Zweischichtige Membran-Sandwich-Methode für Laodelphax striatellus Speichelsammlung

Künstliche Fütterung und Speichelsammlung bieten eine direkte Methode zum Nachweis von Effektoren im Speichel von Insekten. Dies wurde jedoch bisher nicht ausführlich beschrieben. Dieses Protokoll ist wirksam für die Speichelsammlung von saprophytischen Insekten.

Darüber hinaus ist es eine einfache Technik, da wir Medium, das nur Saccharose enthält, als künstliche Diät verwenden. Der Speichel saprophytischer Insekten kann auf das Immunsystem des Wirts einwirken, um das Fressverhalten zu fördern und Krankheitserreger zu übertragen. Dieses Medikament, das für das Insektenverhalten und die Insektenknochenpfadforschung verwendet werden kann.

Dies ist eine einfache Methode. Dies deutet jedoch auf die Montage einer sauberen experimentellen Umgebung hin, da Speichel für weitere Forschungen gesammelt wird. Beginnen Sie mit der Zubereitung einer 5% igen Saccharoselösung für die künstliche Ernährung und filtern Sie die Lösung durch einen 0,22-Mikron-Filter, um bakterielle Verunreinigungen und Verunreinigungen zu entfernen.

Verhungern Sie etwa 200 kleine braune Pflanzentrichterlarven für drei bis fünf Stunden, bevor Sie sie in eine Futterkammer einführen. Als nächstes, um die Glaszylinder als Zufuhrkammern vorzubereiten, bedecken Sie ein offenes Ende der Kammer mit einer Paraffinmembran, bevor Sie die experimentellen Insekten einführen, dann übertragen Sie die Insekten in den Glaszylinder und bedecken Sie das andere Ende der Kammer mit gestreckter Paraffinmembran. Fügen Sie 200 Mikroliter künstliche Diät auf die Membran hinzu und bedecken Sie die Flüssigkeit mit einer weiteren Schicht gestreckter Paraffinmembran.

Zum Schluss decken Sie die Kammer mit Aluminiumfolie ab und lassen Sie das Ende mit dem künstlichen Diätgerät dem Licht ausgesetzt. Sammeln Sie nach 24 Stunden den SBPH-Speichel, indem Sie den Zylinder bei vier Grad Celsius abkühlen, um die Insekten zu immobilisieren, dann den äußeren Film freilegen und die künstliche Diät in 1,5 Milliliter sterile röhrchen mit einer sterilen Pipette sammeln. Halten Sie den gesammelten Speichel bis zur Analyse bei minus 80 Grad Celsius.

Als nächstes spülen Sie die innere Membran dreimal mit 50 Mikrolitern frischer künstlicher Diät durch sanftes Pipettieren ab und sammeln Sie die künstliche Waschdiät in sterile 1,5 Milliliter Röhrchen. Nach den drei Spülungen frische künstliche Diät auf die innere Membran geben und eine frisch gedehnte Paraffinmembran darauf legen. Filtern Sie schließlich die gesammelten Proben durch eine 0,22-Mikron-Filtereinheit, um Mikroben und andere Verunreinigungen zu entfernen.

Übertragen Sie die kollektiven Speichelproben in einem 500 Mikroliter, 10 Kilodalton Zentrifugalfilter. Zentrifugieren Sie die Probe. Sammeln Sie den Überstand und erhöhen Sie das Endvolumen auf 100 Mikroliter.

Um die Konzentration des gesammelten Speichels zu messen, schalten Sie das UV-sichtbare Spektralphotometer ein und waschen Sie die Sockel dreimal mit doppelt destilliertem Wasser. Wählen Sie die Optionen auf dem Bildschirm in der folgenden Reihenfolge aus: Proteine, Protein A280. Wählen Sie typ und eine Absorptionseinheit, die einem Milligramm pro Milliliter entspricht.

Aktivieren Sie dann das Kontrollkästchen für die Baseline-Korrektur, 340 Nanometer. Als nächstes laden Sie zwei Mikroliter 5% iger Saccharose-wässriger Lösung als Rohling und berühren Sie dann Blank am unteren Bildschirmrand. Laden Sie schließlich nach dem Setzen der Standards zwei Mikroliter des gesammelten Speichels und zeichnen Sie die Proteinkonzentration auf.

Bei der Fütterung von 5% Saccharose überlebten mehr als 80% der SBPH die ersten vier Tage. Ab dem fünften Tag stieg die Sterblichkeit jedoch schnell auf 40% und am siebten Tag überlebte weniger als die Hälfte der SBPH. Eine SDS-Seitenanalyse zeigte, dass die konzentrierten Speichelproben aus RSV-infiziertem SBPH-Speichel viel mehr Proteine enthielten als die 5% Saccharose-Negativkontrolle.

In einer Western-Blot-Analyse zum Nachweis des RSV-Kapsidproteins handelt es sich um ein nicht infiziertes und viruliferes Insekt. Das RSV-Kapsidprotein wurde erfolgreich in der viruliferen Probe nachgewiesen, ein Antikörper, der gegen das LssgMP-Genprodukt entwickelt wurde, wies ein 78 Kilodalton-Protein in nicht infizierten und viruliferen Proben nach und zeigte, dass LssgMP ein Speichelprotein ist. Eine QRT-PCR-Analyse der LssgMP-Transkriptspiegel in verschiedenen Geweben zeigte, dass die Lssg-Transkriptspiegel in der Speicheldrüse 20-mal höher waren als im ganzen Körper und Darm, was die spezifische Expression von LssgMP in der Speicheldrüse bestätigt.

Das Aushungern der experimentellen Insekten vor dem Einbringen in die Kammer ist notwendig, um die Effizienz unserer Speichelsammlung zu gewährleisten. Außerdem sollte alle 24 Stunden ein künstliches Medium gesammelt und ausgetauscht werden, um die mikrobielle Kontamination in der gesammelten Probe zu reduzieren. Diese Technik bietet eine direkte Methode, um die Funktion des Speichels bei der Übertragung von Krankheitserregern zu untersuchen.

Darüber hinaus kann es helfen, die Interaktion zwischen Insektenpathogenen zu untersuchen.