Name: Simultane Hellfeld-, Fluoreszenz- und optische Kohärenztomographische Bildgebung kontrahierender Herztrabekel Ex Vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 54 s
Description: Lernen Sie die simultane Bildgebung kontrahierender Herztrabekel mit Hellfeld-, Fluoreszenz- und optischer Kohärenztomographie. Diese Methode erfasst mechanische Funktion, Calciumtransienten und geometrische Veränderungen.

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Diese Studie wurde finanziert durch Promotionsstipendien der University of Auckland (vergeben an JD und MC), Sir Charles Hercus Health Research Fellowships (20/011 und 21/116) des Health Research Council of New Zealand (verliehen an J-CH an KT), ein Promotionsstipendium der National Heart Foundation (verliehen an AA), Marsden Fast-Start Grants (UOA1504 und UOA1703) von der Royal Society of New Zealand (verliehen an J-CH und KT, bzw. ein James Cook Research Fellowship der Royal Society of New Zealand (verliehen an AT). Die ursprüngliche Entwicklung dieses Instruments wurde durch ein Marsden-Stipendium (11-UOA-199) der Royal Society of New Zealand (vergeben an AT und PN) finanziert.

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</ol>

Die Autoren haben nichts preiszugeben.

In dieser Studie stellen wir eine Konfiguration vor, die die Montage von drei optischen Systemen ermöglicht, die Hellfeld-, Fluoreszenz- und OCT-Bildgebung kombinieren, um Daten von einer aktiv kontrabinierenden Ex-vivo-Herztrabekula zu sammeln (Abbildung 1 und Abbildung 2). Eine solche orchestrierte Integration ist aufgrund der Auslegung der Messkammer (Abbildung 3) möglich, um die orthogonale Anordnung des OCT zur Hellfeld-Fluoreszenzachse zu ermöglichen. Das Muskelaufbausystem spielt eine ebenso wichtige Rolle für den Erfolg gleichzeitiger Quantifizierungen von Schlüsselindizes zur Charakterisierung der Herzmuskelerregungs-Kontraktionsdynamik. Seine Neuheit besteht darin, Muskelscan-Verfahren ohne offensichtliche Störung der mechanischen Leistung des Muskels zu ermöglichen (Abbildung 6). Mit der kombinierten Bildgebungskonfiguration und dem motorisierten Hakensystem zur Kraftmessung kann dieses System die regionale Heterogenität in der Ca2+ Transienten-, Verschiebungs- und Sarkomerlänge zusammen mit makroskopischen geometrischen Informationen einer kontrahierenden Trabekela während des gesamten Zeitverlaufs des Zuckens auswerten (Abbildungen 7 und Abbildung 8).
Angesichts der Allgegenwart von Hellfeld-Epifluoreszenz-Bildgebungssystemen in Herzforschungslabors kann die Reproduktion dieser Ergebnisse mit einigen geringfügigen Hardwareüberlegungen erreicht werden. Hier stellen wir das Bildverarbeitungs-Toolkit zur Kombination von Hellfeld-Epifluoreszenz und OCT vor, das für die Analyse der zugrunde liegenden kontraktilen Heterogenität unerlässlich ist. Die Integration des OCT erfordert einen ungehinderten optischen Pfad, während die Gated Imaging eine externe Triggerleitung zwischen dem Stimulus und sowohl der OCT- als auch der Hellfeldkamera sowie Muskelmontagehaken erfordert, die in der Lage sind, die Probe durch die Messkammer zu bewegen. Die benötigte Nachbearbeitungssoftware und -methoden sind frei verfügbar. Insbesondere die verwendete Segmentierungssoftware WEKA14ist Open-Source. Die Technik der markerlosen Verfolgung von Materialpunkten8,Sarkomerlänge, Gated Volumetric Imaging10und Mesh-Generierungscodes sind ebenfalls zugänglich und können auf Anfrage beim entsprechenden Autor zur Verfügung gestellt werden.
Muskellebensfähigkeit, optimale Belastung von Fura-2 und Bildfokus sind die drei Säulen, die die Grundlagen eines erfolgreichen Experiments bilden. Die Verwendung einer BDM-haltigen Dissektionslösung zur Verhinderung von Kontrakturen, der Transport des Muskels in einer Spritze, die kontinuierliche Sauerstoffversorgung der Lösung und die Vorbereitung neuer experimenteller Lösungen am Tag eines Experiments tragen zu einer hohen Muskellebensfähigkeitsrate bei. Vor dem Laden der Trabekela mit Fura-2AM muss die Autofluoreszenz für jede Bedingung, die man untersuchen möchte, gesammelt werden, da sie einen signifikanten Einfluss auf den gemessenen Ca2+ Transient15haben kann. Die Sauerstoffversorgung der Fura-2AM-Beladungslösung wird durch die notwendige Einbeziehung des Tensids pluronic-F127 zur Unterstützung der Farbstoffbeladung erschwert. Um die daraus resultierende überschüssige Blasenbildung zu bekämpfen, die durch dieses Tensid verursacht wird, ermöglicht ein kleiner Tropfen Antischaum in der Ladelösung dem Benutzer, die Sauerstoffversorgungsrate zu erhöhen, wodurch die Chance verbessert wird, dass die Trabekela während des gesamten Ladevorgangs funktionsfähig bleibt. Schließlich muss der Bildgebungsfokus entlang der Muskellänge gleichmäßig sein, um das Signal-Rausch-Verhältnis der Hellfeld- und Fluoreszenzinformationen zu maximieren.
Bei den hier vorgestellten Methoden sind zwei Einschränkungen zu beachten. Erstens die räumliche Auflösung des Fluoreszenzmikroskops. Während die räumlichen Auflösungen der OCT- und Hellfeldbildgebung hoch sind, beschränkt sich die Auflösung des Fluoreszenzmikroskops auf das Integral der Fluoreszenz aus dem Volumen, das innerhalb eines 540 μm x 540 μm großen Bildfensters erfasst wird. Es besteht die Möglichkeit, die räumliche Auflösung des Fluoreszenzmikroskops zu erhöhen, indem anstelle einer PMT eine ladungsgekoppelte Kamera mit hoher Verstärkung verwendet wird, um das Fluoreszenzsignal auf Kosten des Signal-Rausch-Verhältnisses16zu erfassen. Zweitens ist der Durchmesser der Trabecula, der in Bezug auf messbare Sarkomerlänge und geometrische Tiefe untersucht werden kann. Der windowed-FFT-Ansatz zur Berechnung der Sarkomerlänge nutzt den Vorteil einer verbesserten räumlichen Auflösung, ist jedoch mit einer geringeren Robustheit verbunden (Abbildung 8D). In Fällen, in denen trübe oder großflächige Trabekel untersucht werden sollen, wird die Auflösungsfähigkeit der FFT aufgrund des reduzierten Kontrasts, der mit der Sarkomeric-Banding in größeren Gewebeproben verbunden ist, stark reduziert. Ebenso sind innerhalb des OCT die Rückreflexionen aus einer Bildtiefe von mehr als 300 μm zu schwach, um während der Segmentierungsphase aufgelöst zu werden. Daher beschränkt sich unsere Technik auf Trabeculae mit einem Durchmesser von weniger als 300 μm. Es wird jedoch nicht empfohlen, Proben mit großem Durchmesser zu untersuchen, da es bei hohen Stimulationsraten zu Problemen mit der diffusiven Sauerstoffversorgung des Muskelkerns kommen kann17.
Unsere Methode ermöglicht die Beurteilung der mechanischen Funktion der Ionik in Verbindung mit der Muskelgeometrie in gesunden und kranken Muskeln und bietet einen leistungsstarken Ansatz zum Verständnis der Physiologie, Pathophysiologie und Pharmakologie des Herzmuskels. Die hier skizzierte Bildverarbeitungspipeline extrahiert Daten, die für ein tieferes Verständnis der kontraktilen Heterogenität von entscheidender Bedeutung sein werden. Eine Möglichkeit, das Potenzial eines so reichhaltigen Datensatzes voll auszuschöpfen, besteht in der Konstruktion mathematischer Modelle, die diese Daten integrieren und interpretieren, und in der Erstellung von Vorhersagen, die mit unserem Gerät experimentell getestet werden können.

Die Überfusion isolierter Herzmuskelgewebepräparate ist ein standardisiertes und weit verbreitetes Protokoll zur Untersuchung der kardialen Ionenaktivierung und-mechanik 1. Insbesondere die Isolierung von Trabekeln, stäbchenartigen Strukturen aus den ventrikulären Wänden, hat die Beurteilung von Phänomenen wie der längenabhängigen Aktivierung der Kontraktion2,der dehnungsabhängigen Reaktion der Kontraktion3,4und der diastolischen Viskoelastizität5 des Herzgewebes ermöglicht. Ter Keurs, der Initiator dieser Technik der Superfusing isolierter Trabeculae, verwendete zunächst eine Kombination aus Fluoreszenzbildgebung für Ca2+ Messungen und Laserbeugung zur Bestimmung der Sarkomerlängen2,5. Seit diesen frühen Studien ist es immer üblicher geworden, Sarkomerlängeninformationen mit einer größeren räumlichen Auflösung mit Hilfe von 2D-schnellen Fourier-Transformationstechniken (FFT)6 auf Hellfeldmikroskopiebildern zu extrahieren. Die beiden bildgebenden Systeme erlauben eine partielle Beurteilung des zugrunde liegenden Zusammenhangs zwischen Ca2+ Freisetzung und sarkomer längenabhängiger Kraftproduktion.
Der Herzmuskel ist quergestreift, wobei das sichtbare Band mit einer darunter liegenden Reihe von kontraktilen Einheiten verbunden ist, die aus dicken und dicken Filamenten bestehen. Die Wechselwirkung dieser konstituierenden Filamente, aus denen Sarkomere besteht, liegt der Krafterzeugung zugrunde, die wie folgt beginnt: Ein depolarisierendes elektrisches Signal oder Aktionspotential bewirkt, dass sich spannungsabhängige L-Typ-Ca2+-Kanäle in der Zellmembran öffnen; der anschließende zelluläre Zustrom vonCa2+ induziert die Freisetzung vonCa2+ aus dem sarkoplasmatischen Retikulum (SR), einem intrazellulärenCa2+-Speicher, in einem Prozess, der alsCa2+-induzierteCa2+-Freisetzung 7bekannt ist; dieser plötzliche Anstieg der intrazellulären Ca2+-Konzentration vom nanomolaren zum mikromolaren Bereich ermöglicht die Kraftproduktion; Ca2+ Pumpen extrudieren kontinuierlichCa2+ aus dem Zytosol zurück in das SR und extrazelluläre Kompartiment; Wenn die intrazelluläre Ca2+ -Konzentration in den nanomolaren Bereich zurückkehrt, hört die Kraftproduktion auf und der Muskel entspannt sich. Bei der Krafterzeugung gleiten die dicken und dünnen Filamente übereinander. Die Sarkomerlänge bestimmt das relative Ausmaß der Überlappung und damit das Potenzial zur Kraftproduktion des Muskels makroskopisch.
In diesem Artikel erweitern wir diese Fluoreszenz-Hellfeld-Bildgebungsverfahren um die optische Kohärenztomographie (OCT). OCT nutzt das physikalische Prinzip der Interferenz und ist in der Lage, die geometrische Verformung von Gewebe zu sammeln, um die kontraktile Heterogenität der Muskeln zu verstehen8. Unser Gerät (Abbildung 1) verwendet ein SD-OCT-System (Spectral Domain OCT). In SD-OCT teilt ein Strahlteiler das Licht einer breitbandigen Superlumineszenzdiode mit kurzer Kohärenzlänge in Referenz- und Messarme auf. Der Referenzarm enthält einen festen Spiegel und der Messarm ein 2D-Galvanometer zur Steuerung des Lichts. Das von der Probe zurückgestreute Licht wird gesammelt und stört das reflektierte Licht im Referenzarm, um ein Interferenzmuster zu bilden. Die Tiefeninformation wird in der Frequenz des Spektralrandes kodiert. Um die Informationen zu extrahieren, wird das Signal durch ein Spektrometer geleitet und eine inverse FFT wird auf das Ergebnis angewendet. Das entsprechende 1D-Signal stellt die Strukturen in verschiedenen Tiefen dar, entsprechend den Änderungen des Brechungsindex9 (A-Scan). Durch die Steuerung des Lasers in eine einzige Achse kann ein Querschnitt der interessierenden Probe konstruiert werden (B-Scan) und ebenso durch Wiederholung des Prozesses in einem schrittweisen Muster in der verbleibenden Achse kann ein dreidimensionales Bild erzeugt werden (C-Scan). Durch Erweiterung kann man eine Reihe von B-Scans an einem einzigen Slice für ein sich wiederholendes zeitvariables Motiv basierend auf einem externen Trigger sammeln und wiederholen, um einen dreidimensionalen Scan zu erzeugen, der ein zeitvariables planares Bilddarstellt 10.
Bei der Integration der drei bildgebenden Systeme haben wir die folgenden beiden Prinzipien berücksichtigt. Erstens sollten bildgebende Sensoren kein Licht von einer alternativen Bildgebungsmodalität erkennen, und zweitens sollte das physische Design freien Platz für mindestens drei gleichzeitige Bildgebungsebenen enthalten. Um die erste Anforderung zu erfüllen, verwendet das Hellfeldmikroskop eine LED mit einer Wellenlänge von 660 nm, um die Probe in einer invertierten Konfiguration zu beleuchten. Das Fluoreszenzmikroskop befindet sich in einer Epifluoreszenzkonfiguration, bei der die gleiche Objektivlinse sowohl für die Anregung als auch für die Sammlung des emittierten Lichts verwendet wird. Das Anregungslicht hat eine Wellenlänge zwischen 340 nm und 380 nm, und eine Photomultiplierröhre (PMT) misst das emittierte Licht bei einer Wellenlänge von 510 nm. Ein Paar dichroitischer Spiegel ermöglicht es diesen beiden optischen Pfaden, den gleichen physikalischen Fußabdruck zu teilen, ohne die entgegengesetzte Messung zu stören (Abbildung 2). Schließlich verwendet das OCT breitbandiges Licht (100 nm spektrale Breite) mit einer zentralen Wellenlänge von 840 nm, das sich von den beiden anderen Modalitäten unterscheidet. Aufgrund der geringen Kohärenz des für OCT verwendeten Lichts trägt gestreutes Licht von den Hellfeldfluoreszenzquellen nicht zu dem Interferenzmuster bei, das Tiefeninformationen kodiert. Für die zweite Anforderung verfügt das Gehäusedesign für das Kapillarrohr über zugängliche optische Wege zu den vorderen, unteren und oberen Ebenen der Probe. Während der Experimente halten zwei Platinhaken eine Trabecula in einem Kapillarrohr, das mit sauerstoffhaltiger Krebs-Henseleit (KH)-Lösung durchtränkt ist. Der Galvanometerkopf des OCT ist orthogonal auf den Hellfeld-Fluoreszenz-Bildgebungsweg ausgerichtet, um die Vorteile der dritten orthogonalen optischen Ebene zu nutzen (Abbildung 3).
In diesem Artikel werden die Entwurfsüberlegungen für den Bau eines Geräts beschrieben, das gleichzeitig Kalzium, Sarkomerlänge und Muskelgeometrie abbilden kann. Um diese Messmöglichkeiten zu demonstrieren, beschreiben wir den Prozess der Isolierung einer ventrikulären Trabekula, die Herstellung der notwendigen Pufferlösungen sowie die kritischen Schritte bei der Handhabung und Fluoreszenzbelastung einer Ex-vivo-Trabekela. Schließlich werden in diesem Dokument die Prozesse beschrieben, die erforderlich sind, um den Datensatz in nützlichere Visualisierungen zu übersetzen.

<table><tbody><tr><td>2,3-Butandion-Monoxim</td><td>Acros Organics</td><td>150375000</td><td></td></tr><tr><td>20-fach Mikroskopobjektiv</td><td>Nikon</td><td>CFI Super Fluor 20-fach</td><td>NA 0,75</td></tr><tr><td>2D-Galvanometer</td><td>Thorlabs</td><td>GVSM002/M</td><td></td></tr><tr><td>50-50 Strahlteiler</td><td>Thorlabs</td><td>FC850-40-50-APC</td><td></td></tr><tr><td>90-10 Strahlteiler</td><td>Thorlabs</td><td>TW850R2A2</td><td></td></tr><tr><td>Analoges Eingangsmodul</td><td>National Instruments</td><td>NI-9205</td><td>Zeichnet das PMT-Signal bei 200 kHz auf</td></tr><tr><td>Hellfeld-Lichtquelle</td><td>CoolLED</td><td>PE-2</td><td>660&nbsp; nm LAM</td></tr><tr><td>Breitband-Lichtquelle</td><td>Superlum</td><td>Broadlighter-840</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>Cameralink-Karte</td><td>National Instruments</td><td>NI-1429</td><td>Hellfeld-Framegrabber</td></tr><tr><td>Carbogen 5</td><td>BOC</td><td>Gascode: 181</td><td></td></tr><tr><td>Kondensatorobjektiv</td><td>Nikon</td><td>LWD 0,52</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Glukose</td><td>Merck</td><td>108337</td><td></td></tr><tr><td>Datenerfassung</td><td>National Instruments</td><td>NI-6259</td><td>Löst die Bewegung des Galvanometers</td></tr><tr><td>aus Dichroitischer Spiegel 1</td><td>Semrock</td><td>FF409-Di03</td><td></td></tr><tr><td>Dichroitischer Spiegel 2</td><td>Semrock</td><td>FF552-Di02</td><td></td></tr><tr><td>Beugungsgitter</td><td>Wasatch Photonics</td><td>1200 Linien/mm @840 nm</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>276855</td><td></td></tr><tr><td>Direct-Q 3 UV-System</td><td>Merck Millipore</td><td>ZRQSVR3WW</td><td>Destillationswassermaschine</td></tr><tr><td>Trockenbad</td><td>Corning</td><td>6875-SB</td><td>LSE digitales Trockenbad</td></tr><tr><td>FIJI</td><td>ImageJ</td><td></td><td>Open-Source-Bildverarbeitungssoftware</td></tr><tr><td>Fura-2AM Pentakaliumsalz</td><td>Thermofisher</td><td>F14186</td><td></td></tr><tr><td>Hardware FPGA-Karte</td><td>National Instruments</td><td>NI-7813R</td><td>Steuert auch die Triggerung des Hellfeldeinfangs</td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Pfizer</td><td>61024</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A1069</td><td></td></tr><tr><td>Inverses Mikroskop</td><td>Nikon</td><td>TI-DH Beleuchtungssäule</td><td></td></tr><tr><td>Isofluoran</td><td>MedSource</td><td>VAPDRUGISO250</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Zeilenkamera</td><td>Basler</td><td>spL2048-70km</td><td>Spektrometer-Kamera</td></tr><tr><td>Magnetrührer</td><td>IKA</td><td>3810000</td><td>RCT basic</td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks</td><td></td><td>Datenverarbeitungscode</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4.7H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1880</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71376</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4.2H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71505</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>OCT FPGA-Karte</td><td>National Instruments</td><td>NI-1483R</td><td></td></tr><tr><td>Sauerstofftank</td><td>BOC</td><td>Gascode: 100D</td><td></td></tr><tr><td>pH-Messgerät</td><td>Mettler Toledo</td><td>MP220</td><td></td></tr><tr><td>Photomultiplier-Röhre</td><td>Hamamatsu</td><td>H7422-20</td><td></td></tr><tr><td>Powerload</td><td>Thermofisher</td><td>P10020</td><td></td></tr><tr><td>Superlumineszenzdiode</td><td>Broadlighter</td><td>D-840</td><td></td></tr><tr><td>Transimpedanzverstärker</td><td>Custom</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris(hydroxymethyl)amino-methan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252859</td><td></td></tr><tr><td>Wistar rat</td><td>Vernon Jansen Einheit</td><td></td><td>8 &ndash; 10 Wochen</td></tr><tr><td>Xenon-Bogenlampe</td><td>Sutter Instrument</td><td>DG-4</td><td>Lambda DG-4</td></tr></tbody></table>

simultane hellfeld-, fluoreszenz- und optische kohärenztomographische bildgebung kontrahierender herztrabekel ex vivo

Simultaneous Brightfield, Fluorescence, and Optical Coherence Tomographic Imaging of Contracting Cardiac Trabeculae Ex Vivo

Im Herzmuskel aktivieren intrazelluläre Ca2+ Transienten kontraktile Myofilamente, was zu Kontraktion, makroskopischer Verkürzung und geometrischer Verformung führt. Unser Verständnis der inneren Beziehungen zwischen diesen Ereignissen war begrenzt, da wir weder in den Muskel "sehen" noch die räumlich-zeitliche Natur der Erregungs-Kontraktionsdynamik genau verfolgen können. Um diese Probleme zu lösen, haben wir ein Gerät konstruiert, das eine Reihe von Bildgebungsmodalitäten kombiniert. Insbesondere integriert es ein Hellfeldmikroskop zur Messung lokaler Veränderungen der Sarkomerlänge und der Gewebebelastung, ein Fluoreszenzmikroskop zur Visualisierung des Ca2+ Transienten und einen optischen Kohärenztomographen, um die geometrischen Veränderungen des Gewebes während des gesamten Zeitraums eines Herzzyklus zu erfassen. Wir stellen hier die Imaging-Infrastruktur und das zugehörige Datenerfassungs-Framework vor. Die Daten werden aus isolierten stäbchenartigen Gewebestrukturen gesammelt, die als Trabeculae carneae bekannt sind. In unserem Instrument hält ein Paar positionsgesteuerter Platinhaken jedes Ende einer Ex-vivo-Muskelprobe, während es kontinuierlich mit nährstoffreicher Kochsalzlösung überlagert wird. Die Haken stehen unter unabhängiger Kontrolle, was eine Echtzeitkontrolle der Muskellänge und -kraft ermöglicht. Die Längsübersetzung ermöglicht das stückweise Scannen der Probe und überwindet Einschränkungen, die mit der relativen Größe des Mikroskop-Bildgebungsfensters (540 μm mal 540 μm) und der Länge einer typischen Trabecula (>2000 μm) verbunden sind. Platinelektroden an beiden Enden der Muskelkammer stimulieren die Trabekel mit einer benutzerdefinierten Rate. Wir nutzen das Stimulationssignal als Auslöser für die Synchronisation der Daten aus jedem Bildgebungsfenster, um das gesamte Probenzucken unter stationären Bedingungen zu rekonstruieren. Die Anwendung von Bildverarbeitungstechniken auf diese Hellfeld-Bildgebungsdaten liefert Gewebeverschiebungs- und Sarkomerlängenkarten. Eine solche Sammlung von Daten wird, wenn sie in eine Experimentmodellierungspipeline integriert wird, ein tieferes Verständnis der kontraktilen Homogenität und Heterogenität der Muskeln in Physiologie und Pathophysiologie liefern.

Um die hier vorgestellten regionalen Ca2+ und Hellfeldinformationen über die gesamte Länge der Trabecula zu erfassen, waren sieben Muskelpositionen erforderlich. Abbildung 6 deutet darauf hin, dass die Zuckungskraft von dieser Bewegung ungestört war, was zeigt, dass es keine Positionsabhängigkeit der aktiven Kraftproduktion gab.
B-Scans, die mittels optischer Kohärenztomographie mit einer Rate von 100 Hz gesammelt wurden, wurden mit dem ImageJ-Plugin WEKA14 segmentiert (Abbildung 7A). Jeder Querschnitt erscheint aufgrund der Differenz zwischen der lateralen (10 μm) und tiefen (1,73 μm (in Myokard)) Auflösung verzerrt. Diese Verzerrung wurde korrigiert, indem die Tiefenachse des Bildes um das seitliche Auflösungs-Tiefen-Auflösungsverhältnis skaliert wurde. Abbildung 7B,C zeigt, dass nach der Skalierung des rohen C-Scans der Trabekela in der Geometrie annähernd zylindrisch ist. Die Reflexion der Messkammerwand kann sich manchmal mit den Muskeldaten überschneiden (Abbildung 7A, B), aber die Segmentierungssoftware kann darauf trainiert werden ( Abbildung7D, E). Einmal segmentiert, kann die Querschnittsfläche entlang der Länge des Muskels während des gesamten Zuckens berechnet werden (Abbildung 7F). Beachten Sie, dass diese spezielle Trabecula ein kleines Anhängsel hat, das sich von ihr verzweigt. Die Bewegung des Astes ist offensichtlich ~ 0,75 mm entlang der Trabecula. Schließlich können die segmentierten Bilder in Netze umgewandelt werden, um die Konstruktion geometrischer Modelle zu unterstützen (Abbildung 7G).
Bilddaten, die an jeder der verschiedenen Trabekula-Positionen mit einer Rate von 100 fps erfasst wurden, wurden zusammengefügt, um ein einziges vollständiges Bild der Trabecula zu erstellen (Abbildung 8A). Die Auflösung dieser Bilder beträgt 0,535 μm/Pixel. Die Verwendung linearer Gewichtungsfunktionen in den überlappenden Bereichen benachbarter Fenster unterstützt die Visualisierung und minimiert die Auswirkungen der in den Hellfeldbildern vorhandenen Vignette. Zur Messung des fluoreszierenden Signals wird ein 540 μm x 540 μm großes Fenster der Trabecula zyklisch mit 340 nm, 365 nm und 380 nm Wellenlängenlicht mit einer Wellenlänge von 600 Hz beleuchtet. Das Verhältnis der emittierten Fluoreszenz, die mit dem 340 nm und 380 nm Anregungslicht assoziiert ist, korreliert mit dem intrazellulären Kalzium, nachdem die Trabekela mit Fura-2 beladen wurde. Da es sich bei dieser Messung um ein Verhältnis handelt, beträgt die effektive Messrate 200 Hz. Die gemittelten (n = 10) intrazellulären Ca2+ Transienten aus jedem Fenster sind an dem Bereich ausgerichtet, in dem sie abgebildet wurden (Abbildung 8B). Während der Peak der Transienten einigermaßen konsistent erscheint, ist der diastolische [Ca2+] im Bereich zwischen 900 μm und 1800 μm entlang der Trabecula niedriger. In ähnlicher Weise weisen auch die Ergebnisse der Berechnungen zur Verschiebungsverfolgung (Abbildung 8C) und zur Sarkomerlänge (Abbildung 8D) auf das Vorhandensein regionaler Variabilität hin. Die verwendete markerlose Tracking-Technik ist in der Lage, die Verschiebung jedes Pixels bei ausreichendem Kontrast zu verarbeiten. Bei der Abbildung der Verteilung von Sarkomerlängen in post wurde eine Kreuzkorrelationsfläche von 128 Pixeln x 128 Pixeln (~67 μm x 67 μm) verwendet, um die regionale Sarkomerlänge zu berechnen. Dieser Bereich umkapselt ungefähr 29 Sarkomere, wenn die Probe nahe an der optimalen Sarkomerlänge liegt. Die Schrittgröße (sowohl in x- als auch in y-Richtung)zwischen dem Mittelpunkt jedes Kreuzkorrelationsfensters wurde für die Verarbeitung dieser Daten auf 50 Pixel (~26 μm) eingestellt. Die Eignung von Sarkomerlängenschätzungen wurde anhand der Breite und Amplitude der Gaußschen Anpassung an das FFT-Signal getestet. Diese Bedingungen waren im Muskelbereich zwischen 0 μm und 500 μm nicht erfüllt, so dass dort keine Sarkomerlängeninformationen berechnet werden konnten. Angesichts der damit verbundenen Verschiebungen ist es wahrscheinlich, dass sich die Sarkomere in dieser Region während der kontraktilen Phase verlängert haben. Im Einklang mit dieser Spekulation verkürzen sich die durchschnittlichen Sarkomerlängen auf der rechten Seite der Trabecula in diesem Zeitraum. Durch die Kombination der von jedem der Panels bereitgestellten Informationen scheint es, dass die Region mit der größten Querschnittsfläche nicht die bedeutendste Kraft erzeugt. Unter der Annahme, dass die regionale Variation von Ca2+ Transienten einen annähernd glatten Gradienten aufweist, zeigt Abbildung 8B, dass die größte Amplitude Ca2+ Transiente irgendwo zwischen 1300 μm und 1600 μm entlang der Trabecula auftritt. Die Verschiebungskarte zeigt an, dass der Bereich, der die geringste Bewegung durchläuft, gut mit dem Peak Ca2+ Transienten übereinstimmt. Dieser Bereich hat jedoch die kleinsten Querschnittsflächen der Stichprobe. Mit diesen Daten im Hinterkopf könnte man daraus schließen, dass diese Region den größten Stress erzeugte.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62799/62799fig01.jpg"> Abbildung 1: Kommentiertes Bild des Kardiomyometers. Jede der wichtigsten optischen Komponenten wird skizziert. Der Einschub enthält eine Nahaufnahme des Mikroskopobjektivs in situ, unterhalb der Messkammer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62799/62799fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62799/62799fig02.jpg"> Abbildung 2: Optischer Weg für die gleichzeitige Hellfeld- und Fluoreszenzmikroskopie. Die Beleuchtungsquelle für das Fluoreszenzmikroskop ist eine Xenon-Bogenlampe, deren Ausgang zyklisch zwischen 340 nm, 365 nm und 380 nm Licht umschaltet. Der Ausgangspfad der Bogenlampe enthält einen dichroitischen Spiegel mit einer Cut-off-Wellenlänge von 409 nm, der das UV-Licht auf einen Spiegel reflektiert, der das Licht in ein Fluoreszenzmikroskopobjektiv lenkt. Die Linse fokussiert das Anregungslicht auf die Probe und sammelt das emittierte Licht, das eine längere Wellenlänge von 510 nm hat. Dieses emittierte Licht durchläuft den ersten dichroitischen Spiegel, aber nicht den zweiten, da es eine Cut-off-Wellenlänge von 552 nm hat. Eine Feldlinse fokussiert dann das reflektierte Licht auf den Sensor des PMT. Währenddessen befindet sich die Beleuchtungsquelle (660 nm LED) für das Hellfeldmikroskop über der Probe. Das durchgelassene Licht wird durch eine Kondensatorlinse auf die Probe fokussiert, und das 20×Fluoreszenzobjektiv erfasst das resultierende Transmissionsbild. Die Wellenlänge, die für die Hellfeldbeleuchtung verwendet wird, überschreitet die Cut-off-Wellenlänge jedes dichroitischen Spiegels, so dass sie beide durchläuft, bevor das Bild auf den Sensor einer CMOS-Kamera fokussiert wird. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62799/62799fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62799/62799fig03.jpg"> Abbildung 3: Auslegung des Messkammerhalters. (A) Isometrische Ansicht des Messkammerhalters mit überlagerten optischen Pfaden. Hellfeldbeleuchtung erfolgt von derübergeordneten Oberfläche (z-Achse); Die Fluoreszenzbeleuchtung erfolgt vonder unteren Oberfläche (z-Achse), und das OCT-Signal des Messarms ist orthogonal zur anderen Beleuchtungsachse(y-Achse). Während des Experiments halten zwei Platinhaken eine Trabecula in einem Glaskapillarrohr, das als Messkammer fungiert. Schwingspulenmotoren steuern jeden Haken und ihre Positionen werden mittels Laserinterferometrie gemessen. Die aktuelle Position wird mit einem benutzerdefinierten Sollwert verglichen und mit einem PID-Regler, der in einem FPGA kodiert ist, wird der Fehler minimiert. (B) Messkammer in situ bei eingeschalteter Hellfeldbeleuchtung. Die Rückansicht ist im Einschub von Abbildung 1 dargestellt. (C) Schematische Darstellung des Superfusatstroms durch den Messkammerhalter. Superfusat dringt in die Rückseite des Blocks ein und fließt in die durch Pfeile angezeigte Richtung. Die vor- und nachgeschalteten Elektroden stellen die Feldstimulation her, um die Kontraktion einer montierten Trabekela in der Messkammer hervorriefen. Die blaue Schattierung zeigt die Bereiche an, in denen das Superfusat während eines Experiments fließt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62799/62799fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62799/62799fig04.jpg"> Abbildung 4:Vorderseite der Bilderfassungs- und Steuerungssoftware. (A) Benutzeroberfläche für Hellfeldbildgebung. (B) OCT Imaging-Benutzeroberfläche. (C) Benutzeroberfläche für hardwaregesteuerte Steuerung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62799/62799fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62799/62799fig05.jpg"> Abbildung 5: Trabecula-Dissektion und Montageprotokoll. (A) Langendorff-perfundiertes Rattenherz in der Dissektionskammer. (B ) Das gleiche Herz mit den Vorhöfen entfernt. Gestrichelte Linien zeigen die Exzisionsbahn an, um die Ventrikel zu öffnen. (C) Ein geöffnetes Herz, um das Innere beider Ventrikel freizulegen. Das gestrichelte Feld gibt den Bereich an, in dem Trabeculae typischerweise gefunden werden. (D) Ausgeschnittener rechtsventrikulärer Wandbereich (derselbe, der durch das gestrichelte Feld in C gekennzeichnet ist). Gestrichelte Linien heben drei Trabeculae hervor. (E) Eine Trabecula, ausgewählt aus den drei in D. (F) Die Trabecula aus Panel E mit entferntem Wandgewebe. (G) Die isolierte Trabecula am Ende einer 1-ml-Spritze. (H) Die Trabecula in der Montagekammer. (I) Die Trabecula ist zwischen zwei Platinhaken montiert. (J) Die trabecula, die zwischen Haken innerhalb der Messkammer montiert ist (Abbildung 3B). Der grüne Fleck ist ein Artefakt aus dem ersten dichroitischen Filter. (K) Sekundärwinkel der montierten Trabecula innerhalb der Messkammer. Der Abstand zwischen der Trabecula und dem Objektiv des Mikroskops beträgt ca. 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62799/62799fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62799/62799fig06.jpg"> Abbildung 6: Positionsabhängigkeit der Kraftmessung. Die kraft, die der Muskel aus jeder der bildgebenden Positionen (n = 7) erzeugt, überlagert. Die durchschnittliche Wirkkraftproduktion betrug 0,527 mN ± 0,003 mN, die Zeit bis 50 % Kontraktion 77,1 ms ± 0,3 ms und die Zeit bis 50 % Entspannung 328,1 ms ± 0,9 ms (alle Daten werden als Mittelwert ± SE dargestellt). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62799/62799fig06large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62799/62799fig7v2.jpg"> Abbildung 7:OCT-Bildgebungsanalyse. (A) Beispiel für weKA-Segmentierung. Der segmentierte Querschnitt des Muskels wird rot hervorgehoben, der Hintergrund grün hervorgehoben. (B) Bessere Ansicht der C-Scan-Rohdaten einer Trabecula. Die helle, abgewinkelte Linie zum oberen Bildanhang ist die Reflexion der Messkammerwand. (C) Seitenansicht der C-Scan-Rohdaten einer Trabecula. (D) Obere Ansicht der segmentierten OCT-Daten. (E) Seitenansicht der segmentierten OCT-Daten. (F) Die Querschnittsfläche entlang der Länge der Trabecula(x-Achse)durch die Zeit (y-Achse). Die durchschnittliche Querschnittsfläche entlang der Muskellänge betrug 0,0326 mm2 ± 0,0005 mm2 (mittlere ± S.E.) (G) Ein Netz der Trabecula. Das Netz wurde ungefähr mit dem Querschnittsflächendiagramm von Panel F <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62799/62799fig7v2lage.jpg" target="_blank">ausgerichtet.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62799/62799fig08.jpg"> Abbildung 8: Analyse der Hellfeld- und Fluoreszenzbildgebung. (A) Zusammengefügtes Bild (sieben Bildfenster) der Trabecula. (B) Ca2+ Transienten entlang der Länge der Trabekel. (C) Durchschnittliche x-Verschiebungaus jedem Imaging-Fenster. Eine positive Verschiebung stellt eine Bewegung nach rechts und eine negative nach links dar. (D) Durchschnittliche Sarkomerlängen aus jedem Bildfenster, das den erforderlichen Bildkontrast aufmittelte. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62799/62799fig08large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Tabelle 1: Lösungstabelle <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62799/Tables_of_solutions.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.</a>

Dieses Protokoll präsentiert eine Sammlung von Sarkomer-, Kalzium- und makroskopischen geometrischen Daten aus einer aktiv kontrahierenden Herztrabekula ex vivo. Diese simultanen Messungen werden durch die Integration von drei Bildgebungsmodalitäten ermöglicht.

Simultane Hellfeld-, Fluoreszenz- und optische Kohärenztomographische Bildgebung kontrahierender Herztrabekel Ex Vivo

In cardiac muscle, intracellular Ca2+ transients activate contractile myofilaments, causing contraction, macroscopic shortening, and ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Integration von drei bildgebungstechnischen Systemen in einem einzigen Gerät zu demonstrieren, was eine gleichzeitige Messung der mechanischen Funktion, der Ionendynamik und der geometrischen Veränderung des kontraktionierenden Herzgewebes ermöglicht. Insbesondere messen wir die Kraftproduktion des Gewebes, Kalziumtransienten, lokale Verschiebungen und Formveränderungen. Die Kombination dieser Bildgebungsmodalitäten kann helfen, Schlüsselfragen bei Herzerkrankungen zu beantworten, mit großen Auswirkungen auf die Entwicklung wirksamer Behandlungsstrategien.Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie es uns ermöglicht, die Heterogenität der Muskelaktivität zu untersuchen. Das in diesem Protokoll verwendete Gerät enthält drei Bildgebungssysteme, die in der Lage sind, dieselbe Probe abbilden, ein Hellfeldmikroskop, ein Fluoreszenzmikroskop und einen optischen Kohärenztomographen. Eine Reihe von dichroitischen Spiegeln wird verwendet, um die Fluoreszenzemission und das Hellfeldtransmissionsbild zu trennen.Grundlegende Merkmale dieses Gerätes sind zwei unabhängig voneinander betätigte Montagehaken, eine Messkammer mit drei optisch klaren Achsen und eine externe Triggerleitung, die die Hellfeld- und OCT-Kameras mit einem Stimulator synchronisiert. In diesem Video zeigen wir, wie man Herztrabekela isoliert, vorbereitet und abbilden kann und präsentieren einige repräsentative Ergebnisse. Nachdem Sie ein Herz von einer betäubten Ratte entfernt haben, übertragen Sie es in die Sezierkammer.Ziehen Sie die Aorta mit zwei gekrümmten Zzetten über die Perfusionskanüle. Halten Sie die Aorta mit einer Zinnen an Ort und Stelle. Öffnen Sie in der Zwischenzeit die Schlauchlinie, damit die Sezierlösung durch die Perfusionskanüle fließen kann.Sobald das koronare Gefäßsystem von Blut befreit ist und das Herz vollständig mit Dissektionslösung durchblutet ist, sichern Sie die Aorta mit einer Naht an Ort und Stelle. Positionieren Sie das Herz, indem Sie die Kanüle so drehen, dass die linke Koronararterie auf der oberen Oberfläche sichtbar ist. Stecken Sie die Spitze des Herzens an den Boden der Sezierkammer.Schneiden Sie beide Atrien ab. Schneiden Sie entlang der rechten Seite des Septums bis zur Spitze des Herzens. Stecken Sie den geöffneten linken Ventrikel an die Basis der Sezierkammer.Schneiden Sie dann entlang der linken Seite des Septums, öffnen Sie den rechten Ventrikel und stecken Sie ihn auch an die Basis der Sezierkammer. Identifizieren Sie eine frei laufende Trabecula im rechten Ventrikel. Schneiden Sie mit der Federschere und einer Zwiege das Wandgewebe, das die Trabecula umgibt.Dann schneiden Sie das Wandgewebe in zwei Hälften, orthogonal zur Richtung der Trabecula. Schneiden Sie das Wandgewebe so lange ab, bis seine Abmessung für die verwendete Montagekonfiguration geeignet ist. Lassen Sie die herausgeschnittene Trabecula in der Sezierkammer.Spülen Sie heißes Wasser, destilliertes Wasser und dann superfusaten Sie die Lösung durch die Messkammer. Schalten Sie die Lichtquelle des Hellfeldmikroskops ein und drücken Sie F1, um die Aufnahme zu aktivieren. Passen Sie den nachgeschalteten Haken manuell an, bis er im Hellfeldbild zentriert ist.Klicken Sie auf Null nachgeschaltete Achse und dann auf nachgeschaltete Deaktivierung, um den Motor zu aktivieren. Bewegen Sie den nachgeschalteten Sollwertschieberegler, bis das Ende des Hooks mit dem Rand des interessierenden Standardbereichs ausgerichtet ist. Setzen Sie die nachgeschaltete Achse wieder auf Null, und bewegen Sie dann den Schieberegler für den nachgeschalteten Sollwert auf 1.000.Wiederholen Sie den Vorgang mit dem Upstream-Hook, bewegen Sie jedoch nicht den Upstream-Sollwert-Schieberegler, nachdem Sie die Upstream-Achse erneut auf Null gesetzt haben. Klicken Sie auf Zum Einbinden verschieben. Starten Sie das Fluoreszenzbeleuchtungssystem, indem Sie den Lampenschalter umschalten, bevor Sie die Controller-Subsysteme schnell einschalten, indem Sie den Hauptschalter umschalten.Schalten Sie den Betriebsmodus auf Turbo-Blanking um, indem Sie die Modustaste auf der Vorderseite drücken, gefolgt von zwei und dann einer. Drücken Sie die Online-Taste, um die externe Steuerung zu aktivieren. Superfusat-Strömung durch die Messkammer pausieren.Füllen Sie die Montagekammer mit Dissektionslösung. Transportieren Sie die Trabecula mit einer Ein-Milliliter-Spritze von der Sezierkammer in die Montagekammer. Lassen Sie die Trabecula über die Schwerkraft in die Montagekammer absteigen.Senken Sie den Flüssigkeitsstand in der Montagekammer, so dass er mit dem Mittelteil der Haken gleich ist. Stellen Sie den Abstand zwischen den Haken so ein, dass er die schlaffe Länge der Trabecula widerspiegelt, indem Sie den nachgeschalteten Sollwertschieberegler bewegen. Greifen Sie mit einem Mikroskop zur Unterstützung der Visualisierung leicht eines der Endgewebestücke mit einer Handzette und montieren Sie es auf dem vorgelagerten Haken.Montieren Sie das andere Stück Endgewebe auf dem nachgeschalteten Haken. Nach der sicheren Montage bewegen Sie die Trabekela zurück in die Messkammer, indem Sie move to chamber drücken und den superfusate Fluss fortsetzen. Stellen Sie die Stimulusfrequenz auf eins, die Stimulusdauer auf 10 und die Stimulusspannung auf 10 ein.Beginnen Sie die Stimulation, indem Sie den Stimulus aufdrücken. Schalten Sie das Hellfeldbeleuchtungssystem ein. Drücken Sie F1, und wählen Sie einen interessanten Bereich aus, der einen durchgestreiften Bereich der Benutzeroberfläche umschließt.Klicken Sie auf Sarkomerlänge berechnen, um die durchschnittliche Sarkomerlänge im hervorgehobenen Bereich zu berechnen. Erhöhen Sie die Muskellänge, bis die durchschnittliche Sarkomerlänge etwa 2,32 Mikrometer beträgt. Bewegen Sie den Muskel, indem Sie den mittleren Sollwertschieberegler in der Mitte und auf der Trennsteuerungsregisterkarte so einstellen, dass der Rand des nachgeschalteten Hakens nur im Hellfeldbild sichtbar ist.Sammeln Sie die Fluoreszenzinformationen für 10 Zuckungen. Erhöhen Sie den mittleren Sollwert um 200 und sammeln Sie weitere 10 Zuckungen an Fluoreszenzinformationen. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis das Hellfeldbild den Upstream-Hook enthält.Sammeln Sie die Fluoreszenzinformationen des letzten Fensters. Bringen Sie die Trabecula an eine zentrale Position zurück, indem Sie den mittleren Sollwert auf Null setzen. Reduzieren Sie die Reizfrequenz auf 0,2 Hertz und wechseln Sie von der K-H-Superfusat- zur Fura-2-Ladelösung.Messen Sie das Fluoreszenzsignal alle 10 Minuten. Visualisieren Sie das Signal auf der Registerkarte PMT-Signal. Nachdem sich das 360-Nanometer-Signal um den Faktor 10 erhöht hat, geben Sie die Reizfrequenz auf ein Hertz zurück und schalten Sie wieder auf die K-H-Superfusat-Lösung um.Überprüfen Sie die Verhältnismessung alle 10 Minuten, bis sich das Signal stabilisiert, und an diesem Punkt kann die Datenerfassung beginnen. Stellen Sie den Muskel an die Position zurück, an der der Rand des nachgeschalteten Hakens nur im Hellfeldbild vorhanden ist. Erfassen Sie Fluoreszenzinformationen, indem Sie auf Fluoreszenzquelle aktivieren klicken.Starten Sie das Streaming von Hardwaredaten. Stellen Sie auf der Benutzeroberfläche für die Hellfeldbildgebung den Aufnahmemodus auf externen Auslöser ein, erhöhen Sie die Bildrate auf 100 Hertz und legen Sie die Anzahl der aufzunehmenden Bilder auf 100 fest. Drücken Sie Str/Gedrückt-Taste-Umschalt-S, gefolgt von F1, um die Hellfeld-Bilddaten für dieses Fenster aufzuzeichnen.Erhöhen Sie den mittleren Sollwert um 200 und wiederholen Sie den Hellfeldaufnahmevorgang. Fahren Sie mit dem Scanprotokoll fort, bis die Bilddaten für das letzte Fenster gesammelt wurden. Bringen Sie die Trabecula an eine zentrale Position zurück, indem Sie den mittleren Sollwert auf Null setzen.Schalten Sie die OCT-Beleuchtungsquelle ein, indem Sie die Haupttaste drehen, den Netzschalter drücken und anschließend die SLDs-Taste drücken. Decken Sie den Galvanometerkopf ab und klicken Sie auf Hintergrund abrufen, um das Hintergrundinterferenzmuster zu messen und von der Messung zu subtrahieren. Stellen Sie den Bildaufnahmemodus auf Live-Ansicht ein.Zentrieren Sie die Trabecula in den X- und Y-Achsen, indem Sie die X- und Y-Offsetwerte anpassen. Scannen Sie bei zentriertem Trabecula entlang der y-Achse, indem Sie die Y-Position anpassen, um die Positionen zu finden, die den vor- und nachgelagerten Haken entsprechen. Notieren Sie sich diese Positionen nach unten.Setzen Sie den Bereich Y auf die absolute Differenz zwischen diesen Werten geteilt durch 10. Stellen Sie den Bildaufnahmemodus auf Stimulus ausgelöst ein, bereichen Sie X bis 100 und klicken Sie auf die Schaltfläche Aktive Parameter festlegen. Klicken Sie auf Daten streamen und dann erfassen.Um die regionalen Kalzium- und Hellfeldinformationen über die gesamte Länge der hier vorgestellten Trabecula zu erfassen, wurden sieben Muskelpositionen benötigt. Diese Zahl der durchschnittlichen Kraft aus jeder der überlagerten Positionen deutet darauf hin, dass die Zuckungskraft von dieser Bewegung ungestört war, was zeigt, dass es keine Positionsabhängigkeit des Kraftakts gab. Diese Scans, die mittels optischer Kohärenztomographie mit einer Rate von 100 Hertz gesammelt wurden, wurden mit dem ImageJ-Plugin Weka segmentiert.Jeder Querschnitt erscheint aufgrund der Differenz zwischen der seitlichen und tiefen Auflösung verzerrt. Dies wurde korrigiert, indem jede Achse unabhängig voneinander mit ihrer jeweiligen Auflösung skaliert wurde. Nach der Skalierung des rohen C-Scans der Trabecula ist der Muskel ungefähr zylindrisch.Die Reflexion der Messkammerwand kann sich manchmal mit den Muskeldaten überschneiden, aber die Segmentierungssoftware kann darauf trainiert werden, dies zu berücksichtigen. Einmal segmentiert, kann die Querschnittsfläche entlang der Länge des Muskels während des gesamten Zuckens berechnet werden. Beachten Sie, dass diese spezielle Trabecula einen kleinen Zweig hat.Die Bewegung des Astes ist ungefähr auf halbem Weg entlang der Trabecula offensichtlich. Schließlich können die segmentierten Bilder in Netze umgewandelt werden, um die Konstruktion geometrischer Modelle zu unterstützen. Bilddaten, die an jeder der sieben Positionen mit einer Rate von 100 Bildern pro Sekunde erfasst wurden, wurden zu einem einzigen vollständigen Bild der Trabecula zusammengefügt.Das Verhältnis der ausgelassenen Fluoreszenz, die mit dem 340- und 380-Nanometer-Anregungslicht assoziiert ist, korreliert mit dem intrazellulären Kalzium, nachdem die Trabecula mit Fura-2 beladen wurde. Der Durchschnitt von 10 intrazellulären Kalziumtransienten aus jedem Fenster ist auf den Bereich ausgerichtet, in dem sie abgebildet wurden. Während der Höhepunkt der Transienten für diese Trabekela einigermaßen konsistent erscheint, reduzierte sich das diastolische Kalzium entlang seiner Länge.In ähnlicher Weise weisen die Ergebnisse der Verschiebungsverfolgung und der Sarkomerlängenberechnungen auch auf das Vorhandensein regionaler Variabilität hin. Die verwendete markerlose Tracking-Technik ist in der Lage, die Verschiebung jedes Pixels zu berechnen. Die Eignung der Sarkomerlängenschätzungen wurde anhand der Breite und Amplitude der Gaußschen Anpassung an das FFT-Signal getestet.Diese Bedingungen waren im Muskelbereich zwischen null und 500 Mikrometern nicht erfüllt, so dass dort keine Sarkomerlängeninformationen berechnet werden konnten. Angesichts der damit verbundenen Verschiebungen ist es wahrscheinlich, dass sich die Sarkomere in dieser Region während der kontraktilen Phase des Zuckens verlängert haben. Nachdem Sie sich dieses Video angeschaut haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Herztrabekeln isolieren und zuverlässig auf die multimodale Bildgebung vorbereiten können.Dieser Prozess schafft einen Weg für die Sammlung eines Datensatzes, der für die Konstruktion physiologisch informierter Finite-Elemente-Modelle der Herzgewebekontraktion erforderlich ist.

simultaneous-brightfield-fluorescence-optical-coherence-tomographic

Research

Forschung

JoVE Journal

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