Konstruktion von Modelllipidmembranen mit G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs)

Dieses Protokoll nutzt die Agaroseschwellung als eine leistungsfähige und generalisierbare Technik zum Einbau von integralen Membranproteinen (IMPs) in riesige unilamellare Lipidvesikel (GUVs), wie hier für die Rekonstitution des menschlichen 1A-Serotoninrezeptorproteins (_5-HT1AR), einer der Klassen pharmakologisch wichtiger G-Protein-gekoppelter Rezeptoren, beschrieben.

Die Untersuchung integraler Membranproteine in ihrer nativen Umgebung war aufgrund der Komplexität der Plasmamembran eine Herausforderung. Riesige einlamellare Lipidvesikel oder GUVs sind eine der bekanntesten Plattformen zur Untersuchung der Eigenschaften von Biomembranen und können so konstruiert werden, dass sie verschiedene physiologische Bedingungen nachahmen. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Herstellung von proteinintegrierten GUVs auf der Grundlage einer spontanen Inkorporation nach der Hydrogelquellung. Traditionelle Methoden zur Herstellung von GUVs sind für den Einbau von integralem Membranprotein nicht verallgemeinerbar. Diese Methoden sind oft ausbeuterisch, methodisch komplex und ad hoc, nicht anwendbar auf breite Klassen von Proteinen. Auf der anderen Seite stellt dieses Protokoll eine flexible, robuste und einfache Methode dar, um funktionelle integrale Membranproteine in GUVs zu integrieren.Wir erreichten dies, indem wir ein Hydrogel-Gerüst vorbereiteten, das das Protein enthielt, und eine dünne Lipidschicht darauf ablagerten. In dem hier vorgestellten Beispiel haben wir den G-Protein-gekoppelten Rezeptor oder GPCR in die GUVs eingebaut.Nach der Rehydratation des gesamten Systems knospen GUVs von der Oberfläche des Hydrogels ab, wobei die Membran richtig ausgerichtete GPCRs enthält.Lassen Sie alle Reagenzien auf Raumtemperatur kommen. Reinigen Sie während dieser Zeit die Abdeckungsrutschen, indem Sie sie in Methanol legen und 30 Minuten bei 40 Minuten beschallen