Biolumineszente Optogenetik 2.0: Nutzung der Biolumineszenz zur Aktivierung photosensorischer Proteine in vitro und in vivo

1(elektronische Töne)Biolumineszierende Optogenetik ist eine Plattformtechnologie, bei der genetisch kodierte Lichtquellen biologische Funktionen und Netzwerke innerhalb und zwischen Zellen visualisieren und steuern können. Biolumineszenz erreicht jeden lichtempfindlichen Bereich, der in der Zielzellpopulation exprimiert wird, ohne Gewebe- und Zellschäden durch Faseroptik und längere physikalische Lichtexposition. Beginnen Sie zunächst mit der Vorbereitung des Luciferin-Vorrats, indem Sie fünf Milligramm lyophilisiertes CTZ in 250 Mikrolitern des jeweiligen Lösungsmittels auflösen.

Stellen Sie sicher, dass CTZ durch Pipettieren entlang der Wände aufgelöst wird. Während Sie die Durchstechflasche vor direktem Licht schützen, bereiten Sie 50 Mikroliter Aliquots in 0,5 Milliliter schwarzen Mikrozentrifugenröhrchen vor und lagern Sie die Aliquots bei minus 80 Grad Celsius für die zukünftige Verwendung. Führen Sie alle weiteren Manipulationen in einem lichtdichten Raum in einer von rotem Licht beleuchteten Laminar-Flow-Haube durch.

Um eine einzelne Biolumineszenz-Lichtstimulation durchzuführen, bereiten Sie eine Arbeitslösung von Luciferin in einem Zellkulturmedium vor, kurz bevor Sie den Zellen in einer Endkonzentration von 100 Mikromolaren hinzugefügt werden. Geben Sie Luciferin-haltiges Medium zu den Zellen und inkubieren Sie für die gewünschte Dauer der Lichtstimulation. Schalten Sie das rote Licht aus.

Nachdem Sie einige Sekunden gewartet haben, bis sich die Augen an die völlige Dunkelheit gewöhnt haben, überwachen Sie die Lichtemission durch das Auge. Dokumentieren Sie die Lichtemission durch ein Foto. Beenden Sie die Lichtstimulation, indem Sie das Luciferin-haltige Medium durch das Kulturmedium ersetzen, und waschen Sie dann die Zellen ein- oder zweimal mit dem Kulturmedium, um das gesamte Luciferin je nach Experimentempfindlichkeit zu eliminieren.

Um Zellverlust zu vermeiden, beschichten Sie die Zellen auf PDL-beschichteten Schalen und inkubieren Sie die Zellen. Um eine wiederholte Biolumineszenz-Lichtstimulation durchzuführen, richten Sie die Live-Cell-Bildgebungskammer ein, indem Sie mit einer Box und schwarzen Blättern ein lichtenges Fach um das Lebendzell-Bildgebungsmikroskop erstellen. Stellen Sie sicher, dass alle im Raum vorhandenen Lichtquellen abgedeckt sind.

Richten Sie das Perfusionssystem mit der gewünschten Lösung für die Aufnahme und den Kammerausgang ein, der zu einem Abfallbehälter führt. Abhängig von der Anzahl der wiederholten Stimulationen wird aliquot die vorbereitete Luciferin-Bildgebungslösung in die Mikrozentrifugenröhrchen gegeben. Legen Sie ein Deckglas mit transfizierten Zellen in die Kammer.

Während Sie die Pumpe am Laufen halten, entfernen Sie das Einlassrohr der Pumpe aus dem Ansaugbecherglas. Tauchen Sie das Einlassrohr schnell in Luciferin-Lösung ein und halten Sie die Übergangszeit kurz, um Lufthohlräume im Schlauch zu vermeiden. Sobald die Luciferin-Lösung aufgenommen wurde, legen Sie das Einlassrohr wieder in das Einlassbecherglas.

Wiederholen Sie das Entfernen und Eintauchen des Einlassrohrs in Luciferin so oft wie nötig in Abständen von mehreren Minuten bis Stunden, abhängig von dem physiologischen Muster, dem die Zellen ausgesetzt sein sollen. Halten Sie die Zellen dann in einer lichtgeschützten Umgebung für 16 bis 24 Stunden für die Transkription oder die Dauer, bis die Wirkung der Lichtstimulation beurteilt wird. Um die Biolumineszenzaktivierung in vivo durchzuführen, bereiten Sie Luciferin vor, indem Sie ein CTZ-Fläschchen von minus 80 Grad Celsius herausnehmen und es dann im lichtgeschützten Bereich auf Raumtemperatur erwärmen lassen.

Für jede Durchstechflasche mit 500 Mikrogramm CTZ 250 Mikroliter steriles Wasser mit einer Pipette hinzufügen und den Gummistopfen wieder auf die Durchstechflasche geben. Inkubieren Sie das rekonstituierte Glasfläschchen in einem bei 55 Grad Celsius temperierten Wasserbad für einige Minuten, um das Pulver vollständig aufzulösen. Übertragen Sie die Lösung in ein schwarzes Mikrozentrifugenröhrchen und spülen Sie die Wände ab, um alle CTZ zu erhalten.

Nachdem Sie die benötigte Lösungsmenge entfernt haben, lagern Sie die verbleibende Lösung bei vier Grad Celsius. Nach der Vorbereitung, Rekonstitution und Aliquotierung des Fahrzeugs auf ähnliche Weise ist die Biolumineszenzlichtstimulation vorzuformen, indem das Volumen von Luciferin oder Fahrzeug entfernt wird, das für die Größe des gewählten Tieres und der gewählten Anwendungsroute benötigt wird. Injizieren Sie dem Tier Luciferin oder das Fahrzeug wie vorgesehen.

Für die gewünschte Rekombinase-Aktivierung während eines bestimmten Verhaltensparadigmas injizieren Sie das Tier kurz vor dem Verhaltenstest. Für die phasische Transkription injizieren Sie das Tier wiederholt über Tage und sammeln Sie die Daten des biolumineszenzstimulierten Tieres wie vorgesehen. Das schnelle Licht- und aktivitätsregulierte Expressionssystem ermöglichte die Transkription des Reportergens mit erhöhten intrazellulären Calciumionen und Licht.

Die blaue LED führte zu einer robusten Reporterfluoreszenz und die FLuc-Expression wurde durch Lumineszenzmessungen nach Luciferin zusätzlich bestimmt. In einem In-vivo-Bildgebungssystem erhöhten sowohl LED als auch CTZ die FLuc-Expression robust, während das Vorhandensein der Transkriptionsfaktorkomponente allein zu einem erheblichen Hintergrundsignal führte, möglicherweise aufgrund einer spontanen Proteolyse. NanoLuc wurde zur optogenen Regulation durch die CRY/CIB-Dimerisierung und den lichtempfindlichen Transkriptionsfaktor EL222 eingesetzt.

Die Biolumineszenz, die durch die Zugabe von hCTZ zu HEK-293-Zellen und deren Entfernung nach 15 Minuten induziert wurde, war effizienter als 20 Minuten LED-Exposition für CRY/CIB und EL222. Es wurden keine signifikanten Unterschiede in der Transkriptionswirksamkeit zwischen den beiden Systemen beobachtet, wenn sie mit hCTZ kotransfiziert wurden, obwohl die Fusionsproteine von CRY/CIB effizienter als EL222 waren. CRY/CIB zeigte unabhängig von der hCTZ-Konzentration konstant höhere Hintergrundwerte im Vergleich zu EL222.

Die Biolumineszenz einer lichtempfindlichen gespaltenen Cre-Rekombinase basierend auf dem VVD LOV-Protein iCreV wurde getestet. Die Ergebnisse der CTZ-Anwendung zeigten, dass die CTZ-Präsenz den Ausdruck über den Hintergrund robust erhöhte und der LED-Anwendung ähnelt. Die Verwendung von Biolumineszenz zur Aktivierung nicht nur eisenbewegender Photorezeptoren, sondern aller photosensorischen Domänen fügt der Lichtstimulation eine weitere Dimension hinzu und erweitert die Manipulation von Zellfunktionen über zeitliche und räumliche Skalen hinweg.

Die biolumineszente Optogenetik wurde in Zellen und Modellorganismen angewendet. Diese Protokolle können angepasst werden, um eine breite Palette von gerichteten Hypothesen in vitro und in vivo zu testen.