sie die Säule mit 25 ml 20% Isopropanol und verwerfen Sie das eluierte Volumen. Waschen Sie die Säule 3 mal mit 2,5 ml PBS.</li>
		<li>Fügen Sie den in Schritt 1.1.1 entfernten Speicherpuffer hinzu, und warten Sie, bis der Puffer in die Spalte gelangt ist. Decken Sie die Säule mit der Kappe ab und lagern Sie sie bis zum späteren Gebrauch bei 4 oC.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. EV-Quantifizierung
<ol><li>Bereiten Sie 1:1.000 Verdünnungen der NTA-PL-EV-Probe und der anfänglichen PL-EV-Probe vor, wie in den folgenden zwei Schritten beschrieben.<ol>
<li>Bereiten Sie 1 ml 1:10 verdünntes NTA-PL-EV und 1 ml 1:10 verdünntes anfängliches PL-EV mit PBS vor, das durch einen 0,2 μm-Filter filtriert wird.</li>
		<li>Bereiten Sie 1 ml einer 1:100-Verdünnung der zuvor verdünnten Proben mit PBS vor, das durch einen 0,2 μm-Filter filtriert wird.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Injizieren Sie die 1:1.000 verdünnte NTA-PL-EV-Probe oder die anfängliche PL-EV-Probe mit einer sterilen Spritze in die NTA-Pumpe. Befolgen Sie die Anweisungen und Empfehlungen des Herstellers zur Bestimmung der Partikelkonzentration und der Größenverteilung. HINWEIS: Da die EV-Konzentration vom Probenstartervolumen abhängt, kann es erforderlich sein, Zwischenverdünnungen abzulesen und Anpassungen vorzunehmen, um eine korrekte NTA-Bestimmung zu erhalten.</li>
</ol>5. EVs zur Behandlung von entzündungsbedingter OA
<ol><li>Waschen Sie den Knorpel zweimal mit PBS und schneiden Sie ihn mit einem Biopsiestempel mit einem Durchmesser von 3 mm unter sterilen Bedingungen aus. HINWEIS: Führen Sie das Verfahren aus den Schritten 5.1 bis 5.6 in einer Zellkulturhaube aus.</li>
	<li>Legen Sie die Explantate in 96-Well-Kulturplatten mit DMEM-F12-Medium, ergänzt mit 1% Penicillin-Streptomycin bei 37 oC, 5%CO2und 80% Luftfeuchtigkeit.<ol>
<li>Um ein entzündungsgetriebenes OA-Modell zu etablieren, ergänzen Sie das Zellkulturmedium mit 10 ng/ml Oncostatin M und 2 ng/ml Tumornekrosefaktor-alpha (TNFα).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Behandeln Sie die Explantate mit 1 × 109 Partikeln/Well von markierten EVs (PKH-PL-EV) oder kontrollieren Sie sie in einem Zellkulturmedium, das mit Oncostatin M und TNFα ergänzt wird. ANMERKUNG: Messen Sie das Volumen der Probe, die 1 × 109 Partikel/Vertiefung enthält, und verwenden Sie das gleiche Volumen für die Kontrolle.</li>
	<li>Entfernen Sie das Medium von den 96-Well-Zellkulturplatten, die Knorpel-Explantate enthalten. Zu jeder Vertiefung werden 200 μL des in Schritt 5.3 beschriebenen Zellkulturmediums gegeben. HINWEIS: Wenn die 96-Well-Platten mit fetalem Rinderserum (FBS) in Kontakt gekommen sind, waschen Sie jede Vertiefung dreimal mit 200 μL PBS, um EVs aus dem FBS zu entfernen.</li>
	<li>Stoppen Sie den In-vitro-Test zu verschiedenen Zeiten: 0, 1, 2, 3, 4 und 5 h.</li>
	<li>Waschen Sie die Zellkulturtöpfe, die die Knorpelexplantate enthalten, zweimal mit 200 μL PBS.</li>
	<li>Geben Sie 100 μL 4% Paraformaldehyd (PFA) in das Gewebe, um es für 3 h bei 4 oC zu fixieren. HINWEIS: Schritte mit PFA sollten in einem Abzug gemäß den Empfehlungen des Sicherheitsdatenblatts durchgeführt werden.</li>
	<li>Entfernen Sie die PFA, geben Sie 100 μL PBS hinzu, lagern Sie das fixierte Gewebe bei 4 °C und verarbeiten Sie die Proben innerhalb von 48 h.</li>
</ol>6. Vorbereitung und Visualisierung der Mikroskopie
HINWEIS: Dieses histologische Verfahren besteht aus Dehydratisierung, Paraffineinbettung und Rehydratationsschritten. Diese Schritte können die Gesamtfluoreszenz des Farbstoffs reduzieren (eine Einschränkung, die im Datenblatt für PKH26 erwähnt wird). Daher können andere Verfahren, wie z. B. gefrorene Schnitte, für die EV-Visualisierung durch konfokale Mikroskopie besser geeignet sein.
<ol><li>Betten Sie die fixierten Gewebe in Paraffinblöcke ein. Schneiden Sie das Gewebe in 6 μm dicke Abschnitte.</li>
	<li>Entparaffinisieren Sie die Gewebeschnitte. HINWEIS: Alle Schritte mit Xylol sollten in einem Abzug durchgeführt werden.<ol>
<li>Tauchen Sie die Gewebeschnitte für 30 min in Xylol, 2 min in 100% Ethanol, 2 min in 96% Ethanol, 1 min in 75% Ethanol und schließlich 30 s in destilliertes Wasser.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Permeabilisieren Sie die Gewebeschnitte.<ol>
<li>Bereiten Sie eine 0,1% ige Triton-0,1% Natriumcitratlösung vor, um das Gewebe zu permeabilisieren. Geben Sie einen 20 μL Tropfen zu jedem Gewebeabschnitt und inkubieren Sie für 10 min bei Raumtemperatur. Waschen Sie jeden Abschnitt zweimal mit 20 μL PBS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Auf einem mikroskopisch kleinen Objektträger wird ein Tropfen Montagemedium mit 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) mit einem wässrigen Montagemedium zur Erhaltung der Fluoreszenz gegeben. Bedecken Sie das Objektträger mit 3 Gewebeschnitten aus Schritt 6.3.1.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Dias über Nacht bei Raumtemperatur, geschützt vor Licht.</li>
	<li>Bis zur konfokalen Mikroskopie lichtgeschützt bei 4 °C lagern.</li>
</ol>

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<li>Deddens, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+extracellular+vesicles+contain+miRNAs+and+are+released+as+early+biomarkers+for+cardiac+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiovascular+Translational+Research%22%5BJournal%5D)">Circulating extracellular vesicles contain miRNAs and are released as early biomarkers for cardiac injury.</a> Journal of Cardiovascular Translational Research. 9 (4), 291-301 (2016).</li>
<li>Skardelly, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+benefit+of+human+fetal+neuronal+progenitor+cell+transplantation+in+a+clinically+adapted+model+after+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Long-term benefit of human fetal neuronal progenitor cell transplantation in a clinically adapted model after traumatic brain injury.</a> Journal of Neurotrauma. 28 (3), 401-414 (2011).</li>
<li>Protocol guide: Exosome labeling using PKH lipophilic membrane dyes. , 
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<li>Dehghani, M., Gulvin, S. M., Flax, J., Gaborski, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evaluation+of+PKH+labelling+on+extracellular+vesicle+size+by+nanoparticle+tracking+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Systematic evaluation of PKH labelling on extracellular vesicle size by nanoparticle tracking analysis.</a> Scientific Reports. 10 (1), 1-10 (2020).</li>
<li>Morales-Kastresana, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+extracellular+vesicles+for+nanoscale+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Labeling extracellular vesicles for nanoscale flow cytometry.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-10 (2017).</li>
<li>Takov, K., Yellon, D. M., Davidson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confounding+factors+in+vesicle+uptake+studies+using+fluorescent+lipophilic+membrane+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Confounding factors in vesicle uptake studies using fluorescent lipophilic membrane dyes.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1388731(2017).</li>
<li>Mortati, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+study+of+extracellular+vesicles+migration+in+cartilage-derived+osteoarthritis+samples+using+real-time+quantitative+multimodal+nonlinear+optics+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">In vitro study of extracellular vesicles migration in cartilage-derived osteoarthritis samples using real-time quantitative multimodal nonlinear optics imaging.</a> Pharmaceutics. 12 (8), 1-18 (2020).</li>
</ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

DIE EV-Bildgebung hilft, ev-Eigenschaften zu verstehen, wie z.B. ihre Freisetzungs- und Aufnahmemechanismen. Ihre Bildgebung ermöglicht die Überwachung ihrer Bioverteilung und die Charakterisierung ihrer pharmakokinetischen Eigenschaften als Wirkstoffvehikel. Die Bildgebung und Verfolgung von Elektrofahrzeugen kann jedoch aufgrund ihrer geringen Größe schwierig sein, obwohl viele bildgebende Geräte und Markierungstechniken entwickelt wurden, um Forschern bei der Überwachung von Elektrofahrzeugen unter In-vitro- ...

Osteoarthritis (OA) ist eine artikuläre degenerative Erkrankung, die eine fortschreitende und irreversible Entzündung und Zerstörung der extrazellulären Matrix des Gelenkknorpelsimpliziert 1. Obwohl verschiedene Formen der Arthritis zahlreiche Behandlungenhaben 2,3,4, sind diese durch ihre Nebenwirkungen und begrenzte Wirksamkeit eingeschränkt. Tissue-Engineering-Techniken unter Verwendung der autologen Chondrozytenimplantation werden routinemäßig zur regenerativen Behandlung von verletztem Knorpel bei frühen OA-Knorpelläsionen angewendet4. Zellbasierte Therapien sind vor allem aufgrund der begrenzten Anzahl von phänotypisch stabilen Chondrozyten oder Chondroprogenitoren eingeschränkt, die in der Lage sind, den Knorpel effektiv zu reparieren3. Daher ist die Entwicklung neuer therapeutischer Strategien zur Verhinderung des Fortschreitens der Krankheit und zur Regeneration großer Knorpelläsionen von größter Bedeutung.
Extrazelluläre Vesikel (EVs) wurden von verschiedenen Autoren als Behandlung für OA vorgeschlagen5,6. EVs sind membranöse Körper, die von der Mehrheit der Zelltypen sezerniert werden, an der interzellulären Signalgebung beteiligt sind und nachweislich die therapeutische Wirkung von Stammzellen ausüben7,8,9, wodurch sie kürzlich Interesse an der regenerativen Medizin geweckt haben10. EVs, die von mesenchymalen Stromazellen (MSCs) abgeleitet sind, sind die wichtigsten therapeutischen EVs, die für OA untersucht wurden, obwohl andere gelenkbezogene Zellen als EV-Quellen verwendet wurden, z. B. Chondroprogenitoren oder Immunzellen11,12.
Thrombozytenkonzentrate, wie Thrombozytenlysate (PLs), werden verwendet, um die Wundheilung bei verschiedenen Verletzungen, wie Hornhautgeschwüren13 , 14,15 oder bei der Sehnengewebsregeneration16zu verbessern , aufgrund der Hypothese, dass die EV-Komponente von Thrombozytenkonzentraten für diese Effekte verantwortlich sein kann17 . Einige Studien im Zusammenhang mit Gelenkerkrankungen verwenden thrombozytenbasierte EVs (PL-EVs) zur Behandlung, um osteoarthritische Zustände zu verbessern. PL-EVs verbessern die Chondrozytenproliferation und Zellmigration, indem sie den Wnt/β-Catenin-Signalweg18aktivieren, die Expression chondogener Marker in osteoarthritischen Chondrozytenfördern 19oder höhere Konzentrationen chondogener Proteine und weniger tissuläre Anomalien bei osteoarthritischen Kaninchen zeigen, die mit PL-EVs behandelt wurden18.
EVs enthalten Proteine, Lipide und Nukleinsäuren, die an die Zielzelle abgegeben werden, wodurch eine Zell-zu-Zell-Kommunikation hergestellt wird, die das Hauptmerkmal im Zusammenhang mit ihren therapeutischen Anwendungen ist20. Die Auswirkungen von Elektrofahrzeugen hängen von ihren erreichenden Zellen und der anschließenden Freisetzung von Fracht ab. Dieser Effekt kann indirekt durch Veränderungen in Zellen bestätigt werden, wie z.B. Stoffwechselaktivität oder Genexpressionsmodifikation. Diese Methoden erlauben jedoch nicht die Visualisierung, wie EVs Zellen erreichen, um ihre Funktion auszuüben. Daher stellt dieses Papier eine Methode zur Kennzeichnung dieser PL-abgeleiteten EVs vor, die zur Behandlung von entzündungsbedingten OA-Knorpel-Explantaten eingesetzt werden sollen. Die konfokale Mikroskopie wurde verwendet, um die EV-Aufnahme und das Fortschreiten zu den in den Explantaten vorhandenen Chondrozyten in einem Zeitraffer von 5 h zu überwachen.

<table><tbody><tr><td>Material</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL Zentrifugenröhrchen</td><td>SPL life sciences</td><td>PLC60015</td><td></td></tr><tr><td>1 mL Spritze BD Plastipak</td><td>BD</td><td>303174</td><td></td></tr><tr><td>2-Propanol (Isopropanol)</td><td>Panreac AppliChem</td><td>1.310.901.211</td><td>Hergestellt zu 20 % mit Milli-Q Wasser</td></tr><tr><td>96-Well-Kulturplatte</td><td>SPL life sciences</td><td></td><td></td>PLC30096</tr><tr><td>Absolutes Ethanol Pharmpur</td><td>Scharlab</td><td>ET0006005P</td><td>Wird zur Herstellung von 96% und 75% Ethanol mit Milli-Q Wasser</td></tr><tr><td>verwendet Biopsies Stanze mit Kolben 3 mm</td><td>Scandidact</td><td>MTP-33-32</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserum &nbsp; Albumin (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030</td><td>Hergestellt zu 5% mit PBS</td></tr><tr><td>Knorpelexplantat</td><td>IdISBa Biobank</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Konzentrationsröhrchen 15 mL Nanosep 100 kD Omega</td><td>Pall</td><td>MCP100C41</td><td></td></tr><tr><td>Konzentrationsröhrchen 500 & Mikro; L Nanosep 100 kD Omega</td><td>Pall</td><td>OD003C33</td><td></td></tr><tr><td>Deckglas 24 x 60 mm</td><td>Deltalab</td><td>D102460</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-F12 -GlutaMAX medium</td><td>Biowest</td><td>L0092</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's PBS (1x)</td><td>Capricorn Scientific</td><td>PBS-1A</td><td></td></tr><tr><td>Eingebettete Paraffin-Gewebeblöcke</td><td>IdISBa Biobank</td><td></td><td>Servicegebühr</td></tr><tr><td>Exo-spin mini-HD Säulen</td><td>Zellführungssysteme</td><td>EX05</td><td></td></tr><tr><td>Feather S35 Mikrotom-Klinge</td><td>Feather</td><td>43037</td><td></td></tr><tr><td>Filtropur S 0.2 &micro; m</td><td>Spritzenfilter Sarstedt</td><td>83.1826.001</td><td></td></tr><tr><td>Fluoroshield mit DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F-6057</td><td></td></tr><tr><td>Oncostatin M Human</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O9635-10UG</td><td>Bereiten Sie eine Stammlösung bis zu einer Endkonzentration von 0,1 & Mikro vor; g/&micro; L verdünnt in PBS-0,1 % BSA-Paraformaldehyd</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>8.18715.1000</td><td>Hergestellt zu 4 % mit PBS und gelagert bei 4 & deg; C</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin-Lösung 100x</td><td>Biowest</td><td>L0022</td><td></td></tr><tr><td>PKH26 Rot fluoreszierendes Cell Linker Kit für die allgemeine Zellmembranmarkierung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MINI26</td><td>PKH26 und Dliuent C enthalten</td></tr><tr><td>Natriumcitrat-Dihydrat</td><td>Scharlab</td><td>SO019911000</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus Objektträger</td><td>Thermo Scientific</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>TNF&alpha;</td><td>Forschung & Forschung D systems</td><td>210-TA-005</td><td>Bereiten Sie eine Stammlösung bis zu einer Endkonzentration von 0,01 & Mikro vor; g/&micro; L verdünnt in PBS-0,1 % BSA</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Wird zur Herstellung einer 0,1 %igen Triton-0,1 %igen Natriumcitratlösung mit Milli-Q Wasser</td></tr><tr><td>Xylol</td><td>verwendet Scharlab</td><td>XI0050005P</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5430 R</td><td>Eppendorf</td><td>5428000210</td><td>F-45-48-11 Rotor</td></tr><tr><td>NanoSight NS300</td><td>Malvern</td><td>NS300</td><td>Baustein mit eingebettetem Laser bei &lambda;= 532 nm und Kamera sCMOS</td></tr><tr><td>Shandon Finesse 325 Handbuch Mikrotom</td><td>Thermo Scientific&trade;</td><td></td><td></td>A78100101</tr><tr><td>Konfokalmikroskop TCS-SPE</td><td>Leica Microsystems</td><td>5200000271</td><td></td></tr></tbody></table>

markierung extrazellulärer vesikel zur Überwachung der migration und aufnahme in knorpelexplantaten

Labeling of Extracellular Vesicles for Monitoring Migration and Uptake in Cartilage Explants

Extrazelluläre Vesikel (EVs) werden in verschiedenen Studien verwendet, um ihr Potenzial als zellfreie Behandlung aufgrund ihrer Ladung aus ihrer zellulären Quelle, wie z.B. Thrombozytenlysat (PL), nachzuweisen. Wenn sie als Behandlung verwendet werden, wird erwartet, dass EVs in die Zielzellen eindringen und eine Reaktion von diesen bewirken. In dieser Forschung wurden PL-abgeleitete EVs als zellfreie Behandlung von Osteoarthritis (OA) untersucht. So wurde eine Methode entwickelt, um EVs zu kennzeichnen und ihre Aufnahme an Knorpelexplantaten zu testen. PL-abgeleitete EVs werden mit dem lipophilen Farbstoff PKH26 markiert, zweimal durch eine Säule gewaschen und dann in einem in vitro entzündungsgetriebenen OA-Modell für 5 h nach Partikelquantifizierung durch Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA) getestet. Stündlich werden Knorpelexplantate fixiert, paraffiniert, in 6-μm-Abschnitte geschnitten, um sie auf Objektträgern zu montieren, und unter einem konfokalen Mikroskop beobachtet. Dies ermöglicht die Überprüfung, ob EVs während dieser Zeit in die Zielzellen (Chondrozyten) gelangen und ihre direkte Wirkung zu analysieren.

Eine schematische Übersicht für die EV-Kennzeichnung und die Überwachung der Aufnahme ist in Abbildung 1 dargestellt. Die von NTA in Tabelle 1 detektierte Partikelkonzentration und EV-Größe zeigen, dass die EV-Konzentration während des Prozesses aufgrund des nach der Markierung mit der Säule zweimal durchgeführten Reinigungsschritts abnimmt. Die erhaltene Menge liegt jedoch im optimalen Bereich der Anzahl der für die Behandlung zu verwendenden Partikel. Diese Partikelkonzent...

Hier stellen wir ein Protokoll zur Kennzeichnung von extrazellulären Vesikeln aus Thrombozytenlysat vor, um ihre Migration und Aufnahme in Knorpelexplantaten zu überwachen, die als Modell für Osteoarthritis verwendet werden.

Markierung extrazellulärer Vesikel zur Überwachung der Migration und Aufnahme in Knorpelexplantaten

Extracellular vesicles (EVs) are used in different studies to prove their potential as a cell-free treatment due to their cargo derived from their ...

Dieses einfache Protokoll ermöglicht es, EVs zu kennzeichnen und sie mittels konfokaler Mikroskopie zu überwachen. Zum Beispiel könnte die EV-Bildgebung bei der Bewertung der EV-Verteilung helfen, wenn sie in Therapeutika verwendet wird. Diese Technik ermöglicht es, die EV-Migration und -Aufnahme in Knorpelexplantaten einfach und mit konfokaler Mikroskopie ohne besondere Funktion zu überwachen.Das gleiche Protokoll kann für EVs für In-vitro- oder In-vivo-Experimente verwendet werden. Stellen Sie sicher, dass die Säulen vorher vorbereitet werden und dass das Anfangsvolumen der EVs ausreicht, um die gewünschte endgültige Partikelkonzentration zu erreichen, da während des Reinigungsschritts etwa 10% der Partikel verloren gehen. Beginnen Sie mit der Konzentration des extrazellulären Vesikels oder EV, der Probe und der Kontrolle.Legen Sie die Proben in ein 15-Milliliter- oder 500-Mikroliter-Konzentrationsröhrchen, abhängig vom Startvolumen der EV-Probe. Zentrifugieren Sie die Röhrchen nach den Anweisungen des Herstellers, bis eine fast trockene Probe erhalten ist. Suspendieren Sie die konzentrierten EV-Proben mit 200 Mikrolitern und die Kontrollgruppe mit 100 Mikrolitern Verdünnungsmittel C erneut und übertragen Sie sie in neue 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.Trennen Sie die EV-Probe in zwei Aliquots zu je 100 Mikrolitern. Markieren Sie eines der Aliquots mit Farbstoff und verwenden Sie es als Behandlung. Lassen Sie die andere unmarkiert, aber verarbeiten Sie sie wie die EV-Probe und verwenden Sie sie, um die EV-Konzentration durch Nanopartikel-Tracking-Analyse zu quantifizieren.2x Farbstofflösung so herstellen, dass die resultierende Konzentration der PKH26-Lösung im Verdünnungsmittel C acht Mikromolar beträgt. Mischen Sie einen Mikroliter PKH26-Linker mit einem Millimol pro 125 Mikroliter Verdünnungsmittel C in der Probe. Bereiten Sie das Volumen vor, das erforderlich ist, um die Proben im Verhältnis 1:1 hinzuzufügen.Fügen Sie 2x Farbstofflösung zu PKH-Thrombozytenlysat-abgeleiteten EVs hinzu und kontrollieren Sie Proben im Verhältnis 1: 1, um 1x Farbstoffkonzentration und vier mikromolarE PKH26-Konzentration zu erreichen. Fügen Sie der NTA-Thrombozyten-Lysat-abgeleiteten EV-Probe das gleiche Volumen PBS hinzu. Fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.Geben Sie 5% Rinderserumalbumin-PBS-Lösung im Verhältnis 1:1 zu den Proben und stellen Sie sicher, dass das Endvolumen etwa 400 Mikroliter beträgt. Trennen Sie die markierten EVs von den ungebundenen Farbstoff- und unspezifischen Farbstoffinteraktionen mit der Säule. Entfernen Sie die Kappe von der Säule, fügen Sie 400 Mikroliter PKH-Thrombozytenlysat-abgeleitete EVs, NTA-Thrombozyten-Lysat-abgeleitete EVs hinzu oder kontrollieren und verwerfen Sie alle eluierten Flüssigkeiten.Warten Sie, bis das Beispiel vollständig in die Spalte gelangt ist, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren. Fügen Sie 600 Mikroliter PBS hinzu und entsorgen Sie die gesamte eluierte Flüssigkeit. Warten Sie, bis der PBS die Spalte vollständig aufgerufen hat, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren.Fügen Sie 600 Mikroliter PBS hinzu und sammeln Sie einen Bruchteil von 600 Mikrolitern in einem 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Wiederholen Sie für eine neue Spalte die Schritte zur Konzentration der Proben, die zu Beginn des Protokolls erwähnt werden. Fügen Sie der Spalte 600 Mikroliter zuvor eluierter EVs hinzu und verwerfen Sie das eluierte Volumen.Fügen Sie dann 400 Mikroliter PBS hinzu und verwerfen Sie alle eluierten Volumina. Fügen Sie 600 Mikroliter PBS in die Säule hinzu und sammeln Sie einen Bruchteil von 600 Mikrolitern in einem 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Waschen Sie den Knorpel zweimal mit PBS und schneiden Sie ihn mit einem Biopsiestempel mit einem Durchmesser von drei Millimetern unter sterilen Bedingungen aus.Legen Sie die Explantate in 96-Well-Kulturplatten mit DMEM-F12-Medium, ergänzt mit 1% Penicillin Streptomycin bei 37 Grad Celsius, 5% CO2 und 80% Luftfeuchtigkeit. Um ein entzündungsgetriebenes OA-Modell zu etablieren, ergänzen Sie das Zellkulturmedium mit 10 Nanogramm pro Milliliter Oncostatin M und zwei Nanogramm pro Milliliter Tumornekrosefaktor-alpha. Behandeln Sie die Explantate mit 1 mal 10 bis 9. Partikeln pro Vertiefung von PKH-Thrombozyten-Lysat-abgeleiteten EVs oder Kontrolle in Zellkulturmedium, ergänzt mit Oncostatin M und Tumornekrosefaktor-alpha.Entfernen Sie das Medium von den 96-Well-Zellkulturplatten, die Knorpel-Explantate enthalten. Fügen Sie jedem Bohrloch 200 Mikroliter des Zellkulturmediums hinzu, wie im Manuskript beschrieben. Stoppen Sie den In-vitro-Test stündlich von null bis fünf Stunden.Waschen Sie die Zellkulturtöpfe, die die Knorpelexplantate enthalten, zweimal mit 200 Mikrolitern PBS. Fügen Sie dem Gewebe 100 Mikroliter 4% Paraformaldehyd hinzu, um es drei Stunden lang bei vier Grad Celsius zu fixieren. Entfernen Sie die PFA, fügen Sie 100 Mikroliter PBS hinzu, lagern Sie das fixierte Gewebe bei vier Grad Celsius und verarbeiten Sie die Proben innerhalb von 48 Stunden.Bilder, die zu verschiedenen Zeitpunkten aufgenommen wurden, zeigen, wie EVs in das Gewebe eindringen, bis sie die Chondrozyten erreichen und im Laufe der Zeit in die Chondrozyten gelangen. Die markierten EVs waren bereits nach einer Stunde Inkubation um Chondrozyten lokalisiert. Stellen Sie sicher, dass das Anfangsvolumen der EVs ausreicht, um die gewünschte endgültige Partikelkonzentration zu erreichen.Eine weitere wichtige Sache, an die Sie sich erinnern sollten, ist, die gekennzeichneten EVs innerhalb der nächsten 24 Stunden zu verwenden. Wenn Sie es nicht innerhalb von 24 Stunden verwenden, kann eine Abnahme der Fluoreszenz auftreten. Diese Technik wird Forschern helfen, die EV-Bildgebung zu verbessern und EVs in Biologie und Therapeutik zu untersuchen.

labeling-extracellular-vesicles-for-monitoring-migration-uptake

Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Ziel der Präsentation ist es, eine hohe Reproduzierbarkeit der Methode zur Matrix verbunden Stammzellen Implantate in Knorpeldefekte, die visualisiert werden MR-Bildgebung erzeugen kann demonstrieren. Stammzellen sind mit von der FDA zugelassene Ferumoxides mit Agarose, implantiert in Knorpeldefekte und abgebildet mit einem 7T MR-Scanner bezeichnet.

Die Implantation von Ferumoxides Labeled humanen mesenchymalen Stammzellen in Knorpeldefekte

In diesem Video demonstrieren wir einen Assay zur Visualisierung und Quantifizierung der zellulären Aufnahme von extrazellulären Vesikeln oder EVs. Dieser Assay nutzt 3D-Fluoreszenzbildgebung mit einem konfokalen Mikroskop und ermöglicht die Unterscheidung von internalisierten EVs von solchen, die an der Zelloberfläche haften.

Extrazellulärer Vesikelaufnahme-Assay: Eine Methode zur Visualisierung und Quantifizierung der zellulären Aufnahme von extrazellulären Vesikeln mit Hilfe der 3D-Fluoreszenzbildgebungstechnik

Dieses Protokoll beschreibt eine effiziente Möglichkeit zur Überwachung der Zelle Persistenz und Bioverteilung des menschlichen Fettgewebe mesenchymalen Stammzellen (HaMSCs) durch dunkelrote Fluoreszenz Kennzeichnung in einem Rattenmodell Knie Arthrose (KOA) durch intraartikuläre Injektion (IA).

In Vivo Tracking der menschlichen Fettgewebe mesenchymalen Stammzellen in einem Rattenmodell Knie Arthrose mit fluoreszierenden lipophile Membran Farbstoff

In diesem Protokoll beschreiben wir den kompletten Workflow für die schnelle Isolierung von extrazellulären Vesikeln aus menschlichen Vollblut und Charakterisierung spezifischer Marker durch Fluoreszenz-basierte Nanopartikel-Tracking-Analyse. Die vorgestellten Ergebnisse zeigen ein hohes Maß an Reproduzierbarkeit und Zelle Kultur Überstände angepasst werden können.

Rasche Fluoreszenz basierende Charakterisierung der einzelnen extrazelluläre Vesikel im menschlichen Blut mit Nanopartikel-Tracking Analyse

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Herstellung einer großen Anzahl von GMP-konformen Exosomen aus mesenchymalen Stammzellen der Synovialflüssigkeit unter Verwendung eines 3D-Bioreaktors.

Großtechnische Herstellung von Exosomen aus der Synovialflüssigkeit mesenchymaler Stammzellen durch 3D-Bioreaktorkultur

Wir beschreiben ein Protokoll, um aus Makrophagen gewonnene kleine extrazelluläre Vesikel mit PKH-Farbstoffen zu kennzeichnen und ihre Aufnahme in vitro und im Rückenmark nach intrathekaler Entbindung zu beobachten.

Aufnahme fluoreszierender markierter kleiner extrazellulärer Vesikel in vitro und im Rückenmark

Extrazelluläre Vesikel (EVs) tragen zur Zellbiologie und interzellulären Kommunikation bei. Es besteht ein Bedarf an praktischen Assays, um die Aufnahme von Elektrofahrzeugen durch die Zellen zu visualisieren und zu quantifizieren. Das aktuelle Protokoll schlägt den EV-Aufnahmeassay vor, indem eine dreidimensionale Fluoreszenzbildgebung mittels konfokaler Mikroskopie verwendet wird, nachdem die EV-Isolierung durch ein mikrofluidisches Gerät auf Nanofiltrationsbasis erfolgt.

Extrazellulärer Vesikelaufnahme-Assay mittels konfokaler Mikroskop-Bildgebungsanalyse

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Methode zur Extraktion extrazellulärer Vesikel aus dem peripheren Blut und festem Gewebe mit anschließender Profilierung von Oberflächenantigenen und Proteinladungen.

Isolierung und Analyse von nachweisbaren und funktionalisierten extrazellulären Vesikeln aus dem Plasma und festen Geweben

Das vorliegende Protokoll beschreibt die differentielle Zentrifugation zur Isolierung und Charakterisierung repräsentativer EVs (Exosomen und Mikrovesikel) aus kultivierten humanen MSCs. Weitere Anwendungen dieser Elektrofahrzeuge werden ebenfalls in diesem Artikel erläutert.

Isolierung, Charakterisierung und therapeutische Anwendung extrazellulärer Vesikel aus kultivierten humanen mesenchymalen Stammzellen

Dieses Protokoll bietet eine detaillierte Beschreibung der Sortierung extrazellulärer Vesikel (EVs), die von mesenchymalen Stromazellen freigesetzt werden. Dabei geht es insbesondere um die Geräteeinstellung und die Optimierung der Sortierbedingungen. Ziel ist es, extrazelluläre Vesikel zu sortieren und dabei ihre Eigenschaften zu erhalten.

Festlegen einer erfolgreichen Sortierung für die Isolierung extrazellulärer Vesikel

Erfahren Sie, wie Sie extrazelluläre Vesikel markieren und deren Migration sowie Aufnahme in Knorpelexplantaten mit konfokaler Mikroskopie überwachen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von EV-Verteilung in therapeutischen Kontexten.

Markierung extrazellulärer Vesikel zur Überwachung der Migration und Aufnahme in Knorpelexplantaten

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