Automatisierte mikrobielle Kultivierung und adaptive Evolution mit mikrobiellem Mikrotröpfchenkultursystem (MMC)

Diese Methode kann helfen, die Probleme mit den herkömmlichen mikrobiellen Kultivierungsmethoden zu lösen. Es bietet eine kostengünstige, betriebsfreundliche und ergebnissichere experimentelle Plattform für die automatisierte mikrobielle Kultivierung und adaptive Evolution. Diese Technologie automatisiert den Betrieb und reduziert den Arbeitsaufwand.

Und gleichzeitig hat es eine gute Kulturleistung mit zuverlässigen Ergebnissen und einfachen Operationen. Die Technologie wird hauptsächlich in den mikrobiologischen Forschungsbereichen eingesetzt, wie z.B. der Messung von Wachstumskurven, der adaptiven Laborevolution und einer mehrstufigen Einzelfaktoranalyse. Beginnen Sie die Vorbereitungen des Experiments, indem Sie die Spritzennadel mit einem Innendurchmesser von 0,41 Millimetern und einem Außendurchmesser von 0,71 Millimetern mit einem Schnellverbinder A und einer Reagenzflasche verbinden.

Dann autoklavieren Sie alle Geräte bei 121 Grad Celsius für 15 Minuten. Um den Mikrofluidik-Chip zu installieren, öffnen Sie die Tür der Operationskammer und heben Sie die Glasfasersonde an. Nachdem Sie die elektrischen Feldlöcher mit den Nadeln ausgerichtet haben, legen Sie den Chip vorsichtig auf den Chipsockel, stecken Sie dann die beiden Positionierungssäulen in die Positionierungslöcher und legen Sie die Glasfasersonde ab.

Als nächstes verbinden Sie den Schnellverbinder A auf dem Chip mit dem entsprechenden Port des mikrobiellen Mikrotropfenkultursystems oder MMC gemäß der im Manuskript beschriebenen Positionsnummer. Wenn Sie fertig sind, schließen Sie die Tür der Operationskammer. Verdünnen Sie die kultivierte Escherichia coli MG1655 Suspension mit dem Medium zu einem OD600 von 0,05 bis 0,1, um 10 Milliliter anfängliche Bakterienlösung zu erhalten.

Um die MMC zu initialisieren, klicken Sie auf die Registerkarte Initialisierung. Wenn die Initialisierungsschnittstelle angezeigt wird, stellen Sie die Kultivierungstemperatur auf 37 Grad Celsius und den photoelektrischen Signalwert auf 0,6 ein. Die Initialisierung dauert etwa 20 Minuten.

Legen Sie später eine sterilisierte Reagenzflasche auf die saubere Bank und ziehen Sie die Kappe fest. Verwenden Sie eine sterile 10-Milliliter-Spritze, um drei bis fünf Milliliter MMC-Öl von der Spritzennadel in den Seitenschlauch in die Reagenzflasche zu injizieren. Kippen und drehen Sie dann die Reagenzflasche langsam, damit das Öl die Innenwand vollständig infiltriert.

Nachdem Sie fünf Milliliter einer anfänglichen Bakterienlösung in die Flasche injiziert haben, füllen Sie die Reagenzflasche, indem Sie fünf bis sieben Milliliter des MMC-Öls injizieren. Ziehen Sie den unabhängigen Schnellverbinder A der Reagenzflasche heraus und setzen Sie den Schnellverbinder A in den Schnellverbinder B der Flasche ein, um den Probeninjektionsvorgang abzuschließen. Sobald Sie fertig sind, öffnen Sie die Tür der Operationskammer, um die Reagenzflasche in das Metallbad zu legen.

Ziehen Sie den C2-Stecker des Chips und den Schnellverbinder A der Reagenzflasche heraus. Schließen Sie den Seitenrohranschluss der Reagenzflasche an den C2-Stecker und den oberen Rohranschluss an den O2-Anschluss an. Schließen Sie dann die Tür der Operationskammer.

Um die Funktion der Wachstumskurvenmessung auszuwählen, klicken Sie in der Parametereinstellungsschnittstelle auf Wachstumskurve und geben Sie die Zahl als 15 ein. Schalten Sie dann den OD-Detektionsschalter ein und stellen Sie die Wellenlänge auf 600 Nanometer ein. Klicken Sie auf die Registerkarte Start, um die Dropletgenerierung zu starten.

Der Vorgang dauert 15 Minuten. Wenn auf der Hauptschnittstelle ein Popup-Fenster angezeigt wird, das zu einer Meldung auffordert, öffnen Sie die Tür der Operationskammer, um die Reagenzflasche herauszunehmen und die C2- und O2-Anschlüsse anzuschließen. Nachdem Sie die Tür geschlossen haben, klicken Sie im Popup-Fenster auf die Schaltfläche OK, um die Tröpfchen automatisch zu kultivieren und die OD-Werte zu erkennen.

Wenn die Wachstumskurve die stationäre Phase erreicht, klicken Sie auf die Schaltfläche Datenexport, um die OD-Daten zu exportieren. Wählen Sie den Datenspeicherpfad aus und exportieren Sie den während des Anbauzeitraums aufgezeichneten OD-Wert im CVS-Format Um die Wachstumskurve darzustellen, verwenden Sie Mapping-Software wie Excel und Origin 9.0. Injizieren Sie die erforderlichen Mengen der anfänglichen Bakterienlösung, des frischen Mediums und des MMC-Öls in die separaten sterilisierten Reagenzflaschen für die anfängliche Bakterienlösung im Frischmedium, wie zuvor erläutert.

Um die Funktion der adaptiven Evolution auszuwählen, klicken Sie in der Software auf ALE. Schalten Sie in der Parametereinstellungsschnittstelle den OD-Erkennungsschalter ein, stellen Sie dann alle im Manuskript beschriebenen Parameter ein und klicken Sie auf die Registerkarte Start, um die Dropletgenerierung zu starten. Der Vorgang dauert etwa 25 Minuten.

Beobachten Sie während jeder Teilkultivierungsperiode, ob die maximalen OD-Werte der Tröpfchen signifikant gestiegen sind. Wenn die Erhöhung auftritt und die Experimentanforderungen erfüllt, klicken Sie auf die Schaltfläche Datenexport, um die OD-Daten zu exportieren. Um die Zieltröpfchen aus der MMC zu extrahieren, klicken Sie auf die Registerkarte Screening, um die Funktion der Tröpfchenextraktion auszuwählen.

Wählen Sie dann die Option Sammeln und klicken Sie auf die Anzahl der Zieltröpfchen. Wenn Sie fertig sind, klicken Sie auf OK. Warten Sie, bis das Popup-Fenster Sie zu einer Meldung auffordert. Stecken Sie dann den CF-Schnellverbinder zur Abholung in das Mikrozentrifugenröhrchen und klicken Sie auf OK. Nach ein bis zwei Minuten, wenn die Softwareschnittstelle ein neues Fenster mit der Meldung öffnet, setzen Sie den CF-Schnellverbinder wieder ein und klicken Sie auf OK, damit MMC weiter ausgeführt wird.

Wenn das nächste Zieltröpfchen die Tröpfchenerkennungsstelle erreicht, sammeln Sie es wie zuvor angegeben. Verwenden Sie eine 2,5-Mikroliter-Pipette, um das Tröpfchen herauszunehmen und auf eine 90 Millimeter große feste Platte zu legen, gefolgt von der gleichmäßigen Verteilung des Tropfens mit einem dreieckigen Glasstab mit einer Seitenlänge von drei Zentimetern, dann kultivieren Sie den Tropfen in einem 37 Grad Celsius Konstanttemperatur-Inkubator für 72 Stunden. Später pflücken Sie drei bis fünf unabhängige Bakterienkolonien, um jede Kolonie separat in einem 50-Milliliter-Schüttelkolben mit 10 Millilitern frischem Medium in einem Schüttelinkubator bei 200 Umdrehungen pro Minute und 37 Grad Celsius für 48 bis 72 Stunden zu kultivieren.

Befolgen Sie nach der Inkubation die entsprechenden Standardvorschriften, um die kultivierte Bakterienlösung im Glycerinröhrchen zu lagern. Die repräsentative Analyse zeigt die Wachstumskurven von 50 Tröpfchen im gesamten adaptiven Evolutionsprozess. Es wurde beobachtet, dass der methanolessentielle Escherichia coli-Stamm oder MeSV2.2 ein anfänglich langsames Wachstum aufwies, gefolgt von einem schnellen Wachstum.

Die Wachstumskurve von Tröpfchen sechs im gesamten adaptiven Evolutionsprozess wurde separat dargestellt. Der maximale OD600-Wert in der ersten Generation betrug 0,37, was in der letzten Subkultivierungsperiode auf 0,58 anstieg, was darauf hindeutet, dass die Sorte im Tropfen sechs eine offensichtliche adaptive Entwicklung erreicht hat. Weiterhin wurden die Wachstumskurven der Tröpfchensechsersorte und der Ausgangssorte verglichen.

Der Tropfensechserstamm zeigte in der stationären Phase eine höhere maximale spezifische Wachstumsrate und Zellkonzentration als der Anfangsstamm. Das Wichtigste ist, sicherzustellen, dass die Verbindung des Instrumentenchips und der Reagenzflasche korrekt ist, dh die Tröpfchen für den normalen Ablauf der Operationen. Diese Methode bietet Forschern eine neue Idee für die Kultivierung von Mikroorganismen und bietet auch eine effiziente und kostengünstige Plattform für die adaptive Evolution von Stämmen.