Simultane Hellfeld-, Fluoreszenz- und optische Kohärenztomographische Bildgebung kontrahierender Herztrabekel Ex Vivo

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Integration von drei bildgebungstechnischen Systemen in einem einzigen Gerät zu demonstrieren, was eine gleichzeitige Messung der mechanischen Funktion, der Ionendynamik und der geometrischen Veränderung des kontraktionierenden Herzgewebes ermöglicht. Insbesondere messen wir die Kraftproduktion des Gewebes, Kalziumtransienten, lokale Verschiebungen und Formveränderungen. Die Kombination dieser Bildgebungsmodalitäten kann helfen, Schlüsselfragen bei Herzerkrankungen zu beantworten, mit großen Auswirkungen auf die Entwicklung wirksamer Behandlungsstrategien.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie es uns ermöglicht, die Heterogenität der Muskelaktivität zu untersuchen. Das in diesem Protokoll verwendete Gerät enthält drei Bildgebungssysteme, die in der Lage sind, dieselbe Probe abbilden, ein Hellfeldmikroskop, ein Fluoreszenzmikroskop und einen optischen Kohärenztomographen. Eine Reihe von dichroitischen Spiegeln wird verwendet, um die Fluoreszenzemission und das Hellfeldtransmissionsbild zu trennen.

Grundlegende Merkmale dieses Gerätes sind zwei unabhängig voneinander betätigte Montagehaken, eine Messkammer mit drei optisch klaren Achsen und eine externe Triggerleitung, die die Hellfeld- und OCT-Kameras mit einem Stimulator synchronisiert. In diesem Video zeigen wir, wie man Herztrabekela isoliert, vorbereitet und abbilden kann und präsentieren einige repräsentative Ergebnisse. Nachdem Sie ein Herz von einer betäubten Ratte entfernt haben, übertragen Sie es in die Sezierkammer.

Ziehen Sie die Aorta mit zwei gekrümmten Zzetten über die Perfusionskanüle. Halten Sie die Aorta mit einer Zinnen an Ort und Stelle. Öffnen Sie in der Zwischenzeit die Schlauchlinie, damit die Sezierlösung durch die Perfusionskanüle fließen kann.

Sobald das koronare Gefäßsystem von Blut befreit ist und das Herz vollständig mit Dissektionslösung durchblutet ist, sichern Sie die Aorta mit einer Naht an Ort und Stelle. Positionieren Sie das Herz, indem Sie die Kanüle so drehen, dass die linke Koronararterie auf der oberen Oberfläche sichtbar ist. Stecken Sie die Spitze des Herzens an den Boden der Sezierkammer.

Schneiden Sie beide Atrien ab. Schneiden Sie entlang der rechten Seite des Septums bis zur Spitze des Herzens. Stecken Sie den geöffneten linken Ventrikel an die Basis der Sezierkammer.

Schneiden Sie dann entlang der linken Seite des Septums, öffnen Sie den rechten Ventrikel und stecken Sie ihn auch an die Basis der Sezierkammer. Identifizieren Sie eine frei laufende Trabecula im rechten Ventrikel. Schneiden Sie mit der Federschere und einer Zwiege das Wandgewebe, das die Trabecula umgibt.

Dann schneiden Sie das Wandgewebe in zwei Hälften, orthogonal zur Richtung der Trabecula. Schneiden Sie das Wandgewebe so lange ab, bis seine Abmessung für die verwendete Montagekonfiguration geeignet ist. Lassen Sie die herausgeschnittene Trabecula in der Sezierkammer.

Spülen Sie heißes Wasser, destilliertes Wasser und dann superfusaten Sie die Lösung durch die Messkammer. Schalten Sie die Lichtquelle des Hellfeldmikroskops ein und drücken Sie F1, um die Aufnahme zu aktivieren. Passen Sie den nachgeschalteten Haken manuell an, bis er im Hellfeldbild zentriert ist.

Klicken Sie auf Null nachgeschaltete Achse und dann auf nachgeschaltete Deaktivierung, um den Motor zu aktivieren. Bewegen Sie den nachgeschalteten Sollwertschieberegler, bis das Ende des Hooks mit dem Rand des interessierenden Standardbereichs ausgerichtet ist. Setzen Sie die nachgeschaltete Achse wieder auf Null, und bewegen Sie dann den Schieberegler für den nachgeschalteten Sollwert auf 1.000.

Wiederholen Sie den Vorgang mit dem Upstream-Hook, bewegen Sie jedoch nicht den Upstream-Sollwert-Schieberegler, nachdem Sie die Upstream-Achse erneut auf Null gesetzt haben. Klicken Sie auf Zum Einbinden verschieben. Starten Sie das Fluoreszenzbeleuchtungssystem, indem Sie den Lampenschalter umschalten, bevor Sie die Controller-Subsysteme schnell einschalten, indem Sie den Hauptschalter umschalten.

Schalten Sie den Betriebsmodus auf Turbo-Blanking um, indem Sie die Modustaste auf der Vorderseite drücken, gefolgt von zwei und dann einer. Drücken Sie die Online-Taste, um die externe Steuerung zu aktivieren. Superfusat-Strömung durch die Messkammer pausieren.

Füllen Sie die Montagekammer mit Dissektionslösung. Transportieren Sie die Trabecula mit einer Ein-Milliliter-Spritze von der Sezierkammer in die Montagekammer. Lassen Sie die Trabecula über die Schwerkraft in die Montagekammer absteigen.

Senken Sie den Flüssigkeitsstand in der Montagekammer, so dass er mit dem Mittelteil der Haken gleich ist. Stellen Sie den Abstand zwischen den Haken so ein, dass er die schlaffe Länge der Trabecula widerspiegelt, indem Sie den nachgeschalteten Sollwertschieberegler bewegen. Greifen Sie mit einem Mikroskop zur Unterstützung der Visualisierung leicht eines der Endgewebestücke mit einer Handzette und montieren Sie es auf dem vorgelagerten Haken.

Montieren Sie das andere Stück Endgewebe auf dem nachgeschalteten Haken. Nach der sicheren Montage bewegen Sie die Trabekela zurück in die Messkammer, indem Sie move to chamber drücken und den superfusate Fluss fortsetzen. Stellen Sie die Stimulusfrequenz auf eins, die Stimulusdauer auf 10 und die Stimulusspannung auf 10 ein.

Beginnen Sie die Stimulation, indem Sie den Stimulus aufdrücken. Schalten Sie das Hellfeldbeleuchtungssystem ein. Drücken Sie F1, und wählen Sie einen interessanten Bereich aus, der einen durchgestreiften Bereich der Benutzeroberfläche umschließt.

Klicken Sie auf Sarkomerlänge berechnen, um die durchschnittliche Sarkomerlänge im hervorgehobenen Bereich zu berechnen. Erhöhen Sie die Muskellänge, bis die durchschnittliche Sarkomerlänge etwa 2,32 Mikrometer beträgt. Bewegen Sie den Muskel, indem Sie den mittleren Sollwertschieberegler in der Mitte und auf der Trennsteuerungsregisterkarte so einstellen, dass der Rand des nachgeschalteten Hakens nur im Hellfeldbild sichtbar ist.

Sammeln Sie die Fluoreszenzinformationen für 10 Zuckungen. Erhöhen Sie den mittleren Sollwert um 200 und sammeln Sie weitere 10 Zuckungen an Fluoreszenzinformationen. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis das Hellfeldbild den Upstream-Hook enthält.

Sammeln Sie die Fluoreszenzinformationen des letzten Fensters. Bringen Sie die Trabecula an eine zentrale Position zurück, indem Sie den mittleren Sollwert auf Null setzen. Reduzieren Sie die Reizfrequenz auf 0,2 Hertz und wechseln Sie von der K-H-Superfusat- zur Fura-2-Ladelösung.

Messen Sie das Fluoreszenzsignal alle 10 Minuten. Visualisieren Sie das Signal auf der Registerkarte PMT-Signal. Nachdem sich das 360-Nanometer-Signal um den Faktor 10 erhöht hat, geben Sie die Reizfrequenz auf ein Hertz zurück und schalten Sie wieder auf die K-H-Superfusat-Lösung um.

Überprüfen Sie die Verhältnismessung alle 10 Minuten, bis sich das Signal stabilisiert, und an diesem Punkt kann die Datenerfassung beginnen. Stellen Sie den Muskel an die Position zurück, an der der Rand des nachgeschalteten Hakens nur im Hellfeldbild vorhanden ist. Erfassen Sie Fluoreszenzinformationen, indem Sie auf Fluoreszenzquelle aktivieren klicken.

Starten Sie das Streaming von Hardwaredaten. Stellen Sie auf der Benutzeroberfläche für die Hellfeldbildgebung den Aufnahmemodus auf externen Auslöser ein, erhöhen Sie die Bildrate auf 100 Hertz und legen Sie die Anzahl der aufzunehmenden Bilder auf 100 fest. Drücken Sie Str/Gedrückt-Taste-Umschalt-S, gefolgt von F1, um die Hellfeld-Bilddaten für dieses Fenster aufzuzeichnen.

Erhöhen Sie den mittleren Sollwert um 200 und wiederholen Sie den Hellfeldaufnahmevorgang. Fahren Sie mit dem Scanprotokoll fort, bis die Bilddaten für das letzte Fenster gesammelt wurden. Bringen Sie die Trabecula an eine zentrale Position zurück, indem Sie den mittleren Sollwert auf Null setzen.

Schalten Sie die OCT-Beleuchtungsquelle ein, indem Sie die Haupttaste drehen, den Netzschalter drücken und anschließend die SLDs-Taste drücken. Decken Sie den Galvanometerkopf ab und klicken Sie auf Hintergrund abrufen, um das Hintergrundinterferenzmuster zu messen und von der Messung zu subtrahieren. Stellen Sie den Bildaufnahmemodus auf Live-Ansicht ein.

Zentrieren Sie die Trabecula in den X- und Y-Achsen, indem Sie die X- und Y-Offsetwerte anpassen. Scannen Sie bei zentriertem Trabecula entlang der y-Achse, indem Sie die Y-Position anpassen, um die Positionen zu finden, die den vor- und nachgelagerten Haken entsprechen. Notieren Sie sich diese Positionen nach unten.

Setzen Sie den Bereich Y auf die absolute Differenz zwischen diesen Werten geteilt durch 10. Stellen Sie den Bildaufnahmemodus auf Stimulus ausgelöst ein, bereichen Sie X bis 100 und klicken Sie auf die Schaltfläche Aktive Parameter festlegen. Klicken Sie auf Daten streamen und dann erfassen.

Um die regionalen Kalzium- und Hellfeldinformationen über die gesamte Länge der hier vorgestellten Trabecula zu erfassen, wurden sieben Muskelpositionen benötigt. Diese Zahl der durchschnittlichen Kraft aus jeder der überlagerten Positionen deutet darauf hin, dass die Zuckungskraft von dieser Bewegung ungestört war, was zeigt, dass es keine Positionsabhängigkeit des Kraftakts gab. Diese Scans, die mittels optischer Kohärenztomographie mit einer Rate von 100 Hertz gesammelt wurden, wurden mit dem ImageJ-Plugin Weka segmentiert.

Jeder Querschnitt erscheint aufgrund der Differenz zwischen der seitlichen und tiefen Auflösung verzerrt. Dies wurde korrigiert, indem jede Achse unabhängig voneinander mit ihrer jeweiligen Auflösung skaliert wurde. Nach der Skalierung des rohen C-Scans der Trabecula ist der Muskel ungefähr zylindrisch.

Die Reflexion der Messkammerwand kann sich manchmal mit den Muskeldaten überschneiden, aber die Segmentierungssoftware kann darauf trainiert werden, dies zu berücksichtigen. Einmal segmentiert, kann die Querschnittsfläche entlang der Länge des Muskels während des gesamten Zuckens berechnet werden. Beachten Sie, dass diese spezielle Trabecula einen kleinen Zweig hat.

Die Bewegung des Astes ist ungefähr auf halbem Weg entlang der Trabecula offensichtlich. Schließlich können die segmentierten Bilder in Netze umgewandelt werden, um die Konstruktion geometrischer Modelle zu unterstützen. Bilddaten, die an jeder der sieben Positionen mit einer Rate von 100 Bildern pro Sekunde erfasst wurden, wurden zu einem einzigen vollständigen Bild der Trabecula zusammengefügt.

Das Verhältnis der ausgelassenen Fluoreszenz, die mit dem 340- und 380-Nanometer-Anregungslicht assoziiert ist, korreliert mit dem intrazellulären Kalzium, nachdem die Trabecula mit Fura-2 beladen wurde. Der Durchschnitt von 10 intrazellulären Kalziumtransienten aus jedem Fenster ist auf den Bereich ausgerichtet, in dem sie abgebildet wurden. Während der Höhepunkt der Transienten für diese Trabekela einigermaßen konsistent erscheint, reduzierte sich das diastolische Kalzium entlang seiner Länge.

In ähnlicher Weise weisen die Ergebnisse der Verschiebungsverfolgung und der Sarkomerlängenberechnungen auch auf das Vorhandensein regionaler Variabilität hin. Die verwendete markerlose Tracking-Technik ist in der Lage, die Verschiebung jedes Pixels zu berechnen. Die Eignung der Sarkomerlängenschätzungen wurde anhand der Breite und Amplitude der Gaußschen Anpassung an das FFT-Signal getestet.

Diese Bedingungen waren im Muskelbereich zwischen null und 500 Mikrometern nicht erfüllt, so dass dort keine Sarkomerlängeninformationen berechnet werden konnten. Angesichts der damit verbundenen Verschiebungen ist es wahrscheinlich, dass sich die Sarkomere in dieser Region während der kontraktilen Phase des Zuckens verlängert haben. Nachdem Sie sich dieses Video angeschaut haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Herztrabekeln isolieren und zuverlässig auf die multimodale Bildgebung vorbereiten können.

Dieser Prozess schafft einen Weg für die Sammlung eines Datensatzes, der für die Konstruktion physiologisch informierter Finite-Elemente-Modelle der Herzgewebekontraktion erforderlich ist.